الخلايا الجذعية داخل الوعاء اللمفي والتطعيم في الفئران

Summary

غالبا ما يفشل التطعيم الوقائية والعلاجية لتحفيز الاستجابات المناعية القوية بسبب الصرف الأسبوع من اللقاح إلى الغدد الليمفاوية وبالتالي إشراك الفقراء من الخلايا المناعية. عن طريق الحقن المباشر للقاح إلى الغدد الليمفاوية، ما يسمى الحقن داخل الوعاء اللمفي، نجاعة اللقاح يمكن تحسين بقوة ويمكن تقليل جرعات اللقاح.

Abstract

وعادة ما يتم حقن تحت الجلد أو في العضل لقاحات لتحفيز الاستجابات المناعية. نجاح هذا يتطلب كفاءة الصرف لقاح إلى الغدد الليمفاوية حيث الخلايا مستضد تقديم يمكن أن تتفاعل مع الخلايا الليمفاوية لتوليد الاستجابات المناعية أراد. قوة ونوع الاستجابات المناعية التي يسببها تعتمد أيضا على كثافة أو تردد من التفاعلات وكذلك المكروية، وخاصة محتوى السيتوكينات. كما سوى دقيقة واحدة جزء من اللقاحات حقن محيطيا تصل إلى الغدد الليمفاوية، وأجريت التطعيمات من الفئران والبشر عن طريق الحقن المباشر للقاح في الغدد الليمفاوية الأربية، أي حقن داخل الوعاء اللمفي. في الإنسان، ويسترشد الإجراء بواسطة الموجات فوق الصوتية. في الفئران، يتم إجراء الصغيرة (5-10 مم) شق في المنطقة الأربية تخدير الحيوانات، المترجمة العقدة الليمفاوية ويجمد مع ملقط، ويتم حقن حجم 10-20 ميكرولتر من اللقاح تحت المراقبة البصرية.يتم إغلاق شق مع غرزة واحدة باستخدام خيوط الجراحة. تم تلقيح الفئران مع الحمض النووي البلازميد، RNA، الببتيد، والبروتين، والجسيمات، والبكتيريا وكذلك المواد المساعدة، ولوحظ تحسن قوي من الاستجابات المناعية ضد كل نوع من اللقاحات. طريقة التطعيم داخل الوعاء اللمفي غير مناسبة وخاصة في الحالات التي تنتج التطعيم التقليدية كافية أو الحصانة حيث كمية اللقاح المتاحة محدودة.

Introduction

وعادة ما يتم حقن تحت الجلد أو في العضل لقاحات لتحفيز الاستجابات المناعية. نجاح هذا الإجراء يتطلب الصرف كفاءة اللقاح إلى الغدد الليمفاوية حيث الخلايا مستضد تقديم يمكن أن تتفاعل مع الخلايا الليمفاوية لتوليد T-B-والاستجابات الخلية. بالإضافة إلى ذلك، قوة ونوع الاستجابات المناعية التي يسببها تعتمد أيضا على كثافة أو تواتر هذه التفاعلات وكذلك المكروية نفسها، خصوصا محتوى السيتوكينات. كما سوى جزء صغير من لقاح يحقن الأنسجة الطرفية تصل إلى العقدة الليمفاوية، واللقاحات من الفئران والبشر عن طريق الحقن المباشر للقاح في الغدد الليمفاوية، ويتم إنشاؤها الاستجابات المناعية للموقع، وقد أجريت. في الإنسان، ويسترشد الإجراء بواسطة الموجات فوق الصوتية، وهو إجراء يستخدم أيضا لإدارة وكلاء التصوير لتصور وتشخيص في النظام اللمفاوي. في الفئران، وهذا الإجراء هو الغازية. هنا، وهو صغير (5-10 ملم) incisioن يتم في المنطقة الأربية الحيوانات تخدير ^1، المترجمة العقدة الليمفاوية ويجمد مع ملقط، ويتم حقن حجم 10-20 ميكرولتر من اللقاح تحت المراقبة البصرية، ويستخدم 10 ميكرولتر لحقن الفئران في الأول والشباب مع الغدد الليمفاوية صغيرة، في حين أن 20 ميكرولتر يمكن حقنها في الغدد الليمفاوية من الفئران الأكبر سنا أو تستعد بالفعل، والتي لديها الغدد الليمفاوية أكبر. شق يمكن أن تكون مغلقة مع غرزة واحدة باستخدام خيوط الجراحة. بواسطة هذه الطريقة، وتحصين الفئران مع البلازميد الحمض النووي ^2،3، رسول الحمض النووي الريبي ^{4، 1،3،5،6} الببتيد، البروتين ^7-10، الجسيمات ^{11، 12} البكتيريا وكذلك المواد المساعدة ^7،13، وتحسن قوي من المناعة وقد لوحظت استجابات ضد كل نوع من اللقاحات. طريقة التطعيم داخل الوعاء اللمفي غير مناسبة وخاصة في الحالات التي تنتج التطعيم التقليدية الحصانة غير كافية أو حيث كمية اللقاح المتاحة محدودة أو النسخةذ مكلفة. في الإنسان، وقد تم تطبيق الأسلوب داخل الوعاء اللمفي التحصين للمرضى الحساسية ^14،15 أو المرضى الذين يعانون من سرطان ^16-21. على الرغم من أن الفكرة الحالية هو أن الأسلوب داخل الوعاء اللمفي هو أكثر الغازية من الطرق الأخرى عن طريق الحقن مثل حقن العضلي وتحت الجلد، تصور الألم ليست أعلى من بعد ثقب الوريدي ^15. ومن المتوقع أن التطعيم داخل الوعاء اللمفي سوف تصبح بديلا أو مكملا لأساليب أخرى من اللقاحات الوقائية والعلاجية على وجه الخصوص. توضح هذه المقالة في التفاصيل كيف يتم تنفيذ الإجراء التطعيم داخل الوعاء اللمفي في الفئران. ، تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي وصفها الوكالة البيطرية كانتون زيورخ وتنفيذ المبادئ التوجيهية والتوجيهات وفقا لحماية الحيوانات المستخدمة لأغراض علمية الاتحادية السويسرية.

Protocol

1. تخدير الفئران

1. إعداد التخدير عن طريق خلط الكيتامين (مخدر فصامي) وزيلازين (مهدئ ومسكن) في مخزنة المالحة. تركيزات الكيتامين وزيلازين في الحل النهائي هي 12.5 و 2 ملغ / مل، على التوالي.
2. حقن التخدير إلى الفئران بالإعطاء البريتون باستخدام حقنة مع G إبرة 25-30. استخدام 0.1 ml/10 غرام من وزن الجسم.
3. تطبيق مرهم للعين للعيون الفئران من أجل منع جفاف التدريجي من القرنيات.
4. أؤكد أن الفأر هو تخدير بما فيه الكفاية من قبل معسر قدم لها أو أخمص القدمين مع ملقط. إذا لا يتفاعل مع الماوس ردود الفعل لقرصة، والمضي قدما لعملية جراحية. إذا يتفاعل الماوس إلى قرصة مع ردود الفعل أو تقلصات العضلات، والانتظار 1-2 دقائق ثم كرر الاختبار قرصة. إذا كان الماوس لا يزال يتفاعل، استبدال الماوس مع حيوان جديد وتكرار الإجراءات من الخطوة 1.2 وما بعده.

2. أنا الجراحيةncision في المنطقة الأربي للماوس

1. ضع الماوس على ظهرها.
2. تبلل المنطقة الأربية واحد مع تطهير الايثانول (70٪). لتوفير أفضل التطهير، قد يكون حلق المنطقة الأربية لإزالة الفراء تطهير مسبق مع الايثانول.
3. تأخذ الساق الخلفية وثني مفصل الورك لإنتاج ما يقرب من زاوية 90 درجة من مفصل الورك.
4. باستخدام ملقط microdissecting المنحني، واتخاذ الجلد الماوس في منطقة الأربية حيث مفصل الورك عازمة وسحب الجلد مبلل ارتفاعا طفيفا.
5. في حين الضغط على الجلد مع ملقط، وقطع شق صغير (<5 مم) من خلال الجلد باستخدام مقص جراحي.
6. وضع غيض من مقص مغلقة في شق وفتح مزيد من شق طريق فتح مقص أثناء الضغط عليه داخل شق. وسوف يسبب هذا الجلد المسيل للدموع، وينبغي أن إنتاج قطر من أقل من 10 ملم. ملاحظة: مصدر ضوء بارد مع ضوء مرونة أدلة يمكن استخدامها لتحسين الرؤية. في كبار السنالفئران، وخاصة الذكور، وتحديد العقدة الليمفاوية قد يكون من الصعب بسبب الكثير الأنسجة الدهنية في المنطقة الاربية.

3. حقن داخل الوعاء اللمفي

1. تحضير حقنة (0.5 مل أو أقل) مع 28-30 إبرة تحت الجلد G؛ قد يكون شطبة قصيرة أفضل من شطبة طويلة. نضح 10 ميكرولتر من اللقاح ليتم حقنه، وأؤكد أن حقنة خالية من الهواء.
2. توطين العقدة الليمفاوية الأربية مع مساعدة من ملقط المنحني وغيض من مقص مغلقة. فإن العقدة الليمفاوية تظهر رمادي داخل الأنسجة الدهنية أكثر بيضاء ويمكن التعرف على المزيد من خلال ارد وصادر الشعيرات الدموية الداخلة والخارجة من العقدة الليمفاوية.
3. شل العقدة الليمفاوية بوضعها بين فروع ملقط المنحني.
4. أخذ حقنة وادخال الإبرة في العقدة الليمفاوية مع شطبة مواجهة؛ التأكد من شطبة كله يدخل العقدة الليمفاوية.
5. حقن لقاح (10 ميكرولتر). إذا كانت إيماءة الليمفاويةه وتورم (تفجير)، وحقن يمكن افتراض ناجحة. إذا لم يتم وضع الإبرة عميقة بما فيه الكفاية في العقدة الليمفاوية، وبعض أو لقاح كامل قد يتسرب ولا تدخل العقدة الليمفاوية. إذا تم إدخال الإبرة عميقة جدا، وسوف يتم الافراج عن لقاح حقن تحت الجلد تحت العقدة الليمفاوية. في الحالة الأخيرة، كرر الحقن أو استبدال الماوس مع ماوس غير المعالجة الجديدة.

4. إغلاق شق من قبل التخييط

1. فتح علبة خياطة جراحية معقمة.
2. اتخاذ اجراء من إبرة خياطة مع حامل إبرة في الجزء الأعلى من الجسم إبرة. تشديد حامل إبرة عن طريق الضغط عليه حتى المصيد اسئلة الأول.
3. اتخاذ اجراء من الجلد في جانب واحد من شق باستخدام ملقط (اعتمادا على تفضيل الجراح، مسننة أو غير مسننة ملقط أو السنانير الجلد ويمكن استخدام). إدراج إبرة كاليفورنيا. 2-3 مم من حافة الجرح، والدخول من الخارج من الجلد.
4. لوسأون عقد من الجلد مع ملقط وفهم الجانب الآخر من شق مع ملقط. إدراج إبرة كاليفورنيا. 2-3 ملم من حافة الجرح، والدخول من الداخل من الجلد.
5. تخفيف حامل الإبرة وفهم نهاية الإبرة مع ملقط. سحب الإبرة مع فقي من خلال الجلد، وترك طول مناسب للفقي خارج أول نقطة إبرة الإدراج (إن عدة الفئران هي أن تعامل، وترك نهاية أقصر؛ 5-10 الفئران يمكن تشغيلها على إبرة خياطة مع واحد / فقي).
6. جعل عقدة يفضل وفقا لبروتوكولات جراح القياسية. واحد غرزة غير كافية إذا شق ليست أكبر من 10 ملم. لشقوق أكبر، وجعل غرزة الثانية.

5. علاج ما بعد العمليات

1. ضع الماوس في قفص، وتغطي مع الأنسجة للحفاظ على الدفء. عند معالجة الفئران متعددة، ووضعها قريبة من بعضها البعض للتدفئة. بدلا من ذلك، وضع الفئران على وسادة دافئة حتى قد أفاقيصل.
2. مراقبة الفئران حتى يستيقظون.
3. مراقبة الفئران يوميا فيما يتعلق التئام الجروح فضلا عن غيرها من الأعراض السريرية مثل التهابات الجروح. وعادة ما يتم إغلاق الجرح بشكل كاف خلال يومين وتلتئم في غضون سبعة أيام من العملية.

النتائج

إجراء الحقن داخل الوعاء اللمفي في الفئران، على الرغم من الطبيعة الجراحية، هي على التوالي إلى الأمام وسريع نسبيا. ويمكن لشخص مدرب تنفيذ الإجراء في 3-4 دقيقة. شق أن يتم إغلاق مع غرزة واحدة يشفى عادة في غضون يومين (الشكل 1)

وقد...

Discussion

وقد ثبت أن التحصين داخل الوعاء اللمفي والعلاج المناعي ليكون مناسبا لتحفيز كل من استجابات الأجسام المضادة والاستجابات تي خلية. كما هو موضح في هذه المقالة الفيديو، الإجراء داخل الوعاء اللمفي التطعيم هو وسيلة سريعة وسهلة لتحفيز استجابات مناعية قوية لدى الفئران. جراح ا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine (Ketasol-100)	Graeub AG, Switzerland		Anesthetics
Xylazine (Rompun)	Bayer, Germany		Anesthetics
Viscotears Eye-Gel	Novartis, Switzerland		To keep eyes from drying out during anesthesia.
BD Micro-Fine 0.5 ml	BD Medical, France		29 G Insulin syringes with permanently attached needles
6-0 Dermalon Monofilament nylon	Covidien, MA, USA		For sutures (0.7 metric, 18G, 45 cm, Blue)
Curved forceps, 4.5 inch	Polymed, Switzerland		For incision and holding of lymph node
Straight surgical scissors, 4.5 inch	Polymed, Switzerland		For incision
Needle holder, 5.5 inch	Polymed, Switzerland		To close incision with suture