Intralinfática inmunoterapia y vacunación en ratones

Resumen

La vacunación profiláctica y terapéutica a menudo falla para estimular respuestas inmunes fuertes debido a la semana de drenaje de la vacuna a los ganglios linfáticos y en consecuencia pobres implicación de células inmunes. Por inyección directa de la vacuna a los ganglios linfáticos, así llamada inyección intralinfática, eficacia de la vacuna puede ser fuertemente mejorada y dosis de la vacuna se puede reducir.

Resumen

Las vacunas se inyectan típicamente por vía subcutánea o intramuscular para la estimulación de respuestas inmunes. El éxito de este requiere un drenaje eficaz de la vacuna a los ganglios linfáticos donde las células presentadoras de antígeno pueden interactuar con linfocitos para la generación de las respuestas inmunes buscadas. La fuerza y ​​el tipo de respuesta inmune inducida también dependen de la densidad o la frecuencia de las interacciones, así como el microambiente, especialmente el contenido de citoquinas. Como sólo una fracción de minuto de vacunas periféricamente inyectados llega a los ganglios linfáticos, las vacunaciones de ratones y seres humanos se realizaron por inyección directa de la vacuna en los ganglios linfáticos inguinales, es decir, la inyección intralinfática. En el hombre, el procedimiento es guiada por ultrasonido. En ratones, una pequeña incisión (5-10 mm) se realiza en la región inguinal de los animales anestesiados, el ganglio linfático se localiza y se inmoviliza con unas pinzas, y un volumen de 10-20 l de la vacuna se inyecta bajo control visual.La incisión se cierra con una única puntada utilizando suturas quirúrgicas. Los ratones fueron vacunados con el ADN plásmido, ARN, péptido, proteína, partículas, y bacterias, así como adyuvantes, y se observó una fuerte mejora de la respuesta inmune contra todo tipo de vacunas. El método intralinfática de la vacunación es especialmente apropiada en situaciones en las que la vacunación convencional produce inmunidad insuficiente, o cuando la cantidad de vacuna disponible es limitado.

Introducción

Las vacunas se inyectan típicamente por vía subcutánea o intramuscular para la estimulación de respuestas inmunes. El éxito de este procedimiento requiere un drenaje eficaz de la vacuna a los ganglios linfáticos donde las células presentadoras de antígeno pueden interactuar con linfocitos para la generación de T y las respuestas de células B. Además, la fuerza y ​​el tipo de respuesta inmune inducida también dependen de la densidad o de la frecuencia de tales interacciones, así como el propio microambiente, especialmente el contenido de citoquinas. Como sólo una pequeña fracción de una vacuna se inyecta en un tejido periférico llega a un nodo de linfa, las vacunaciones de ratones y seres humanos mediante inyección directa de la vacuna en los ganglios linfáticos, el sitio se se generan respuestas inmunes, se han realizado. En el hombre, el procedimiento es guiado por ultrasonido, un procedimiento también se utiliza para la administración de agentes de formación de imágenes para la visualización y el diagnóstico en el sistema linfático. En ratones, el procedimiento es invasivo. Aquí, una pequeña (5-10 mm) incision se realiza en la región inguinal de los animales anestesiados ^1, el nodo linfático se localiza y se inmoviliza con fórceps, y un volumen de 10-20 l de la vacuna se inyecta bajo control visual; 10 l se utiliza para la primera inyecciones y en ratones jóvenes con pequeñas ganglios linfáticos, mientras que 20 l pueden ser inyectados en los ganglios linfáticos de los ratones más viejos o ya cebados, que tienen ganglios linfáticos más grandes. La incisión se puede cerrar con una sola puntada utilizando suturas quirúrgicas. Por este método, los ratones han vacunados con el plásmido de ADN ^{de 2,3,} el ARN mensajero ^{4, 1,3,5,6} péptido, proteína ^7-10, las partículas ^{11, 12} bacterias, así como adyuvantes ^7,13, y fuerte mejora de inmunológico Se han observado respuestas contra todo tipo de vacunas. El método intralinfática de la vacunación es especialmente apropiada en situaciones en las que la vacunación convencional produce inmunidad insuficiente o cuando la cantidad de vacuna disponible es limitado o very costoso. En humanos, el método intralinfática de la inmunización se ha aplicado a los pacientes de alergia ^14,15 o para pacientes con cáncer de ^16-21. Aunque la idea actual es que el método intralinfática es más invasivo que otros métodos inyectables tales como inyecciones intramusculares y subcutáneas, la percepción del dolor no es mayor que después de una punción venosa ^15. Se espera que la vacunación intralinfática se convertirá en una alternativa o complemento a otros métodos de vacunas profilácticas y terapéuticas especialmente. En este artículo se describe en detalle cómo se realiza el procedimiento de vacunación intralinfática en ratones. Todos los procedimientos descritos, fueron aprobados por la Agencia Veterinaria Cantonal de Zúrich, y llevaron a cabo según las directrices y directivas sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos federales suizos.

Protocolo

1. Anestesia de ratones

1. Preparar los anestésicos mediante la mezcla de ketamina (anestésico disociativo) y xilazina (sedante y analgésico) en solución salina. Las concentraciones de ketamina y xilazina en la solución final son 12.5 y 2 mg / ml, respectivamente.
2. Inyectar los anestésicos a los ratones mediante administración intraperitoneal usando una jeringa con una aguja de calibre 25-30. Utilice 0,1 ml/10 g de peso corporal.
3. Aplique una pomada oftálmica a los ojos de los ratones con el fin de evitar que se reseque de las córneas.
4. Asegúrese de que el ratón esté suficientemente anestesiado pellizcando su pie o del pie con las pinzas. Si el ratón no reacciona con reflejos para la pizca, proceder a la cirugía. Si el ratón reacciona a la pizca con los reflejos o contracciones musculares, esperar 1-2 minutos y repetir la prueba del pellizco. Si el ratón sigue reacciona, sustituya el ratón con un animal nuevo y repita el procedimiento desde el paso 1.2 en adelante.

2. Me quirúrgicancision del Área inguinal del ratón

1. Coloque el ratón en la espalda.
2. Humedecer una región inguinal con etanol desinfección (70%). Para proporcionar una mejor desinfección, la región inguinal puede afeitar para quitar la piel antes de la desinfección con etanol.
3. Tome la pata trasera y doble la articulación de la cadera para producir un ángulo de aproximadamente 90 ° de la articulación de la cadera.
4. El uso de un fórceps curvados microdissecting, tomar la piel de ratón en la zona inguinal, donde la articulación de la cadera está doblado y tire de la piel humedecida ligeramente.
5. Mientras mantiene la piel con las pinzas, corte una pequeña incisión (<5 mm) a través de la piel utilizando tijeras quirúrgicas.
6. Coloque la punta de las tijeras cerradas en la incisión y abrir aún más la incisión mediante la apertura de las tijeras mientras lo mantiene dentro de la incisión. Esto hará que la piel a desgarrarse y debe producir un diámetro de menos de 10 mm. Nota: Una fuente de luz fría con guías de luz flexibles se puede utilizar para mejorar la visibilidad. En más viejosratones, especialmente los varones, la identificación del ganglio linfático puede ser difícil debido a la cantidad de tejido de grasa en la región inguinal.

3. Inyección intralinfática

1. Preparar una jeringa (0,5 ml o menos) con una aguja hipodérmica 28-30 G; un bisel corto puede ser preferible a una larga bisel. Aspirar 10 l de la vacuna que se inyecta y aseguran que la jeringa esté libre de aire.
2. Localizar el ganglio linfático inguinal con ayuda de las pinzas curvas y la punta de la tijera cerrado. El ganglio linfático aparecerá grisáceo en el tejido graso más blanquecina y puede ser identificado más a través de aferentes y eferentes capilares que entran y salen del ganglio linfático.
3. Inmovilizar el ganglio linfático sosteniéndolo entre las ramas de las pinzas curvas.
4. Coja la jeringa e inserte la aguja en el ganglio linfático con el bisel hacia arriba, asegurándose de que todo el bisel entra en el ganglio linfático.
5. Se inyecta la vacuna (10 l). Si el visto bueno linfáticoe Es la hinchazón (voladura), la inyección se puede asumir con éxito. Si la aguja no está colocada lo más profundo en el ganglio linfático, una parte o la totalidad de la vacuna puede filtrarse y no entrar en el ganglio linfático. Si se inserta la aguja demasiado profunda, la vacuna se inyecta por vía subcutánea se dará a conocer a continuación el nodo linfático. En este último caso, repetir la inyección o sustituir el ratón con un nuevo ratón no tratado.

4. Cerrar la incisión suturando

1. Abra un paquete de sutura quirúrgica estéril.
2. Agarre de la aguja de sutura con un soporte de aguja en la parte distal del cuerpo de aguja. Apriete el soporte de la aguja apretando hasta que las primeras capturas de trinquete.
3. Agarre de la piel en un lado de la incisión utilizando fórceps (dependiendo de la preferencia del cirujano, fórceps o ganchos de la piel dentada o de las Naciones Unidas de dientes puede ser utilizado). Insertar la aguja CA. 2-3 mm del borde de la incisión, que entra desde el exterior de la piel.
4. Loosen el asimiento de la piel con los fórceps y sujete el lado opuesto de la incisión con los fórceps. Insertar la aguja CA. 2-3 mm del borde de la incisión, que entra desde el interior de la piel.
5. Afloje el soporte de la aguja y sujete el extremo de la aguja con los fórceps. Tire de la aguja con la banda de rodadura a través de la piel, dejando una longitud conveniente de la banda de rodadura fuera del primer punto de inserción de aguja (si son varios ratones a tratar, dejar un extremo más corto; 5-10 ratones puede ser operado con una aguja de sutura / Paso).
6. Hacer el nudo preferido de acuerdo con protocolos estándar cirujano. Una puntada es suficiente si la incisión no es mayor de 10 mm. Para incisiones más grandes, hacer una segunda puntada.

5. Tratamiento post-operativa

1. Coloque el ratón en la jaula y cubrir con los tejidos para mantener el calor. En el tratamiento de varios ratones, colocarlos cerca unos de otros para mantener el calor. Como alternativa, coloque el ratón sobre una almohadilla caliente hasta que han despertadoarriba.
2. Observar los ratones hasta que se despiertan.
3. Observar los ratones diariamente con respecto a la cicatrización de heridas, así como otros síntomas clínicos tales como infecciones de la herida. La herida suele ser lo suficientemente cerrado dentro de dos días, y sanó a los siete días del procedimiento.

Resultados

El procedimiento de inyecciones intralinfáticas en ratones, a pesar de la cirugía, es sencillo y relativamente rápido. Una persona capacitada puede realizar el procedimiento en 3-4 min. La incisión que se cierra con una puntada típicamente se cura dentro de dos días (Figura 1)

Vacunación o inmunización intralinfática se ha realizado con ARNm, ADN plásmido, péptidos, proteínas, virus y bacterias. Figura 2 ilustra la producción de anticuerpos desp...

Discusión

La inmunización intralinfática e inmunoterapia han demostrado ser apropiados para la estimulación de las respuestas tanto de anticuerpos y respuestas de células T. Como se ha demostrado en este video-artículo, el procedimiento intralinfática de la vacunación es un método rápido y fácil para la estimulación de respuestas inmunes fuertes en ratones. Un cirujano entrenado puede realizar el procedimiento durante 3-4 min. En la sesión también se puede compartir entre dos cirujanos donde uno es típicamente hacie...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine (Ketasol-100)	Graeub AG, Switzerland		Anesthetics
Xylazine (Rompun)	Bayer, Germany		Anesthetics
Viscotears Eye-Gel	Novartis, Switzerland		To keep eyes from drying out during anesthesia.
BD Micro-Fine 0.5 ml	BD Medical, France		29 G Insulin syringes with permanently attached needles
6-0 Dermalon Monofilament nylon	Covidien, MA, USA		For sutures (0.7 metric, 18G, 45 cm, Blue)
Curved forceps, 4.5 inch	Polymed, Switzerland		For incision and holding of lymph node
Straight surgical scissors, 4.5 inch	Polymed, Switzerland		For incision
Needle holder, 5.5 inch	Polymed, Switzerland		To close incision with suture