Endolinfatica immunoterapia e di vaccinazione nei topi

Riepilogo

Vaccinazione profilattica e terapeutica spesso non riesce a stimolare forti risposte immunitarie dovuto settimana drenaggio del vaccino ai linfonodi e conseguente scarsa coinvolgimento delle cellule immunitarie. Mediante iniezione diretta di vaccino da linfonodi, cosiddetta iniezione endolinfatica, l'efficacia del vaccino può essere fortemente migliorata e dosi di vaccino può essere ridotta.

Abstract

I vaccini sono tipicamente iniettati per via sottocutanea o intramuscolare per la stimolazione delle risposte immunitarie. Il successo di questo richiede drenaggio efficiente di vaccino ai linfonodi dove le cellule presentanti l'antigene possono interagire con i linfociti per la generazione delle risposte immunitarie voluto. La forza e il tipo di risposte immunitarie indotte dipendono anche dalla densità o frequenza di interazioni nonché il microambiente, in particolare il contenuto di citochine. Poiché solo una minima parte di vaccini iniettati perifericamente raggiunge linfonodi, le vaccinazioni di topi e gli esseri umani sono stati eseguiti mediante iniezione diretta di vaccino nei linfonodi inguinali, cioè l'iniezione endolinfatica. Nell'uomo, la procedura è guidata da ultrasuoni. Nei topi, una piccola (5-10 mm) incisione viene fatta nella regione inguinale di animali anestetizzati, il linfonodo è localizzato e immobilizzato con una pinza, e un volume di 10-20 ml di vaccino viene iniettato sotto controllo visivo.L'incisione viene chiusa con un solo punto usando suture chirurgiche. I topi sono stati vaccinati con il plasmide DNA, RNA, peptidi, proteine, particelle e batteri e coadiuvanti, e si è osservata una forte miglioramento delle risposte immunitarie contro tutti i tipi di vaccini. Il metodo endolinfatica della vaccinazione è particolarmente indicata nelle situazioni in cui la vaccinazione convenzionale produce immunità insufficiente o in cui la quantità di vaccino disponibile è limitato.

Introduzione

I vaccini sono tipicamente iniettati per via sottocutanea o intramuscolare stimolazione delle risposte immunitarie. Il successo di questa procedura richiede drenaggio efficace di vaccino ai linfonodi dove le cellule presentanti l'antigene possono interagire con i linfociti per la generazione di risposte T e B-cellule. Inoltre, la forza e il tipo di risposte immunitarie indotte dipendono anche dalla densità o frequenza di tali interazioni, nonché il microambiente stesso, specialmente il contenuto di citochine. Poiché solo una piccola frazione di un vaccino iniettato in un tessuto periferico raggiunge un linfonodo, vaccinazioni di topi e nell'uomo mediante iniezione diretta del vaccino con linfonodi, il sito sono stati generati risposte immunitarie, sono state eseguite. Nell'uomo, la procedura è guidata da ultrasuoni, una procedura utilizzata anche per la somministrazione di agenti di imaging per la visualizzazione e la diagnosi del sistema linfatico. Nei topi, la procedura è invasiva. Qui, una piccola (5-10 mm) incision è realizzato nella regione inguinale di animali anestetizzati ^1, il linfonodo è localizzato e immobilizzato con una pinza, e un volume di 10-20 ml di vaccino viene iniettato sotto controllo visivo; 10 microlitri è usato per prime iniezioni e in topi giovani con piccoli linfonodi, considerando che 20 microlitri può essere iniettato nei linfonodi di età superiore o topi già innescate, che hanno i linfonodi più grandi. L'incisione può essere chiuso con un punto singolo con suture chirurgiche. Con questo metodo, i topi sono vaccinati con il plasmide DNA ^2,3, RNA messaggero ^{4, 1,3,5,6} peptide, proteina ^7-10, particelle ^{11, 12} batteri così come adiuvanti ^7,13, e forte miglioramento immunitario Sono state osservate risposte contro tutti i tipi di vaccini. Il metodo endolinfatica della vaccinazione è particolarmente indicata nelle situazioni in cui la vaccinazione convenzionale produce immunità insufficiente o in cui la quantità di vaccino disponibile è limitato o very costoso. Nell'uomo, il metodo endolinfatica di immunizzazione è stato applicato a pazienti allergici ^14,15 o di pazienti con cancro ^16-21. Sebbene l'idea corrente è che il metodo endolinfatica è più invasivo rispetto ad altri metodi iniettabili come le iniezioni intramuscolari e sottocutanee, la percezione del dolore non è superiore dopo una puntura venosa ^15. Si prevede che la vaccinazione endolinfatica diventerà alternativa o complementare ad altri metodi di vaccini profilattici e terapeutici particolarmente. Questo articolo descrive in dettaglio come viene eseguita la procedura di vaccinazione endolinfatica nei topi. Tutte le procedure descritte, sono state approvate dall'Agenzia veterinario cantonale di Zurigo ed eseguiti secondo le linee guida federali svizzere e direttive sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici.

Protocollo

1. Anestesia di topi

1. Preparare i anestetici mescolando ketamina (anestetico dissociativo) e xilazina (sedativo e analgesico) in soluzione salina tamponata. Le concentrazioni di chetamina e xilazina nella soluzione finale sono 12,5 e 2 mg / ml, rispettivamente.
2. Iniettare anestetici ai topi per somministrazione intraperitoneale utilizzando una siringa con un ago G 25-30. Utilizzare 0,1 ml/10 g di peso corporeo.
3. Applicare una pomata oftalmica per gli occhi dei topi in modo da evitare l'essiccazione-out delle cornee.
4. Assicurarsi che il mouse sia sufficientemente anestetizzato pizzicando il piede o del piede con le pinze. Se il mouse non reagisce con riflessi per il pizzico, procedere con un intervento chirurgico. Se il mouse reagisce pizzico di riflessi o contrazioni muscolari, aspettare 1-2 minuti e ripetere il test pizzico. Se il mouse reagisce ancora, sostituire il mouse con un nuovo animale e ripetere le procedure dal punto 1.2 in poi.

2. I chirurgicancision della zona inguinale del mouse

1. Posizionare il mouse sulla sua schiena.
2. Bagnare una regione inguinale con etanolo disinfezione (70%). Per fornire una migliore disinfezione, la regione inguinale può essere rasata per rimuovere pelliccia prima disinfezione con etanolo.
3. Prendete la zampa posteriore e piegare l'articolazione dell'anca per produrre un angolo di circa 90 ° dell'articolazione dell'anca.
4. Utilizzando un curvo forcipe microdissecting, prendere la pelle del mouse nella zona inguinale, dove l'articolazione dell'anca è piegato e tirare la pelle bagnata leggermente.
5. Tenendo la pelle con le pinze, tagliare una piccola incisione (<5 mm) attraverso la pelle con le forbici chirurgiche.
6. Posizionare la punta delle forbici chiuse nell'incisione e aprire ulteriormente l'incisione aprendo le forbici tenendolo dentro l'incisione. Questo farà sì che la pelle allo strappo e dovrebbe produrre un diametro inferiore a 10 mm. Nota: Una sorgente di luce fredda con guide di luce flessibile può essere utilizzato per migliorare la visibilità. In più vecchiotopi, soprattutto maschi, l'identificazione del linfonodo può essere difficile a causa tessuto molto grasso nella regione inguinale.

3. Iniezione endolinfatica

1. Preparare una siringa (0,5 ml o meno) con un ago ipodermico G 28-30; un breve smussatura può essere preferibile per un lungo bisello. Aspirare 10 ml di vaccino da iniettare e assicurano che la siringa è privo di aria.
2. Localizzare il linfonodo inguinale con l'aiuto delle pinze curve e la punta della forbice chiusa. Il linfonodo viene visualizzata grigiastro all'interno del tessuto grasso più biancastra e può essere ulteriormente individuate attraverso afferenti ed efferenti capillari che entrano ed escono il linfonodo.
3. Immobilizzare il linfonodo tenendolo tra i rami delle pinze curve.
4. Prendere la siringa e inserire l'ago nel linfonodo con lo smusso rivolto verso l'alto, assicurandosi che il complesso smussatura entra nel linfonodo.
5. Iniettare il vaccino (10 microlitri). Se il cenno del capo linfae si gonfia (esplodere), l'iniezione può essere assunto successo. Se l'ago non è posizionato abbastanza in profondità nel linfonodo, una parte o l'intero vaccino può fuoriuscire e non entrare nel linfonodo. Se l'ago viene inserito troppo in profondità, il vaccino iniettato uscirà sottocutanea sotto del linfonodo. Nel caso di quest'ultimo, ripetere l'iniezione o sostituire il mouse con un nuovo mouse greggia.

4. Chiusura del Incision da sutura

1. Aprire una confezione di sterile sutura chirurgica.
2. Afferrare l'ago di sutura con un porta-aghi in corrispondenza della porzione distale del corpo dell'ago. Serrare il supporto dell'ago stringendola fino alle prime catture cricchetto.
3. Afferrare la pelle su un lato l'incisione con pinze (a seconda delle preferenze del chirurgo, dentato o pinze o uncini cutanei non-denti possono essere utilizzati). Inserire l'ago ca. 2-3 mm dal bordo dell'incisione, entrando dall'esterno della pelle.
4. Loosen stiva della pelle con la pinza e afferrare il lato opposto della incisione con le pinze. Inserire l'ago ca. 2-3 mm dal bordo dell'incisione, entrando dall'interno della pelle.
5. Allentare il supporto dell'ago e afferrare l'ago con le pinze. Estrarre l'ago con il battistrada attraverso la pelle, lasciando una conveniente lunghezza del battistrada di fuori del primo punto ago-inserimento (se diversi topi sono da trattare, lasciare un terminale più corto; 5-10 topi può funzionare con un ago di sutura / calcare).
6. Rendere il nodo preferito secondo protocolli chirurgo standard. Un punto è sufficiente che l'incisione non è maggiore di 10 mm. Per incisioni di grandi dimensioni, effettuare un secondo punto.

5. Il trattamento post-operativa

1. Posizionare il mouse nella gabbia e coprire con i tessuti per tenere in caldo. Durante il trattamento più topi, metterli uno vicino all'altro per tenere in caldo. In alternativa, posizionare il mouse su un tappetino caldo fino a quando si sono svegliatiup.
2. Osservare il mouse fino a quando si svegliano.
3. Osservare i topi quotidiano con riferimento a guarigione delle ferite così come altri sintomi clinici, come infezioni della ferita. La ferita è in genere sufficientemente chiusa entro due giorni e guarito entro sette giorni dalla procedura.

Risultati

La procedura di iniezioni intralinfatiche nei topi, nonostante la natura chirurgica, è semplice e relativamente veloce. Una persona esperta in grado di eseguire la procedura in 3-4 min. L'incisione che è chiuso con un punto guarisce in genere entro due giorni (Figura 1)

Endolinfatica vaccinazione o immunizzazione è stato eseguito con mRNA, DNA plasmidico, peptidi, proteine, virus e batteri. Figura 2 illustra la produzione anticorpale dopo immunizzazio...

Discussione

Immunizzazione endolinfatica e immunoterapia hanno dimostrato di essere adatto per la stimolazione di entrambe le risposte anticorpali e risposte delle cellule T. Come dimostrato in questo video-articolo, la procedura endolinfatica di vaccinazione è un metodo semplice e veloce per stimolare una forte risposta immunitaria nei topi. Un chirurgo esperto può eseguire la procedura durante 3-4 min. La sessione può anche essere condiviso tra due chirurghi in cui si è tipicamente facendo l'anestesia e la sutura e il sec...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine (Ketasol-100)	Graeub AG, Switzerland		Anesthetics
Xylazine (Rompun)	Bayer, Germany		Anesthetics
Viscotears Eye-Gel	Novartis, Switzerland		To keep eyes from drying out during anesthesia.
BD Micro-Fine 0.5 ml	BD Medical, France		29 G Insulin syringes with permanently attached needles
6-0 Dermalon Monofilament Nylon	Covidien, MA, USA		For sutures (0.7 metric, 18 G, 45 cm, Blue)
Curved forceps, 4.5 in	Polymed, Switzerland		For incision and holding of lymph node
Straight surgical scissors, 4.5 in	Polymed, Switzerland		For incision
Needle holder, 5.5 in	Polymed, Switzerland		To close incision with suture