Intralymphatique Immunothérapie et vaccination chez la souris

Résumé

La vaccination prophylactique et thérapeutique échoue souvent pour stimuler une forte réponse immunitaire due à la semaine drainage du vaccin vers les ganglions lymphatiques et par conséquent faible implication des cellules immunitaires. Par injection directe de vaccin vers les ganglions lymphatiques, dite injection intralymphatique, l'efficacité du vaccin peut être fortement améliorée, et les doses de vaccin peut être réduite.

Résumé

Les vaccins sont typiquement injectés par voie intramusculaire ou sous-cutanée pour la stimulation des réponses immunitaires. Le succès de cette nécessite un drainage efficace de vaccin vers les ganglions lymphatiques où les cellules présentant l'antigène peuvent interagir avec les lymphocytes pour la génération de réponses immunitaires recherchés. La force et le type de réponses immunitaires induites dépendent aussi de la densité ou la fréquence des interactions ainsi que le micro-environnement, en particulier la teneur en cytokines. Comme seule une infime partie de la périphérie vaccins injectés atteint les ganglions lymphatiques, la vaccination de souris et de l'homme ont été réalisées par injection directe de vaccin dans les ganglions lymphatiques inguinaux, à savoir l'injection intralymphatique. Chez l'homme, la procédure est guidée par échographie. Chez la souris, une petite (5-10 mm) incision est pratiquée dans la région inguinale des animaux anesthésiés, le ganglion lymphatique est localisé et immobilisé avec une pince, et un volume de 10-20 ul du vaccin est injecté sous contrôle visuel.L'incision est fermée avec un seul point à l'aide de sutures chirurgicales. Les souris ont été vaccinées avec de l'ADN plasmidique, l'ARN, un peptide, une protéine, des particules, et les bactéries ainsi que des adjuvants, et une forte amélioration de la réponse immunitaire contre tous les types de vaccins ont été observées. La méthode intralymphatique de la vaccination est particulièrement approprié dans les situations où la vaccination classique produit une immunité insuffisante ou lorsque la quantité de vaccin disponible est limitée.

Introduction

Les vaccins sont typiquement injectés par voie intramusculaire ou sous-cutanée pour la stimulation des réponses immunitaires. La réussite de ce procédé nécessite un drainage efficace de vaccin vers les ganglions lymphatiques où les cellules présentant l'antigène peuvent interagir avec les lymphocytes pour la production de T-et de réponses des cellules B. En outre, la force et le type de réponses immunitaires induites dépendent aussi de la densité ou de la fréquence de ces interactions ainsi que le micro-environnement lui-même, en particulier la teneur en cytokines. Comme seule une petite fraction d'un vaccin injecté dans un tissu périphérique atteint un ganglion lymphatique, la vaccination de souris et l'homme par injection directe du vaccin dans les ganglions lymphatiques, le site ont été les réponses immunitaires sont produits, ont été réalisées. Chez l'homme, la procédure est guidée par ultrasons, un procédé également utilisé pour l'administration d'agents d'imagerie pour la visualisation et de diagnostic dans le système lymphatique. Chez la souris, la procédure est invasive. Ici, une petite (5-10 mm) incision est fabriqué dans la région inguinale des animaux anesthésiés ^1, le ganglion lymphatique est localisé et immobilisé avec une pince, et un volume de 10-20 ul du vaccin est injecté sous contrôle visuel, 10 pi est utilisé pour les premières injections et chez de jeunes souris avec de petits ganglions lymphatiques, tandis que 20 pl peuvent être injectés dans les ganglions lymphatiques de souris âgée ou déjà amorcés, qui ont de plus grands ganglions lymphatiques. L'incision peut être fermé avec un seul point à l'aide de sutures chirurgicales. Par cette méthode, les souris ont vaccinés avec l'ADN plasmidique ^{de 2,3,} l'ARN messager ^{4, 1,3,5,6} peptide, protéine ^7-10, les particules ^{11, 12} des bactéries, ainsi que des adjuvants ^7,13, et une forte amélioration de l'abri réponses contre tous les types de vaccins ont été observés. La méthode intralymphatique de la vaccination est particulièrement approprié dans les situations où la vaccination classique produit une immunité insuffisante ou lorsque la quantité de vaccin disponible est limité ou very coûteux. Chez l'homme, le procédé intralymphatique de vaccination a été appliquée à des patients allergiques à ^14,15 ou ^{16 à 21} patients atteints d'un cancer. Bien que la notion de courant est que la méthode est intralymphatique plus invasif que d'autres méthodes injectables tels que des injections intramusculaires et sous-cutanées, la perception de la douleur n'est pas plus élevée qu'après une ponction veineuse ^15. Il est prévu que la vaccination intralymphatique deviendra une alternative ou un complément à d'autres méthodes de vaccins prophylactiques et thérapeutiques en particulier. Cet article décrit en détail la façon dont la procédure de vaccination intralymphatique est réalisée chez la souris. Toutes les procédures décrites, ont été approuvés par l'Agence vétérinaire cantonal de Zurich et réalisés selon des lignes directrices et des directives sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques fédéraux suisses.

Protocole

Une. Anesthésie de souris

1. Préparer les anesthésiques par mélange de kétamine (anesthésique dissociatif) et de xylazine (sédatif et analgésique) dans une solution saline tamponnée. Les concentrations de kétamine et de xylazine dans la solution finale est de 12,5 et 2 mg / ml, respectivement.
2. Injecter l'anesthésique à la souris par voie intrapéritonéale à l'aide d'une seringue avec une aiguille de 25 à 30 G. Utiliser 0,1 ml/10 g de poids corporel.
3. Appliquer une pommade ophtalmique aux yeux des souris afin d'éviter le dessèchement de la cornée.
4. Assurez-vous que la souris est suffisamment anesthésiée par pincement son pied ou un orteil avec la pince. Si la souris ne réagit pas avec les réflexes au pincement, de procéder à une intervention chirurgicale. Si la souris réagit à la rigueur avec des réflexes ou des contractions musculaires, attendre 1-2 minutes et répéter le test de pincement. Si la souris réagit toujours, remplacez la souris avec un nouvel animal et répéter les procédures de l'étape 1.2 partir.

2. Je chirurgicalencision de la région inguinale de la souris

1. Placez la souris sur son dos.
2. Mouiller une région inguinale avec de l'éthanol désinfection (70%). Pour assurer une meilleure désinfection, la région inguinale peut être rasé pour enlever la fourrure désinfection préalable avec de l'éthanol.
3. Prenez la patte arrière et plier la hanche pour produire un angle d'environ 90 ° de l'articulation de la hanche.
4. L'utilisation d'un forceps courbes de microdissecting, prendre la peau de la souris dans la région inguinale où l'articulation de la hanche est plié et tirez la peau mouillée légèrement.
5. Tout en maintenant la peau avec des pinces, couper une petite incision (<5 mm) à travers la peau avec des ciseaux chirurgicaux.
6. Placez la pointe des ciseaux fermés dans l'incision et ouvrir davantage l'incision en ouvrant les ciseaux tout en maintenant à l'intérieur de l'incision. Cela entraînera la peau à se déchirer et devrait produire un diamètre inférieur à 10 mm. Remarque: Une source de lumière froide avec guides de lumière flexibles peut être utilisé pour améliorer la visibilité. En plusles souris mâles, en particulier, l'identification d'un ganglion lymphatique peut être difficile en raison de la quantité de tissu de matière grasse dans la région inguinale.

3. Injection intralymphatique

1. Préparer une seringue (0,5 ml ou moins) avec une aiguille hypodermique G 28-30; biseau court peut être préférable à un long biseau. Aspirer 10 pi de vaccin à injecter et assurent que la seringue est exempte d'air.
2. Localiser le ganglion lymphatique inguinal avec l'aide de la pince courbes et la pointe de ciseaux fermé. Le ganglion lymphatique apparaît grisâtre dans le tissu adipeux plus blanchâtre et peut encore être identifié par capillaires afférents et efférents qui entrent et sortent du ganglion lymphatique.
3. Immobiliser le ganglion lymphatique en le maintenant entre les branches de la pince incurvés.
4. Prenez la seringue et insérer l'aiguille dans le ganglion lymphatique avec les coniques orientés vers le haut; s'assurer que l'ensemble du biseau pénètre dans le ganglion lymphatique.
5. Injecter le vaccin (10 pi). Si le feu vert de la lymphee est un gonflement (sauter), l'injection peut supposer succès. Si l'aiguille n'est pas placé assez profondément dans le ganglion lymphatique, une partie ou la totalité du vaccin peut s'échapper et ne pas entrer dans le ganglion lymphatique. Si l'aiguille est insérée trop profondément, le vaccin injecté sera publié voie sous-cutanée en dessous du noeud lymphatique. Dans ce dernier cas, répéter l'injection ou de remplacer la souris avec une nouvelle souris non traitées.

4. Fermeture de l'incision par suture

1. Ouvrez un paquet de suture chirurgicale stérile.
2. Saisir l'aiguille de suture et d'un support d'aiguille à la portion distale du corps d'aiguille. Serrer le porte-aiguille en le serrant jusqu'à ce que les premières prises de cliquet.
3. Saisir la peau d'un côté de l'incision avec une pince (en fonction de la préférence du chirurgien, pinces ou crochets de la peau dentée ou non dentée peut être utilisé). Insérer l'aiguille ca. 2-3 mm du bord de l'incision, l'entrée de l'extérieur de la peau.
4. Loosen attente de la peau avec la pince et à saisir le côté opposé de l'incision avec la pince. Insérer l'aiguille ca. 2-3 mm du bord de l'incision, l'entrée de l'intérieur de la peau.
5. Desserrer le porte-aiguille et de saisir l'extrémité de l'aiguille avec la pince. Retirez l'aiguille de la bande de roulement à travers la peau, laissant une longueur convenable de la bande de roulement à l'extérieur du premier point insertion de l'aiguille (si plusieurs souris sont à traiter, laisser un extrémité la plus courte; 5-10 souris peut être utilisée sur une seule aiguille à suture / bande de roulement).
6. Faire le noeud préféré selon les protocoles de chirurgien standard. Un point est suffisante si l'incision n'est pas supérieure à 10 mm. Pour les grandes incisions, faire un deuxième point.

5. Traitement post-opératoire

1. Placez la souris dans la cage et couvrir avec les tissus pour garder au chaud. Lors du traitement de plusieurs souris, placez-les près de l'autre pour se réchauffer. Sinon, placez la souris sur un tapis chaud jusqu'à ce qu'ils se sont réveillésup.
2. Observez la souris jusqu'à ce qu'ils se réveillent.
3. Respecter les souris quotidiennement en ce qui concerne la cicatrisation ainsi que d'autres symptômes cliniques tels que des infections de plaies. La blessure est généralement suffisamment fermée dans les deux jours et guérit dans les sept jours de la procédure.

Résultats

La procédure d'injections intralymphatique chez la souris, en dépit de la nature chirurgicale, est simple et relativement rapide. Une personne formée peut effectuer la procédure en 3-4 min. L'incision est fermée avec une couture guérit normalement dans les deux jours (figure 1)

Intralymphatique vaccination ou l'immunisation a été réalisée avec l'ARNm, l'ADN plasmidique, les peptides, les protéines, les virus et les bactéries. Figure 2<...

Discussion

Intralymphatique immunisation et l'immunothérapie se sont révélés être appropriés pour la stimulation des deux réponses d'anticorps et de réponses des cellules T. Comme démontré dans cette vidéo-article, la procédure intralymphatique de la vaccination est une méthode rapide et facile pour stimuler une forte réponse immunitaire chez les souris. Un chirurgien qualifié peut effectuer la procédure pendant 3-4 min. La session peut également être partagé entre deux chirurgiens où l'on est gén?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine (Ketasol-100)	Graeub AG, Switzerland		Anesthetics
Xylazine (Rompun)	Bayer, Germany		Anesthetics
Viscotears Eye-Gel	Novartis, Switzerland		To keep eyes from drying out during anesthesia.
BD Micro-Fine 0.5 ml	BD Medical, France		29 G Insulin syringes with permanently attached needles
6-0 Dermalon Monofilament nylon	Covidien, MA, USA		For sutures (0.7 metric, 18G, 45 cm, Blue)
Curved forceps, 4.5 inch	Polymed, Switzerland		For incision and holding of lymph node
Straight surgical scissors, 4.5 inch	Polymed, Switzerland		For incision
Needle holder, 5.5 inch	Polymed, Switzerland		To close incision with suture