في المختبر الهجرة الخليوي والغزو فحوصات

Summary

تستخدم عادة، يتم وصف طرق للوصول للغاية لدراسة الهجرة الخلية والغزو في المختبر. الأسلوب الأول هو الجرح خلية إغلاق الفحص الذي يقيس حركية الخلية. الأسلوب الثاني هو transwell الهجرة والغزو الفحص أن يقيم الكيميائي والقدرة الغازية من الخلايا.

Abstract

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

Introduction

حركية هو سمة أساسية من سمات الخلايا الحية. وتشارك الهجرة خلية في مفهوم الحياة، والتطور الجنيني، الاستجابة المناعية، والعديد من العمليات المرضية مثل السرطان والتهاب ثانوي لورم خبيث ^1-9. وبالتالي، وأساليب لدراسة الخلية السلوك المهاجرة هي أدوات البحث مفيد جدا لمجموعة واسعة من التخصصات في العلوم الطبية الحيوية، وعلم الأحياء، والهندسة الحيوية، والمجالات ذات الصلة.

دراسة الهجرة الخلية في أبحاث السرطان هو من مصلحة خاصة فيما يرتبط السبب الرئيسي للوفاة في مرضى السرطان لتطور النقيلي. من أجل السرطانية تنتشر وتنشر في جميع أنحاء الجسم، يجب أن تهاجر الخلايا السرطانية وغزو من خلال المصفوفة خارج الخلية (ECM)، intravasate في الدورة الدموية، ونعلق على موقع بعيد، وأخيرا يتسرب إلى تشكيل بؤر بعيدة ^1،10-12. لذا يمكن استخدام الأساليب البيولوجية المختلفة لدراسة هذه الأحداث بالتفصيل. ثقافة الخلية جرح إغلاق لوتستخدم على نطاق واسع د هجرة transwell والمقايسات الغزو في الأوساط العلمية ^1،10. هذه الاختبارات يمكن أن توفر البيانات اللازمة التي قد تسمح لفهم مدى نوع خلية معينة يمكن ترحيل من تلقاء أنفسهم أو الرد على الكيماوي جاذبة وتهاجر إتجاهي نحو ذلك. وقد وصفت العديد من الظواهر المهاجرة. قد تهاجر الخلايا في شكل خلية واحدة من هذا القبيل كما رأينا في الوسيطة أو حركة تشبه حركة أميبية أو متعددة الخلايا وصفت الهجرة الجماعية أو خلية تدفق ^13. طريقة الحركة المستخدمة في خلايا متحركة يمكن ملاحظتها بسهولة باستخدام زراعة الخلايا إغلاق الجرح الفحص.

من بين العديد من الطرق لدراسة الهجرة الخلية، الجرح خلية إغلاق الفحص هو واحد من أبسط. وهذه الطريقة مفيدة لتحديد القدرة هجرة الجماهير خلية كاملة. عندما اتخذت خطوة أخرى يمكن استخدامها لمراقبة الخصائص المورفولوجية خلية الفرد أثناء الترحيل ¹⁴. بعد تحليل إغلاق الجرح قد كشفت العديد من الظواهر. قياس المسافة المغلقة مع مرور الوقت عند مقارنة إلى عنصر تحكم قد تكشف عن تغييرات محددة الهجرة أو النمط الظاهري المهاجرة ضعاف التي لم تكن معروفة سابقا. علاوة على ذلك، تشكيل واحد قدم صفاحية خلية، وذيل سحب، وحركة الاتجاه قد تعطي مؤشرات لما قد تنخفض قيمتها أو محسنة في خلايا الفائدة ^14.

هجرة transwell والمقايسات الغزو يمكن أن تستخدم لتحليل قدرة الخلايا واحد للرد إتجاهي لمختلف الكيماوي جاذبة سواء كانوا كيموكينات، عوامل النمو، والدهون، أو النيوكليوتيدات ^{4،5،8،15،16.} كما أنه قد تقييم قدرة المهاجرة الفرق بسبب الإفراط في التعبير عن مستقبلات ^1،14. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه المقايسات لتحديد وتوصيف المنظمين الرئيسيين للهجرة الخلية مثل الأسرة رو من GTPases الصغيرة ^2. بعد هذه قصيرة وبسهولة القويمكن أيضا تحديد اختبارات إيصال خدمات الإيداع، ووضع الهجرة الخلية، وقدرة الخلية لغزو في مصفوفة 3-D.

Protocol

1. إغلاق الفحص مدينة الثقافة الجرح

1. فصل الخلايا من نسيج لوحة الثقافة باستخدام 0.25٪ التربسين-EDTA حل. بيليه الخلايا في أنبوب 15 مل المخروطية بواسطة الطرد المركزي، ونضح طاف، واعادة تعليق الخلايا في وسائل الإعلام والثقافة. لوحة العدد المناسب من الخلايا في لوحة 6 جيدا للالتقاء 100٪ في غضون 24 ساعة.
   ملاحظة: قد تكون هناك حاجة إلى اختبارات لتحديد الوقت وعدد من الخلايا لتحقيق 100٪ التقاء بسبب نوع من الخلايا وحجم البئر وتستخدم (على سبيل المثال، هي المصنفة 1 × 10 ⁶ خلايا سرطان الجلد B16F10 في بئر ل لوحة 6 جيدا قبل 24 ساعة من الجيل الجرح). بدلا من ذلك، يمكن استخدام 12 أو 24 جيدا جيدا لوحات.
   ملاحظة: إذا كان متوفرا، يمكن خلايا المصنف إلى إدراج الثقافة (من ibidi LLC) على التعامل مع الأنسجة لوحة الثقافة جعل الجرح قبل مسبوكة. A الثقافة إدراج يمكن حماية السطح من لوحة زراعة الأنسجة من التلف من قبل طرف ماصة. إذا تم استخدام الثقافة إدراج خطوة تجاهل1.2.
2. في بيئة معقمة (عادة غطاء السلامة الأحيائية) استخدام غيض ماصة 200 ميكرولتر للضغط بحزم ضد الجزء العلوي من لوحة زراعة الأنسجة وجعل بسرعة جرح رأسي إلى أسفل من خلال أحادي الطبقة الخلية. A مختلفة غيض ماصة الحجم يمكن استخدامها لجعل حجم الجرح الذي هو المطلوب. لا تستخدم القوة المفرطة ضد لوحة زراعة الأنسجة مع طرف ماصة لأنه قد يتلف السطح. إذا كان الجرح محمل مسبقا، قد يتم حذف هذه الخطوة.
3. نضح بعناية وسائل الإعلام والحطام الخلية. إضافة ببطء بما فيه الكفاية سائل الإعلام والثقافة ضد الجدار جيدا لتغطية قاع البئر وتجنب فصل خلايا إضافية. بعد جيل والتفتيش على الجرح ينبغي أن تؤخذ صورة الأولي. وضع لوحة زراعة الأنسجة في حاضنة وضعت في درجة حرارة مناسبة وأول أكسيد الكربون ₂ تركيز (عادة 37 درجة مئوية و 5٪ CO _2).
4. في عدة نقاط الوقت، مثل كل 3 ساعات، وإزالة لوحة من incubatأو وضعه تحت مجهر مقلوب لالتقاط صورة لقطة وللتحقق من إغلاق الجرح. إذا كان الوقت الفاصل بين المجهري هو متاح، التقاط صورة كل عدد X من دقيقة (تبدأ عادة مع كل 5 دقائق) لأي مدة زمنية في درجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون ₂ غرفة التحكم. اعتمادا على نوع من الخلايا، قد تختلف الجرح وقت الإغلاق.
5. لتحليل نتائج الصور لقطة، وقياس المسافة من جانب واحد من الجرح إلى أخرى باستخدام شريط مقياس. تحليل والحاضر بوضوح إغلاق الجرح مع مرور الوقت باستخدام مؤامرة مبعثر أو شريط الرسم البياني، مثل الشكل 1.
6. لتحليل الصور الوقت الفاصل بين، استيراد الصور في البرنامج يماغيج (متاحة بحرية في http://rsb.info.nih.gov/ij/) لجعل الفيديو. للقيام بذلك يماغيج مفتوحة، انقر فوق ملف، استيراد، وتسلسل الصور. العثور على الملف مع الصور؛ انقر على الصورة الأولى في الملف. حفظ الفيديو عن طريق تحديد ملف، حفظ، وافي. ويمكن ملاحظة الخلايا المهاجرة واحد لشاراcterize حركة الاتجاه. وعلاوة على ذلك، والخصائص المورفولوجية مثل تشكيل أقدام صفاحية وراء حافة التراجع قد تدرس كذلك (الشكل 2 والفيديو التكميلية).

2. Transwell الهجرة الخليوي والغزو الفحص

1. في بيئة معقمة (عادة غطاء السلامة الأحيائية) فصل الخلايا من نسيج لوحة الثقافة باستخدام غير الأنزيمية العازلة تفارق الخلية أو 0.25٪ التربسين-EDTA حل، وخلايا بيليه بواسطة الطرد المركزي، ونضح وسائل الإعلام القائمة وترك الخلايا مكعبات. اعادة تعليق الخلايا في مصل سائل الإعلام والثقافة الحرة الخلية تحتوي على 0.1٪ BSA (ألبومين المصل البقري).
   ملاحظة: اعتمادا على خط الخلية التي يجري التحقيق 0.25٪ التربسين EDTA-قد تؤثر الهجرة الخلية والغزو بسبب الانقسام من المستقبلات المختلفة على سطح الخلية ^17.
   ملاحظة: عدد الخلايا لكل مل يعتمد على حجم الخلايا. قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من الاختبارات للعثور على كثافة البذر التي محترفينفيديس على أفضل النتائج. عادة 1 × 10 ⁶ خلية / مل هو نقطة انطلاق جيدة لمعظم أنواع الخلايا عند استخدام جيدا 24 transwell إدراج. هناك مجموعة واسعة من الأحجام transwell إدراج وينبغي تعديل عدد الخلايا المضافة لوفقا لذلك.
2. لوحة 100 ميكرولتر من محلول الخلية على الجزء العلوي من الغشاء المرشح في إدراج transwell واحتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ للسماح للخلايا ليستقر.
   ملاحظة: حجم المسام معينة من الغشاء transwell المستخدمة تعتمد على حجم الفردية من الخلايا في العينة. على سبيل المثال، إذا كانت الخلايا صغيرة جدا فإنها قد تمر من خلال المسام دون الحاجة إلى تسهيل الهجرة أو إذا كانت كبيرة جدا فإنها قد لا تناسب من خلال المسام. وهناك العديد من إدراج transwell مع أحجام المسام التي تتراوح من 3 ميكرون، 5 ميكرون، و 8 ميكرومتر لفحوصات الهجرة الخلية. تتوفر تجاريا على إدراج transwell من شركات مثل كورنينج.
   ملاحظة: transwell مigration مقايسة يمكن تعديلها بسهولة لإجراء فحص غزو الخلية. للقيام بذلك، قم بإضافة المصفوفة خارج الخلية (ECM) مواد على رأس الغشاء transwell ثم قم بإضافة خلايا على رأس ECM. على سبيل المثال، يتم إذابة Matrigel ومسالة على الجليد، ومن ثم يتم إضافة 30-50 ميكرولتر من Matrigel إلى جيدا 24 transwell إدراج وعزز في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة لتشكيل طبقة رقيقة هلام. يضاف حل الخلية على رأس طلاء Matrigel لمحاكاة الغزو من خلال المصفوفة خارج الخلية.
   ملاحظة: هناك اختلافات واضحة بين الهجرة الخلية transwell والمقايسات غزو الخلايا transwell. يقيس الفحص الهجرة الخلية transwell القدرة الكيميائي للخلايا نحو الكيماوي جاذبة. مقايسة غزو الخلايا transwell، ومع ذلك، يقيس كلا الكيميائي خلية وغزو الخلايا من خلال المصفوفة خارج الخلية، وهي العملية التي توجد عادة في الانبثاث السرطان أو التطور الجنيني.
3. باستخدام ماصة، caref جدامع ully إضافة 600 ميكرولتر من المطلوب الكيماوي جاذبة في الجزء السفلي من مجلس النواب في 24 لوحة جيدا. إضافة الكيماوي جاذبة دون تحريك إدراج transwell وتجنب توليد فقاعات. تأكد من أن السائل الكيماوي جاذبة في البئر أسفل يجعل الاتصال مع الغشاء في البئر العليا لتشكيل التدرج الكيميائي. فترة حضانة تعتمد على نوع من الخلايا والكيماوي جاذبة المستخدمة.
   ملاحظة: قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من الاختبارات لتحديد فترة الحضانة.
   ملاحظة: للحصول على الخلايا الملتصقة، فإن الخلايا هاجر نعلق على الجانب الآخر من الغشاء ^1،8. الكمي من الخلايا هاجر لا يمكن أن يؤديها التالية الخطوات 2،4-2،8 (الخطوات 2،4-2،8 لا تحتاج إلى أن يؤديها في بيئة معقمة). لخلايا غير ملتصقة، فإن الخلايا هاجر تسقط في وسائل الاعلام في مجلس النواب. يمكن الاعتماد على عدد من الخلايا باستخدام عدادة الكريات هاجروا أو تدفق عداد الكريات ^5.
4. إزالة إدراج transwell من لوحة. استخدام قضيب من القطن ذات الرؤوس عدة مرات حسب الحاجة لإزالة بعناية وسائل الإعلام والخلايا المتبقية التي لم هاجروا من الجزء العلوي من الغشاء دون الإضرار بها.
5. إضافة 600-1،000 ميكرولتر من الايثانول 70٪ في بئر من 24 لوحة جيدا. وضع إدراج transwell في الإيثانول 70٪ لمدة 10 دقيقة للسماح التثبيت الخلية. إزالة transwell إدراج من 24 لوحة جيدا واستخدام قضيب من القطن ذات الرؤوس لإزالة الإيثانول المتبقية من الجزء العلوي من الغشاء. يسمح الغشاء transwell لتجف (عادة 10-15 دقيقة).
6. إضافة 600-1،000 ميكرولتر من 0.2٪ الكريستال البنفسجي في بئر من 24 لوحة جيدا ووضع الغشاء في ذلك لتلطيخ. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-10 دقائق.
7. بلطف إزالة البنفسجي الكريستال من أعلى الغشاء مع طرف ماصة أو القطن يميل قضيب. بعناية فائقة، لتجنب غسل قبالة خلايا ثابتة، وتراجع الغشاء إلى الماء المقطر عدة مرات حسب الحاجة لإزالة الزائدة الكريستال violeر. يسمح الغشاء transwell لتجف.
8. عرض تحت مجهر مقلوب وحساب عدد الخلايا في مختلف المجالات من أجل الحصول على متوسط ​​مجموع الخلايا التي هاجروا عبر الغشاء تجاه الكيماوي جاذبة وتعلق على الجانب السفلي من الغشاء (الشكل 3).

النتائج

أجريت إغلاق فحص الجرح وفحص الهجرة الخلية transwell المقدمة هنا باستخدام خلايا فأر B16F10 سرطان الجلد كنظام نموذج. في مقايسة إغلاق الجرح، وكانت المصنفة B16F10 الخلايا في 6 جيدا نسيج لوحة الثقافة ونمت إلى 100٪ التقاء في غضون 24 ساعة. ولدت وجرح ما يقرب من 700 ميكرون واسع باستخدام طرف م?...

Discussion

الهجرة الخلية هو أحد الجوانب الهامة للدراسة في أبحاث السرطان، ويمكن أيضا أن تطبق على النمو، والجرح الدراسات المناعية الشفاء. ثقافة الخلية الجرح إغلاق الفحص والكشف عن الهجرة الخلية transwell والغزو المقايسات معلومات مفصلة من السلوكيات الخلايا المهاجرة، ويمكن استخدامها...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Gibco	11995-073
Fetal bovine serum (FBS)	Gemini	100106
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503-50G
Trypsin EDTA 0.25%	Gibco	25200-056
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS)	Gibco	14190-250
Crystal violet	Sigma	C0775-100G	Dissolved in water at 0.2%
Cell disassociation buffer	Gibco	13151-014
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific		Model # 3145
SterilGARD biosafety hood	The Baker Company, Inc.		Model # VBM-600
EVOS Fl inverted microscope	Thermo Fisher Scientific		Model # AMF-4302-US
Tissue culture plate	Becton Dickinson	353046	Catalog number varies depending on the type of culture plate
Corning Transwell insert	Fisher	07-200-150	Catalog number varies depending on the pore size of the membrane