נדידת תאים במבחנה ומבחני פלישה

Summary

בשימוש נפוץ, שיטות נגישות ביותר לבחינת נדידת תאים ופלישה במבחנה מתוארות. השיטה הראשונה היא assay סגירת פצע תא המודד את תנועתיות תא. השיטה השנייה היא assay ההגירה והפלישה transwell שמעריך את chemotactic וקיבולת פולשני של תאים.

Abstract

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

Introduction

תנועתיות היא תכונה חיונית של תאי חיים. נדידת תאים מעורבת בתפיסה של חיים, התפתחות עוברית, תגובה חיסונית, ורבים תהליכים פתולוגיים כגון גרורות סרטן ודלקת ^1-9. לכן, שיטות ללמוד התנהגות נדידה סלולרי הן כלי מחקר שימושיים מאוד עבור מגוון רחב של תחומים במדעים ביו ושדות, ביולוגיה, הנדסה גנטיות, קשורים.

המחקר של נדידת תאים בחקר הסרטן הוא עניין מיוחד כגורם העיקרי למוות בחולי סרטן קשור להתקדמות גרורתי. על מנת שהסרטן להתפשט ולהפיץ בכל הגוף, תאים סרטניים חייבים לנדוד ולפלוש דרך מטריצה ​​תאית (ECM), intravasate למחזור דם, לצרף לאתר מרוחק, ובסופו extravasate כדי ליצור מוקדים רחוקים ^1,10-12. שיטות ביולוגיות שונות עשויות להיות מועסקות על מנת ללמוד את האירועים הללו בפירוט. פצע סגר תרבית התאיםמבחני ד הגירת transwell והפלישה נמצאים בשימוש נרחב בקהילה המדעית ^1,10. בדיקות אלה יכולות לספק את הנתונים הדרושים שעשויות לאפשר הבנה של אופן שגם סוג תא מסוים באופן ספונטני יכול להעביר או להגיב להכימותרפיה attractant וdirectionally להגר אליה. כמה פנוטיפים נודדים כבר תיארו. תאים עשויים לנדוד בצורת תא בודדת כגון ראתה בmesenchymal או תנועה כמו אמבואידית-או על ידי תנועה רב תאית שכותרת הגירה קולקטיבית או תא הזרמה ^13. השיטה של ​​תנועה המשמשת בתאי ניעתי ניתן לראות בקלות באמצעות assay סגירת פצע תרבית תאים.

בין הדרכים הרבות ללמוד נדידת תאים, assay סגירת פצע התא הוא אחד הפשוט ביותר. שיטה זו שימושית כדי לקבוע את יכולת הנדידה של המוני תא כולו. כאשר נלקחו צעד נוסף ניתן להשתמש בו כדי לצפות במאפיינים המורפולוגיים של התאים בודדים במהלך הנדידה ¹⁴. בעקבות הניתוח של סגירת פצע פנוטיפים רבים עשויים להתגלות. מדידת המרחק הסגור לאורך זמן בהשוואה לשליטה עשויה לחשוף שינויי הגירה ספציפיים או הפנוטיפ נודד לקוי שהיה ידוע קודם לכן. יתר על כן, היווצרות אחת lamellipodium התא, הכחשה זנב, ותנועה כיוונית עשויות לתת רמזים למה שעלול להיפגע או משופר בתאים של עניין ^14.

הגירת transwell ומבחני פלישה ניתן להשתמש כדי לנתח את היכולת של תאים בודדים להגיב directionally להכימותרפיה משיכה שונות בין אם הם כמוקינים, גורמי גדילה, שומנים, או נוקלאוטידים ^4,5,8,15,16. היא עשויה גם להעריך את יכולת נדידת ההפרש נובעת מביטוי היתר של קולטן ^1,14. גם מבחני אלה יכולים לשמש כדי לזהות ולאפיין את הרגולטורים המרכזיים של נדידת תאים כמו משפחת Rho של GTPases הקטן ^2. בעקבות קצר אלה בקלות ובaccesבדיקות sible, במצב של נדידת תאים ואת היכולת של תא לפלוש לתוך מטריצת 3-D יכולים גם להיות נחושות.

Protocol

1. Assay סגירת פצע תרבית תאים

1. ניתוק תאים מצלחת תרבית הרקמה באמצעות 0.25% פתרון טריפסין-EDTA. גלולה תאים בצינור חרוטי 15 מיליליטר על ידי צנטריפוגה, לשאוב supernatant, מחדש תאים להשעות תקשורת והתרבות. פלייט המספר המתאים של תאים בצלחת 6 היטב למפגש 100% ב24 שעות.
   הערה: ייתכן שתהיינה צורך בדיקות כדי לקבוע את הזמן ואת מספר התאים כדי להשיג מפגש 100% בשל סוג התא ואת גודל בשימוש גם (לדוגמא, 1 x 10 ⁶ B16F10 תאים מלנומה הם זורעים בטוב של צלחת 6 היטב 24 שעות לפני דור הפצע). לחלופין, ניתן להשתמש ב12 גם צלחות או 24 גם.
   הערה: אם זמין, יכולים להיות שנזרעו תאים לתוך תרבות-Insert (מLLC ibidi) על צלחת רקמת תרבות מטופלים עושה את הפצע מראש להק. תרבות-Insert יכול להגן על פני השטח של צלחת תרבית רקמה מנזק על ידי קצה פיפטה. אם תרבות-Insert משמש צעד השמט1.2.
2. בסביבת סטרילית (בדרך כלל מכסה המנוע בטיחות ביולוגי) להשתמש קצה פיפטה 200 μl ללחוץ בחוזקה נגד העליון של הצלחת בתרבית רקמה ובמהירות להפוך את פצע אנכי למטה דרך monolayer התא. קצה פיפטה בגדלים שונה ניתן להשתמש כדי להפוך את גודל הפצע שהוא רצוי. אל תשתמש בכוח מופרז נגד צלחת תרבית הרקמה עם קצה פיפטה כפי שהוא עלול לגרום נזק לפני השטח. אם הפצע הוא להק מראש, ניתן להשמיט את הצעד הזה.
3. בזהירות לשאוב תקשורת ופסולת תא. לאט לאט להוסיף מספיק תקשורת ותרבות על הקיר גם כדי לכסות את תחתית היטב ולהימנע מניתוק תאים נוספים. בעקבות הדור והבדיקה של הפצע צריכה לקחת תמונה ראשונית. מניחים את צלחת תרבית רקמה בחממה שנקבעה בטמפרטורה המתאימה וCO הריכוז ₂ (בדרך כלל 37 ° C ו 5% CO _2).
4. במספר נקודות זמן, למשל כל 3 שעות, להסיר את הצלחת מincubatאו ולמקם אותו תחת מיקרוסקופ הפוכה כדי לצלם תמונה תמונת מצב ולבדוק לסגירת פצעים. אם מיקרוסקופיה הזמן לשגות זמינה, לקחת תמונה כל מספר X של דקות (בדרך כלל מתחיל עם כל 5 דקות) לכל משך זמן בטמפרטורה _ו2 תא מבוקר CO. בהתאם לסוג התא, זמן סגירת פצע עשוי להשתנות.
5. כדי לנתח את התוצאות של תמונות תמונה, למדוד את המרחק בצד אחד של הפצע האחר באמצעות סרגל קנה מידה. לנתח וסגירת פצע באופן ברור בהווה לאורך זמן באמצעות עלילת פיזור או גרף עמודות, למשל איור 1.
6. כדי לנתח את תמונות הזמן לשגות, לייבא את התמונות לתוך תוכנת ImageJ (זמינה באופן חופשי בhttp://rsb.info.nih.gov/ij/) לעשות וידאו. כדי לעשות ImageJ הפתוח, לחץ על קובץ, יבוא, ותמונה ברצף. מצא את הקובץ עם תמונות; לחץ על התמונה הראשונה בקובץ. לשמור וידאו על ידי בחירת קובץ, שמירה בשם וAVI. תאים נודדים בודדים אפשר לראות לCharacterize תנועה כיוונית. יתר על כן, מאפיינים מורפולוגיים כגון היווצרות lamellipodia והכחשת קצה נגררת ניתן ללמוד גם כן (איור 2 ווידאו נוסף).

2. נדידת תאי Transwell ופלישת Assay

1. בסביבת סטרילית (בדרך כלל מכסה המנוע בטיחות ביולוגי) לנתק את התאים מן צלחת תרבית רקמה באמצעות חיץ אינו אנזימטית התנערות תא או 0.25% פתרון טריפסין-EDTA, תאי גלולה ידי צנטריפוגה, ולשאוב את התקשורת הקיימת עוזבת את תאי pelleted. Re-להשעות תאים בתרבית תאי תקשורת חופשית בסרום המכילה BSA 0.1% (אלבומין בסרום שור).
   הערה: בהתאם לשורת התאים נחקר 0.25% טריפסין-EDTA עלול להשפיע על נדידת תאים ופלישה בשל המחשוף של קולטנים שונים על פני תא ^17.
   שים לב: מספר התאים למ"ל תלוי בגודל של התאים. ייתכן שתהיינה צורך בבדיקות נוספות כדי למצוא את צפיפות זריעה שהפרהVides את התוצאות הטובות ביותר. בדרך כלל 1 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר הוא נקודת התחלה טובה עבור רוב סוגי תאים בעת השימוש ב24 גם transwell להוסיף. יש מגוון של גדלי transwell הכנס ואת מספר התאים הוסיפו צריכה להיות מותאם לבהתאם.
2. של פתרון תא פלייט 100 μl על גבי קרום המסנן בכנס transwell והדגירה של 10 דקות 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ כדי לאפשר לתאים להתיישב.
   הערה: הגודל הנקבובית המסוים של קרום transwell משמש תלוי בגודל הבודד של התאים במדגם. לדוגמא, אם התאים הם קטנים מדי שהם יכולים לעבור דרך הנקבוביות ללא הצורך כדי להקל על הגירה או אם הם גדולים מדי הם עשויים שלא להתאים דרך הנקבוביות. ישנם כמה מוסיף transwell עם גודל נקבובית שנעים בין 3 מיקרומטר, 5 מיקרומטר, ו8 מיקרומטר עבור מבחני נדידת תאים. מוסיף transwell זמינים מסחרי מחברות כמו קורנינג.
   שים לב: מ 'transwellassay igration ניתן לשנות בקלות לבצע את assay פלישת תא. כדי לעשות זאת, להוסיף חומרים (ECM) מטריצה ​​תאית על גבי קרום transwell ולאחר מכן להוסיף את התאים על גבי ECM. לדוגמא, Matrigel מופשר ומעובה על קרח, ולאחר מכן 30-50 μl של Matrigel מתווסף 24 גם transwell להוסיף והתגבש בחממה 37 מעלות צלזיוס למשך 15-30 דקות כדי ליצור שכבת ג'ל דקה. פתרון תא מתווסף על גבי ציפוי Matrigel כדי לדמות פלישה באמצעות מטריקס.
   שים לב: יש הבדלים ברורים בין נדידת תאי transwell ומבחני פלישת תא transwell. Assay נדידת תאי transwell מודד את יכולת chemotactic של תאים כלפי הכימותרפיה attractant. Assay פלישת תא transwell, לעומת זאת, מודד שני chemotaxis תא ואת הפלישה של תאים באמצעות מטריצה ​​תאית, תהליך שהוא נמצא בדרך כלל בהתפשטות גרורה סרטנית או התפתחות עוברית.
3. בעזרת פיפטה, מאוד carefully להוסיף 600 μl של הכימותרפיה attractant הרצויה לתוך החלק התחתון של התא התחתון בצלחת 24 גם. הוסף את הכימותרפיה attractant מבלי להזיז את הכנס transwell ולמנוע יצירת בועות. ודא את נוזל הכימותרפיה attractant בבאר התחתונה במגע עם הקרום בבאר העליונה כדי ליצור שיפוע chemotactic. זמן דגירה תלוי בסוג התא והכימותרפיה attractant בשימוש.
   הערה: ייתכן שתהיינה צורך בדיקות נוספות על מנת לקבוע את תקופת הדגירה.
   הערה: תאים חסיד, התאים נדדו יצרפו לצד השני של הקרום ^1,8 האחר. כימות של תאים נדדו יכולה להתבצע בעקבות צעדי 2.4-2.8 (שלבים 2.4-2.8 לא צריכה להתבצע בסביבת סטרילית). לתאים שאינם חסיד, התאים נדדו יירד לתקשורת בתא התחתון. מספר התאים נדדו ניתן לספור באמצעות hemocytometer או זרימת cytometer ^5.
4. הסר את תוסף transwell מהצלחת. השתמש המוליך כותנה שקצה כמספר פעמים הדרוש כדי להסיר בזהירות את התקשורת ותאים הנותרים שלא היגר מהחלק העליון של הקרום ללא פגיעה בו.
5. הוספת 600-1,000 μl של 70% אתנול לתוך באר של צלחת 24 גם. במקום להכניס transwell לתוך אתנול 70% ל10 דקות כדי לאפשר קיבוע תא. הסר transwell להכניס מצלחת 24 היטב ולהשתמש במוליך כותנה שקצה כדי להסיר אתנול שנותר מהחלק העליון של הקרום. לאפשר קרום transwell לייבוש (בדרך כלל 10-15 דקות).
6. הוספת 600-1,000 μl של .0.2% סגולים גביש לתוך באר של צלחת 24 גם ולמקם את הקרום לתוכו מכתימה. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5-10 דקות.
7. להסיר בעדינות סגולה גביש מהחלק העליון של הקרום עם קצה פיפטה או המוליך כותנה שקצהו. בזהירות רבה, כדי למנוע כביסה את התאים קבועים, טובל את הקרום למים מזוקקים כמספר פעמים הדרוש כדי להסיר את גלאים גביש העודפיםלא. לאפשר קרום transwell לייבוש.
8. צפו מתחת מיקרוסקופ הפוכה ולספור את מספר התאים בשדות מבט שונים כדי לקבל סכום ממוצע של תאים שהגרו דרך הממברנה לכיוון הכימותרפיה attractant ומחוברים בחלקו התחתון של הקרום (איור 3).

תוצאות

Assay פצע הסגר וassay נדידת תאי transwell מוצג כאן בוצעו באמצעות תאים מלנומה B16F10 העכבר כמודל למערכת. ב assay סגירת פצע, B16F10 תאי זרע בצלחת תרבית רקמת 6 היטב ומבוגר כדי מפגש 100% ב24 שעות. פצע של רחב כ 700 מיקרומטר נוצר באמצעות פיפטה קצה וסגירת הפצע (נדידת תאים) נרשם באמצעות מיקרוסקופיה הז...

Discussion

נדידת תאים היא היבט חשוב ללמוד בחקר סרטן וזה יכול להיות מיושם גם ללימודי ריפוי התפתחותיים, חיסוניים ופצע. תרבית התאים בסופו של assay סגר ומבחני נדידת תאי transwell והפלישה לחשוף מידע מפורט של התנהגויות נדידת תאים ויכולים לשמש כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של תא הגירה <...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Gibco	11995-073
Fetal bovine serum (FBS)	Gemini	100106
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503-50G
Trypsin EDTA 0.25%	Gibco	25200-056
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS)	Gibco	14190-250
Crystal violet	Sigma	C0775-100G	Dissolved in water at 0.2%
Cell disassociation buffer	Gibco	13151-014
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific		Model # 3145
SterilGARD biosafety hood	The Baker Company, Inc.		Model # VBM-600
EVOS Fl inverted microscope	Thermo Fisher Scientific		Model # AMF-4302-US
Tissue culture plate	Becton Dickinson	353046	Catalog number varies depending on the type of culture plate
Corning Transwell insert	Fisher	07-200-150	Catalog number varies depending on the pore size of the membrane