Dans la migration cellulaire in vitro et Invasion dosages

Résumé

Couramment utilisés, des méthodes très accessibles pour examiner la migration cellulaire et l'invasion in vitro sont décrits. La première méthode est la fermeture de la plaie dosage de cellules qui mesure la motilité cellulaire. La deuxième méthode est la migration et l'invasion essai transwell qui évalue la capacité chimiotactique et invasif des cellules.

Résumé

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

Introduction

La motilité est une caractéristique essentielle de cellules vivantes. La migration cellulaire est impliquée dans la conception de la vie, le développement embryonnaire, la réponse immunitaire, et de nombreux processus pathologiques, tels que les métastases du cancer et l'inflammation ^9.1. Par conséquent, les méthodes pour étudier le comportement migratoire cellule sont des outils de recherche très utiles pour un large éventail de disciplines en sciences biomédicales, biologie, bio-ingénierie, et des domaines connexes.

L'étude de la migration cellulaire dans la recherche sur le cancer est d'un intérêt particulier comme la principale cause de décès chez les patients atteints de cancer est lié à la progression métastatique. Pour le cancer de se propager et diffuser dans tout le corps, les cellules cancéreuses doivent migrer et envahir par la matrice extracellulaire (ECM), intravasate dans la circulation sanguine, attacher à un site distant, et enfin s'extravaser pour former foyers distants ^1,10-12. Diverses méthodes biologiques peuvent être utilisés pour étudier ces événements en détail. La culture cellulaire enroulé une fermetured la migration transwell et d'invasion des essais sont largement utilisés dans la communauté scientifique ^1,10. Ces tests peuvent fournir les données nécessaires pouvant permettre une compréhension de la façon dont un type cellulaire particulier peut spontanément migrer ou répondre à une chimio-attractif et directionnelle migrer vers elle. Plusieurs phénotypes migratoires ont été décrits. Les cellules peuvent migrer dans une forme de cellule unique tel que vu dans mésenchymateuses ou mouvement amiboïde comme ou par le mouvement multicellulaire marqué la migration ou de la cellule collective streaming ^13. Procédé de mouvement utilisée dans les cellules mobiles peut être facilement observée à l'aide de la culture cellulaire essai de fermeture de plaie.

Parmi les nombreuses façons d'étudier la migration cellulaire, l'essai de fermeture de plaie de la cellule est l'un des plus simples. Cette méthode est utile pour déterminer la capacité de migration des masses de cellules entières. Lorsque franchi une nouvelle étape, il peut être utilisé pour observer les caractéristiques morphologiques de cellules individuelles pendant la migration ¹⁴. Suite à l'analyse de la fermeture de la plaie de nombreux phénotypes peuvent être révélés. Mesure de la distance fermé au fil du temps lorsque l'on compare à un contrôle peut révéler des changements de migration spécifiques ou un phénotype migratoire avec facultés affaiblies qui était inconnu auparavant. En outre, seule la formation de lamellipode cellulaire, la queue rentrée, et le mouvement directionnel peuvent donner des indices pour ce qui peut être altérée ou renforcée dans les cellules d'intérêt ^14.

La migration des dosages transwell et d'invasion peuvent être utilisées pour analyser la capacité des cellules à répondre de manière directionnelle simples à divers chimio-attractants si elles sont des chimiokines, des facteurs de croissance, des lipides, ou des nucléotides ^4,5,8,15,16. On peut également évaluer la capacité migratoire différentielle due à la surexpression d'un récepteur de ^1,14. Ces dosages peuvent également être utilisées pour identifier et caractériser les régulateurs clés de la migration cellulaire, tels que la famille Rho des petites GTPases ^2. Suite à ces court et facilement accessibles essais, le mode de la migration cellulaire et la capacité d'une cellule à envahir en une matrice 3-D peuvent également être déterminées.

Protocole

1. Culture cellulaire fermeture de la plaie Assay

1. Détacher les cellules de la plaque de culture de tissu en utilisant 0,25% de solution de trypsine-EDTA. cellules à granules dans un tube conique de 15 ml par centrifugation, aspirer le surnageant et les cellules dans un milieu de culture re-suspension. Plate le nombre approprié de cellules dans une plaque à 6 puits à 100% de confluence dans les 24 heures.
   Remarque: Les essais peuvent être nécessaires pour déterminer le moment et le nombre de cellules d'atteindre 100% de confluence en raison du type de cellule et de la taille de l'être bien utilisée (par exemple, 1 x 10 ⁶ cellules B16F10 de mélanomes sont ensemencées dans un puits d'une plaque à 6 puits 24 heures avant la génération de la plaie). En variante, des plaques à 12 puits ou à 24 puits peuvent être utilisées.
   Remarque: Si possible, les cellules peuvent être ensemencées dans une culture-insertion (à partir LLC ibidi) sur un tissu plaque de culture traité faisant la plaie pré-coulé. Une culture-Insert peut protéger la surface de la plaque de culture de tissu des dommages causés par l'embout de pipette. Si une culture-Insérer permet pas omettre le1.2.
2. Dans un environnement stérile (généralement une hotte de sécurité biologique), utilisez une pointe de pipette 200 ul d'appuyer fermement contre le haut de la plaque de culture de tissus et de faire rapidement une plaie verticale à travers la monocouche cellulaire. Un embout de pipette de taille différente peut être utilisée pour rendre la taille de la plaie que l'on souhaite. Ne pas utiliser une force excessive contre la plaque de culture de tissu avec la pointe de la pipette, cela pourrait endommager la surface. Si la plaie est pré-coulé, cette étape peut être omise.
3. Aspirer délicatement les médias et les débris cellulaires. Lentement, ajouter suffisamment de milieux de culture contre la paroi du puits pour couvrir le fond du puits et éviter détacher des cellules supplémentaires. Suite à la génération et à l'inspection de la plaie une image initiale doit être prise. Placer la plaque de culture tissulaire dans un incubateur réglé à la température appropriée et la concentration de CO ₂ (typiquement 37 ° C et 5% CO _2).
4. À plusieurs moments, par exemple toutes les 3 heures, retirer la plaque du incubatou et le placer sous un microscope inversé pour prendre une photo de l'instantané et de vérifier la fermeture de la plaie. Si la microscopie time-lapse est disponible, prendre une photo tous les X minutes (généralement à partir de toutes les 5 minutes) pour une durée de temps dans une température et CO ₂ chambre contrôlée. Selon le type cellulaire, le temps de fermeture de plaie peut varier.
5. Pour analyser les résultats de l'instantané des photos, mesurer la distance d'un côté de la plaie à l'autre en utilisant une barre d'échelle. Analyser et bien présents fermeture de la plaie au cours du temps en utilisant un nuage de points ou graphique à barres, par exemple, la figure 1.
6. Pour analyser les photos time-lapse, importer les photos dans le logiciel ImageJ (disponible gratuitement à http://rsb.info.nih.gov/ij/) à faire une vidéo. Pour ce faire, ImageJ ouvert, cliquez sur Fichier, Importer, et une séquence d'images. Trouver le fichier avec des images; cliquez sur la première photo dans le fichier. Enregistrement de vidéos en sélectionnant Fichier, Enregistrer sous, et AVI. Cellules migrantes simples peuvent être observés à characterize mouvement directionnel. En outre, les caractéristiques morphologiques telles que la formation de lamellipodes et bord de fuite de rétraction peuvent être étudiées ainsi (Figure 2 et vidéo supplémentaire).

2. Transwell migration cellulaire et l'invasion de dosage

1. Dans un environnement stérile (typiquement une hotte de biosécurité) détacher les cellules de la plaque de culture de tissu en utilisant un tampon non-enzymatique de dissociation de cellules ou de 0,25% de solution de trypsine-EDTA, un culot de cellules par centrifugation, et aspirer le support existant en laissant le culot cellulaire. Re-suspendre les cellules dans des milieux de culture cellulaire sans sérum contenant 0,1% de BSA (albumine de sérum bovin).
   Remarque: En fonction de la lignée cellulaire étant étudiée 0,25% de trypsine-EDTA peut influer sur la migration et l'invasion cellulaire en raison de la coupure de différents récepteurs sur la surface de la cellule ^17.
   Note: Le nombre de cellules par ml dépend de la taille des cellules. D'autres tests peuvent être nécessaires pour trouver une densité de semis que proVides les meilleurs résultats. Typiquement 1 x 10 ⁶ cellules / ml est un bon point de départ pour la plupart des types de cellules en utilisant la 24 puits TRANSWELL insérer. Il existe une gamme de transwell tailles de plaquettes et le nombre de cellules ajoutées doit être ajustée en conséquence.
2. Plaque 100 pl de solution de cellules sur le dessus de la membrane filtrante dans un insert Transwell et incuber pendant 10 minutes à 37 ° C et 5% _de CO2 pour permettre aux cellules de se déposer vers le bas.
   Remarque: La taille des pores particulière de la membrane Transwell utilisée dépend de la taille individuelle des cellules dans l'échantillon. Par exemple, si les cellules sont trop petites, elles peuvent passer à travers les pores sans la nécessité de faciliter la migration ou s'ils sont trop gros, ils peuvent ne rentre pas par les pores. Il existe plusieurs inserts Transwell avec des tailles de pores allant de 3 um, 5 pm et 8 pm pour des essais de migration cellulaire. Les inserts Transwell sont disponibles commercialement auprès des sociétés telles que Corning.
   Remarque: Le transwell mdosage de igrations peut être facilement modifié pour réaliser le dosage de l'invasion cellulaire. Pour ce faire, ajoutez la matrice extracellulaire (ECM) des matériaux sur le dessus de la membrane transwell puis ajouter les cellules au-dessus de l'ECM. Par exemple, le Matrigel est décongelé sur de la glace et liquéfié, puis de 30 à 50 ul de Matrigel est ajouté à un 24 puits transwell insérer et solidifié dans un incubateur à 37 ° C pendant 15 à 30 minutes pour former une couche mince de gel. Cell solution est ajoutée sur le dessus de la couche de Matrigel pour simuler invasion à travers la matrice extracellulaire.
   Remarque: Il ya des différences entre la migration des cellules transwell et les essais d'invasion de cellules transwell. La détermination de la migration cellulaire Transwell mesure la capacité chimiotactique des cellules vers un chimio-attractant. Le dosage de l'invasion de cellules Transwell, cependant, mesure à la fois la chimiotaxie de cellules et l'invasion des cellules à travers la matrice extracellulaire, un processus qui se trouve couramment dans les métastases du cancer ou du développement embryonnaire.
3. Avec une pipette, très atmosully ajouter 600 ul de la chimio-attractant souhaitée dans le fond de la chambre inférieure dans une plaque à 24 puits. Ajouter la chimio-attractif sans déplacer l'insert transwell et éviter de générer des bulles. Assurez-vous que le liquide de chimio-attractant dans le fond du puits est en contact avec la membrane dans le puits supérieur afin de former un gradient chimiotactique. Le temps d'incubation dépend du type de cellule et la chimio-attractant est utilisé.
   Note: D'autres essais peuvent être nécessaires pour déterminer la période d'incubation.
   Remarque: Pour les cellules adhérentes, les cellules ayant migré se fixer sur l'autre côté de la membrane ^1,8. La quantification des cellules ayant migré peut être effectuée en suivant les étapes 2.4 à 2.8 (2.4 à 2.8 étapes n'ont pas besoin d'être exécuté dans un environnement stérile). Pour les cellules non-adhérentes, les cellules ayant migré vont baisser dans les médias à la chambre basse. Le nombre de cellules ayant migré peut être compté en utilisant un hémocytomètre ou cytomètre en flux ^5.
4. Retirez le cache du transwell de la plaque. Utilisez un coton-tige autant de fois que nécessaire pour retirer soigneusement les médias et les cellules restantes qui n'ont pas migré à partir du haut de la membrane sans l'endommager.
5. Ajouter 600-1,000 ul d'éthanol à 70% dans un puits d'une plaque de 24 puits. Placer l'insert Transwell dans l'éthanol à 70% pendant 10 minutes pour permettre la fixation des cellules. Retirer transwell insert de la plaque de 24 puits et utiliser un coton-tige pour enlever le reste d'éthanol à partir du haut de la membrane. Laisser la membrane transwell sécher (en général 10-15 minutes).
6. Ajouter 600-1,000 ul de 0,2% de cristal violet dans un puits d'une plaque à 24 puits et la position de la membrane en elle pour la coloration. Incuber à température ambiante pendant 5 à 10 minutes.
7. Retirez délicatement le cristal violet du haut de la membrane avec une pointe de pipette ou coton applicateur incliné. Très soigneusement, pour éviter de rincer les cellules fixes, tremper la membrane dans de l'eau distillée autant de fois que nécessaire pour éliminer les cristaux viole excèst. Laisser la membrane transwell sécher.
8. Vue sous un microscope inversé et compter le nombre de cellules dans les différents champs de vision pour obtenir une somme moyenne de cellules qui ont migré à travers la membrane vers le chimio-attractant et fixés sur la face inférieure de la membrane (Figure 3).

Résultats

L'essai de fermeture de plaie et la détermination de la migration cellulaire Transwell présentées ici ont été effectuées en utilisant des cellules de souris B16F10 de mélanome comme un système modèle. Dans l'essai de fermeture de plaie, B16F10 cellules ont été ensemencées dans une plaque de culture tissulaire à 6 puits et cultivées jusqu'à 100% de confluence dans les 24 heures. Une plaie d'environ 700 um de large a été générée à l'aide d'une pointe de pipette et la fermeture ...

Discussion

La migration cellulaire est un aspect important d'étudier en recherche sur le cancer et il peut également être appliquée à des études de guérison de développement, immunologiques et la plaie. La culture cellulaire enroulé essai de fermeture et la migration des cellules transwell et invasion tests révèlent des informations détaillées sur les comportements migratoires des cellules et peut être utilisée pour étudier les mécanismes moléculaires de la migration des cellules ^1,2,10,14. Notre ?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Gibco	11995-073
Fetal bovine serum (FBS)	Gemini	100106
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503-50G
Trypsin EDTA 0.25%	Gibco	25200-056
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS)	Gibco	14190-250
Crystal violet	Sigma	C0775-100G	Dissolved in water at 0.2%
Cell disassociation buffer	Gibco	13151-014
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific		Model # 3145
SterilGARD biosafety hood	The Baker Company, Inc.		Model # VBM-600
EVOS Fl inverted microscope	Thermo Fisher Scientific		Model # AMF-4302-US
Tissue culture plate	Becton Dickinson	353046	Catalog number varies depending on the type of culture plate
Corning Transwell insert	Fisher	07-200-150	Catalog number varies depending on the pore size of the membrane