Na migração celular in vitro e invasão Ensaios

Resumo

Comumente usado, são descritos métodos altamente acessíveis para analisar a migração celular e invasão in vitro. O primeiro método é o ensaio de encerramento de feridas de células que mede a mobilidade celular. O segundo método é o ensaio de migração e invasão transwell que avalia o quimiotáctica e capacidade invasiva de células.

Resumo

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

Introdução

Motilidade é uma característica essencial de células vivas. A migração celular está envolvido na concepção de vida, o desenvolvimento embrionário, a resposta imunitária, e muitos processos patológicos, tais como a metástase do cancro e inflamação ^1-9. Portanto, métodos para estudar o comportamento migratório das células são ferramentas de pesquisa muito útil para uma vasta gama de disciplinas em ciências biomédicas, biologia, bioengenharia, e áreas afins.

O estudo da migração de células na pesquisa do câncer é de particular interesse como a principal causa de morte em pacientes com câncer está relacionado à progressão metastática. Para que o câncer se espalhar e disseminar por todo o corpo, as células cancerosas devem migrar e invadir através da matriz extracelular (ECM), intravasate em circulação no sangue, anexar a um local distante, e, finalmente, extravasar para formar focos distantes ^1,10-12. Vários métodos biológicos podem ser utilizados para estudar estes eventos em detalhe. A cultura de células ferida fechado umd a migração e invasão transwell ensaios são amplamente utilizados na comunidade científica ^1,10. Estes testes podem fornecer os dados necessários que possam permitir uma compreensão de como um tipo particular de célula podem migrar espontaneamente ou responder a uma quimioterapia atrativo e direcionalmente migrar em direção a ela. Vários fenótipos migradores foram descritos. As células podem migrar de uma forma única célula, como visto em mesenquimais ou movimento amebóide-like ou pelo movimento multicelular rotulado migração coletiva ou célula streaming de ^13. O método de movimento usado em células móveis podem ser facilmente observado utilizando o ensaio de encerramento de feridas de cultura de células.

Entre as várias formas de estudar a migração de células, o ensaio de encerramento de feridas de células é um dos mais simples. Este método é útil para determinar a capacidade de migração de massas de células inteiras. Quando mais um passo que pode ser usado para observar as características morfológicas da célula individual durante a migração ¹⁴. Após a análise do fechamento da ferida muitos fenótipos pode ser revelado. Medindo a distância fechado ao longo do tempo, quando comparado com um controle pode revelar alterações de migração específica ou um fenótipo migratório prejudicada que era desconhecida anteriormente. Além disso, a formação única lamellipodium celular, cauda retração, e movimento direcional pode dar pistas para o que pode ser prejudicada ou melhorada nas células de interesse ^14.

A migração transwell e ensaios de invasão pode ser utilizada para analisar a capacidade das células individuais para responder direcionalmente para vários quimio-atractores se são quimiocinas, factores de crescimento, lípidos, ou nucleótidos ^4,5,8,15,16. Pode também avaliar a capacidade migratória diferencial devido à sobre-expressão de um receptor de ^1,14. Estes ensaios também pode ser utilizado para identificar e caracterizar os reguladores-chave da migração de células tais como a família Rho de GTPases pequenas ^2. Na sequência destes curto e de fácil acetestes veis, o modo de migração celular e a capacidade de uma célula para invadir numa matriz 3-D também pode ser determinada.

Protocolo

1. Cultura Celular Wound Encerramento Assay

1. Separar as células a partir da placa de cultura de tecido usando 0,25% de solução de tripsina-EDTA. Células de pellets em um tubo de 15 ml por centrifugação, aspirar o sobrenadante e as células em meios de cultura re-suspensão. Placa o número adequado de células em uma placa de 6 poços para 100% de confluência em 24 horas.
   Nota: Os testes podem ser necessários para determinar o tempo e o número de células para atingir 100% de confluência devido ao tipo de célula e a dimensão do bem a ser utilizado (por exemplo, 1 x 10 ⁶ B16F10 células de melanoma são semeadas em um poço de uma 6 poços da placa, 24 horas antes da geração da ferida). Alternativamente, pode ser utilizado de 12 poços ou de 24 poços, placas.
   Nota: Se estiver disponível, as células podem ser semeadas em uma cultura de inserção (a partir de LLC Ibidi) em uma placa de cultura de tecidos tratados fazendo a ferida pré-fundido. Uma cultura-inserção pode proteger a superfície da placa de cultura de tecido de danos por a ponta da pipeta. Se uma Cultura-Insert é usado passo omitir1.2.
2. Em um ambiente estéril (tipicamente um capuz biossegurança) utilizar uma pipeta de ponta de 200 ul para pressionar firmemente contra o topo da placa de cultura de tecidos e fazer rapidamente uma ferida vertical descendente através da monocamada de células. Uma ponta de pipeta de tamanho diferente podem ser usadas para reduzir o tamanho da ferida, que é desejado. Não use força excessiva contra a placa de cultura de tecidos com a ponta da pipeta, pois pode danificar a superfície. Se a ferida é pré-fundido, este passo pode ser omitido.
3. Aspirar cuidadosamente a mídia e os restos celulares. Lentamente, adicionar meios de cultura suficiente contra a parede do poço para cobrir o fundo do poço e evitar separar células adicionais. Após a geração e inspeção da ferida uma visão inicial devem ser tomadas. Colocar a placa de cultura de tecidos numa incubadora à temperatura adequada e concentração de CO ₂ (tipicamente 37 ° C e 5% CO _2).
4. Em vários momentos, por exemplo, a cada 3 horas, retire a placa da incubatou e colocá-lo sob um microscópio invertido para tirar uma foto instantâneo e para verificar o fechamento da ferida. Se microscopia de lapso de tempo está disponível, tirar uma foto a cada X número de minutos (normalmente começando com a cada 5 minutos) para qualquer duração de tempo em uma temperatura e CO ₂ câmara controlada. Dependendo do tipo de célula, o tempo de fechamento da ferida pode variar.
5. Para analisar os resultados de imagens em fotografias, medir a distância de um lado da ferida para o outro usando uma barra de escala. Analisar e claramente presente o fechamento da ferida ao longo do tempo através de um gráfico de dispersão ou gráfico de barras, por exemplo, Figura 1.
6. Para analisar o lapso de tempo imagens, importar as fotos para o software ImageJ (disponível gratuitamente no http://rsb.info.nih.gov/ij/) para fazer um vídeo. Para fazer isso ImageJ aberto, clique em Arquivo, Importar e, em sequência de imagens. Localize o arquivo com as imagens; clique na primeira foto no arquivo. Salve vídeo, escolhendo Arquivo, Salvar como, e AVI. Células migratórias individuais podem ser observadas a characterize movimento direcional. Além disso, as características morfológicas, tais como formação lamellipodia e arrastando retração da borda podem ser estudados, bem como (Figura 2 e de vídeo suplementar).

2. Transwell migração celular e invasão de Ensaio

1. Em um ambiente estéril (tipicamente um capuz biossegurança) separar as células da placa de cultura de tecido usando um tampão de dissociação não enzimática de células ou 0,25% de solução de tripsina-EDTA, as células por centrifugação, e aspirar os meios de comunicação existente deixando as células peletizadas. Re-suspender as células em meio de cultura celular livre de soro contendo 0,1% de BSA (albumina sérica bovina).
   Nota: Dependendo da linhagem de células a ser investigado 0,25% Tripsina-EDTA pode afectar a migração celular e invasão devido à clivagem de diversos receptores na superfície das células ^17.
   Nota: o número de células por ml depende do tamanho das células. Podem ser necessários mais testes para descobrir a densidade de semeadura que provides os melhores resultados. Normalmente 1 x 10 ⁶ células / ml é um bom ponto de partida para a maioria dos tipos de células ao usar a 24 poços transwell inserir. Existe uma gama de tamanhos de pastilhas transwell e o número de células adicionadas deve ser ajustado em conformidade para.
2. Placa de 100 ul de solução de células no topo da membrana de filtro em um transwell insert e incubar durante 10 minutos a 37 ° C e 5% de _CO2 para permitir que as células se estabelecer.
   Nota: O tamanho específico dos poros da membrana Transwell utilizado é dependente do tamanho individual das células na amostra. Por exemplo, se as células forem muito pequenas que podem passar através dos poros, sem a necessidade de facilitar a migração ou se elas forem muito grandes não podem passar através dos poros. Existem várias inserções Transwell com tamanho de poro que variam de 3 mM, 5 mM, e 8 mm para os ensaios de migração celular. As inserções Transwell estão comercialmente disponíveis a partir de companhias tais como a Corning.
   Nota: O transwell migration ensaio pode ser facilmente modificado para realizar o ensaio de invasão celular. Para fazer isso, adicionar matriz extracelular (ECM) materiais na parte superior da membrana transwell e depois adicionar células no topo da ECM. Por exemplo, Matrigel é descongelado em gelo e liquefeito, e, em seguida, 30-50 mL de Matrigel é adicionada a um 24 bem transwell inserir e solidificado numa incubadora a 37 ° C durante 15-30 minutos de modo a formar uma fina camada de gel. Solução de células é adicionado no topo do revestimento de Matrigel para simular invasão através da matriz extracelular.
   Nota: Existem diferenças distintas entre a migração de células transwell e os ensaios de invasão celular transwell. O ensaio de migração celular transwell mede a capacidade quimiotática de células em direção a um quimio-atrativo. O ensaio de invasão celular transwell, no entanto, medidas, tanto a quimiotaxia de células ea invasão das células através da matriz extracelular, um processo que é comumente encontrada em metástase do câncer ou o desenvolvimento embrionário.
3. Com uma pipeta, muito carefully adicionar 600 ul do quimio-atractor desejado na parte inferior da câmara inferior de uma placa de 24 poços. Adicione o quimio-atrativo, sem mover a inserção transwell e evitar a geração de bolhas. Certifique-se de que o líquido quimio-atractor no poço inferior entra em contacto com a membrana na parte superior do poço, para formar um gradiente quimiotáctica. O tempo de incubação está dependente do tipo de célula e do quimio-atractor de ser utilizado.
   Nota: podem ser necessários mais testes para determinar o período de incubação.
   Nota: Para as células aderentes, as células que migraram vai anexar o outro lado da membrana de ^1,8. A quantificação de células que migraram pode ser realizado seguindo os passos 2,4-2,8 (2,4-2,8 passos não necessitam de ser realizadas num ambiente estéril). Para as células não aderentes, as células migraram vai cair na mídia na câmara baixa. O número de células que migraram podem ser contadas usando um hemocitómetro ou citómetro de fluxo ^5.
4. Remova a inserção da placa transwell. Use um aplicador com ponta de algodão quantas vezes for necessário para remover cuidadosamente a mídia e as células restantes que não migraram a partir do topo da membrana sem danificá-lo.
5. Adicionar 600-1.000 ul de etanol a 70% dentro de um poço de uma placa de 24 poços. Coloque a inserção transwell em etanol a 70% durante 10 minutos, para permitir a fixação das células. Retirar transwell insert a partir da placa de 24 poços e utilizar um aplicador com ponta de algodão para remover o etanol remanescente a partir da parte superior da membrana. Permitir que a membrana transwell para secar (tipicamente 10-15 minutos).
6. Adicionar 600-1.000 ul de 0,2% de violeta de cristal em um poço de uma placa de 24 poços e posicionar a membrana em que para a coloração. Incubar à temperatura ambiente durante 5-10 minutos.
7. Suavemente remover o violeta cristal a partir do topo da membrana com uma ponta de pipeta ou aplicador com ponta de algodão. Com muito cuidado, para evitar lavar as células fixas, mergulhe a membrana em água destilada como quantas vezes for necessário para remover o excesso viole cristalt. Permitir que a membrana Transwell para secar.
8. Vista sob um microscópio invertido e contar o número de células em diferentes campos de visão, para obter um valor médio de células que migraram através da membrana para a quimio-atractor e ligados no lado inferior da membrana (Figura 3).

Resultados

O ensaio de encerramento de feridas e no ensaio de migração de células Transwell aqui apresentados foram realizadas utilizando células de melanoma de ratinho B16F10 como um sistema modelo. No ensaio de encerramento de feridas, B16F10 células foram semeadas numa placa de 6 poços de cultura de tecidos e crescidas até 100% de confluência em 24 horas. Uma ferida de aproximadamente 700 m de largura foi gerada usando uma ponteira eo fechamento da ferida (migração de células) foi gravado usando a microscopia de laps...

Discussão

A migração celular é um aspecto importante para estudar na pesquisa do câncer e também pode ser aplicado a estudos de cura de desenvolvimento, imunológicos e ferida. O ensaio de cultura de células de feridas e de fecho da migração celular e invasão transwell ensaios de revelar a informação detalhada do comportamento migratório das células e pode ser utilizado para investigar os mecanismos moleculares da migração celular ^1,2,10,14. Nosso estudo utilizou estes testes de motilidade celular para d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Gibco	11995-073
Fetal bovine serum (FBS)	Gemini	100106
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503-50G
Trypsin EDTA 0.25%	Gibco	25200-056
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS)	Gibco	14190-250
Crystal violet	Sigma	C0775-100G	Dissolved in water at 0.2%
Cell disassociation buffer	Gibco	13151-014
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific		Model # 3145
SterilGARD biosafety hood	The Baker Company, Inc.		Model # VBM-600
EVOS Fl inverted microscope	Thermo Fisher Scientific		Model # AMF-4302-US
Tissue culture plate	Becton Dickinson	353046	Catalog number varies depending on the type of culture plate
Corning Transwell insert	Fisher	07-200-150	Catalog number varies depending on the pore size of the membrane