在体外细胞迁移和侵袭实验

摘要

常用的，非常方便的方法研究细胞迁移和侵袭的体外描述。第一种方法是测量细胞运动的细胞伤口愈合测定法。第二种方法是，评估的趋化和细胞的侵袭能力Transwell小迁移和侵袭实验。

摘要

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

引言

蠕动是活细胞的一个重要特征。细胞迁移是参与生命，胚胎发育，免疫反应，以及许多病理过程，如癌症转移和炎症^1-9的概念。因此，方法来研究细胞的迁徙行为是非常有用的研究工具，在生物医学科学，生物学，生物工程及相关领域学科门类齐全的。

在癌症研究中的细胞迁移的研究是特别感兴趣，因为死亡的癌症患者的主要原因是关系到转移进程。为了让癌细胞扩散和传播遍及全身，癌细胞必须迁移和入侵，通过细胞外基质（ECM），intravasate进入血液循环，连接到一个远程站点，最后渗出，形成远处病灶^1,10〜12。各种生物的方法可以用来详细研究这些事件。细胞培养伤口闭合的D中的Transwell小迁移和入侵检测被广泛应用于科学界^1,10。这些测试可以提供必要的数据，可能会允许对如何以及特定细胞类型可以自发地迁移或响应一个化疗诱和定向朝向其迁移的理解。几个迁徙的表型进行了说明。细胞可以迁移见于间质或变形虫样运动或标记的集体迁移或细胞流¹³多细胞运动的单细胞形式如。在游动细胞用于运动的方法，可以使用细胞培养物的伤口闭合测定法可以容易地观察到。

在众多的方法来研究细胞迁移，细胞伤口缝合法是最简单的一种。这种方法可用于确定整个细胞团的迁移能力。时采取的一个步骤进一步它可以用于迁移¹⁴时，观察各个细胞的形态特征。随着伤口闭合的分析很多表型可能显露出来。比较控件时测量近距离随着时间的推移可能会发现特定迁移量的变化或受损迁徙的表型是前所未知的。此外，单细胞lamellipodium形成，尾部回缩，并定向运动可能会给什么可能会削弱或增强的利息¹⁴细胞的线索。

Transwell小迁移和侵袭测定法可用于分析单个细胞的定向到不同的化疗诱响应它们是否是趋化因子，生长因子，脂质，或核苷酸^4,5,8,15,16的能力。它也可以评估差分迁移能力因过度表达的受体^1,14的。这些测定法还可以用于鉴定和表征细胞迁移的关键调节剂，如Rho家族的小GTP酶^2。下面的这些短且容易存取权限sible测试中，细胞迁移的模式和小区的侵入成三维基质的能力也可以被确定。

研究方案

1，细胞培养伤口闭合含量

1. 使用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液中的组织培养板中分离细胞。沉淀的细胞在15毫升锥形管中，离心，吸出上清液，并重新悬浮的细胞在培养基中。铠细胞在6孔板的适当数量为在24小时内100％汇合。
   注意:测试可能需要确定时间和细胞数达到100％汇合时，由于细胞的类型和该井所使用的大小（例如，1×10 ⁶ B16F10黑素瘤细胞接种在一个良好的6孔板前24小时至伤口代）。可替换地，可以使用12孔或24孔板中。
   注:如果可用，细胞可在处理过的细胞培养板使得伤口预铸被接种到文化 - 插入（从ibidi有限责任公司）。文化 - 插入可以通过枪头保护组织培养板的表面不受损坏。如果一个企业文化 - 插入时忽略步骤1.2。
2. 在无菌的环境（通常是生物安全罩）用200μl的移液管尖，以牢固地压在组织培养板的顶部，并通过细胞单层迅速地使一个垂直向下的伤口。不同尺寸的移液管尖端可以用来使所期望的伤口大小。不要过度使用武力的组织培养板吸头，因为它会损坏表面。如果伤口预铸，该步骤可以省略。
3. 小心吸媒体和细胞碎片。慢慢地对孔壁，以覆盖所述孔的底部，并避免额外的分离的细胞补充足够的培养基。以下伤口的产生和检测的初始图象，应采取。将组织培养板在培养箱中设定在适当的温度和CO ₂浓度（通常为37℃和5％CO _2）。
4. 在几个时间点， 例如每3小时从incubat除去板或者，并将其放置在倒置显微镜下拍摄快照的图片，并检查伤口闭合。如果时间推移显微镜可用，拍照分钟的每隔X数量（通常以每5分钟为单位）持续时间在温度和CO ₂控制腔。取决于细胞类型，伤口闭合的时间可能会发生变化。
5. 要分析的快照图片的结果，测量在伤口的一侧到另一使用比例尺的距离。用散点图或条形图， 例如 图1分析，并明确目前伤口闭合随着时间的推移。
6. 为了分析时间推移的图片，导入图片到ImageJ的软件（可自由查看的http://rsb.info.nih.gov/ij/）进行视频。要做到这一点打开ImageJ的，点击文件，导入，和图像序列。找到图片文件;单击该文件中的第一张照片。保存视频选择文件，另存为，和AVI。单个细胞的迁移可观察到恰拉cterize定向运动。此外，形态特征，如伪足形成和后缘回缩可以研究以及（ 图2和辅助视频）。

2，Transwell小细胞迁移和入侵检测

1. 在无菌的环境（通常是生物安全罩）使用离心非酶细胞解离缓冲液，或0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液中，沉淀的细胞分离的组织培养板中的细胞，并吸出的现有媒体留下沉淀的细胞。重悬的细胞在含有0.1％BSA（牛血清白蛋白）的无血清的细胞培养基。
   注意:根据该细胞系被调查的0.25％胰蛋白酶-EDTA会影响细胞迁移和侵袭由于各种受体在细胞表面¹⁷的切割。
   注意:每毫升的细胞数依赖于细胞的大小。进一步的测试，可能需要发现亲的接种密度志愿组织的最佳效果。通常为1×10 ^6个细胞/毫升是一个很好的起点，大多数细胞类型，当使用24孔Transwell插入。有一系列的transwell插入物的大小并增加细胞的数量应调整为相应。
2. 板100μl的细胞溶液在一个Transwell小插入过滤膜的顶部，并孵育10分钟，在37℃和5％CO _2，以使细胞沉淀下来。
   注意:使用的transwell小室的膜的特定细孔径是依赖于细胞的样品中的各个尺寸。例如，如果该细胞是太小它们可以穿过的孔，而不需要促进迁移，或者如果它们太大，他们可能没有通过毛孔适合。有几个的transwell插入物与孔径大小的范围从3微米，5微米，8微米的用于细胞迁移测定。 Transwell小刀片是可商购自例如康宁公司。
   注:Transwell小米igration分析可以很容易地修改，以执行细胞侵袭实验。要做到这一点，添加细胞外基质（ECM）材料上的Transwell小膜的顶部，然后对ECM的顶部添加细胞。例如，基质胶解冻和液化在冰上，然后30-50微升基质胶加入到24孔Transwell小插入和固化在37℃的培养箱中培养15-30分钟，以形成一个薄的凝胶层。细胞溶液在基质胶涂层的顶部加入，通过细胞外基质，以模拟的入侵。
   注意:有Transwell小细胞迁移和Transwell小细胞侵袭实验之间有明显的差异。 Transwell小细胞迁移实验测定细胞走向化疗引诱的趋化能力。 Transwell小细胞侵袭测定法，但是，通过细胞外基质的同时测量细胞趋化性和侵袭的细胞，即通常在癌症转移或胚胎发育的发现过程。
3. 使用移液管，非常caref来自ully添加600微升所希望的化疗引诱到下部腔室在一个24孔板的底部。添加化学引诱而无需移动Transwell小插件，避免产生气泡。确保在底部的井的化疗引诱液，使接触带的膜在上部以及形成趋化梯度。温育时间是依赖于细胞类型和化学引诱被使用。
   注:进一步的测试可能需要确定潜伏期。
   注意:对于贴壁细胞，迁移的细胞将附着在膜^1,8的另一侧。迁移的细胞进行定量可以执行以下步骤2.4到2.8（步骤2.4-2.8不需要在无菌环境中进行的）来执行。对于非粘附细胞，迁移的细胞将下降到介质中的下腔室。迁移细胞的数目可以通过使用血细胞计数器或算流式细胞仪^5。
4. 从板块中删除Transwell小插件。使用棉签多次需要小心地取出，但没有从膜的顶部而不损坏它迁移媒体和剩余的细胞。
5. 加600-1,000微升70％乙醇到24孔板的孔中。将transwell小插件放入70％乙醇中10分钟，以使细胞固定。从24孔板取出Transwell小插入和使用棉签从膜的顶部取出剩余的乙醇。允许的transwell小膜干燥（通常10-15分钟）。
6. 加600-1,000微升0.2％的结晶紫为24孔板的孔和膜定位成它用于染色。在室温下孵育5-10分钟。
7. 轻轻地从膜的顶部用移液管尖端或棉棒取出结晶紫。非常小心，以避免洗去固定的细胞，可以根据需要沾膜进入蒸馏水多次以除去过量的晶体VIOLE万吨。允许的transwell小膜干燥。
8. 视图下方倒置显微镜和计数细胞在不同视场的数目，以得到通过膜迁移朝向化学引诱并附着在膜的下侧（ 图3）细胞的平均总和。

结果

这里提出的伤口闭合试验和Transwell小细胞迁移测定法使用小鼠B16F10黑素瘤细胞作为模型系统进行。在伤口愈合测定法，B16F10细胞接种在6孔组织培养板中并生长至24小时内100％汇合。使用使用时间推移显微镜记录枪头和伤口闭合（细胞迁移）生成约700μm宽的伤。可替换地，伤口闭合，也可以通过采取快照图片在不同时间点，如果时间推移显微镜不可用¹研究。四张照片的时间推移系列在0，4,8...

讨论

细胞迁移是在癌症研究，研究的一个重要方面，它也可以应用到发育，免疫和伤口愈合研究。细胞培养伤口闭合试验和Transwell小细胞迁移和侵袭测定法揭示了细胞迁移性的行为的详细信息，并且可以用于研究细胞迁移^1,2,10,14的分子机制。我们的研究中使用这些细胞运动性测定法来确定B16F10黑色素瘤细胞系的迁移速度和侵袭能力。

细胞伤口愈合试验检查一个特定细胞系...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Gibco	11995-073
Fetal bovine serum (FBS)	Gemini	100106
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503-50G
Trypsin EDTA 0.25%	Gibco	25200-056
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS)	Gibco	14190-250
Crystal violet	Sigma	C0775-100G	Dissolved in water at 0.2%
Cell disassociation buffer	Gibco	13151-014
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific		Model # 3145
SterilGARD biosafety hood	The Baker Company, Inc.		Model # VBM-600
EVOS Fl inverted microscope	Thermo Fisher Scientific		Model # AMF-4302-US
Tissue culture plate	Becton Dickinson	353046	Catalog number varies depending on the type of culture plate
Corning Transwell insert	Fisher	07-200-150	Catalog number varies depending on the pore size of the membrane