В пробирке миграции клеток и Вторжение Анализы

Резюме

Обычно используется, очень доступные методы для изучения миграции клеток и вторжение в пробирке описаны. Первый способ заключается клетка закрытия раны анализа, который измеряет подвижность клеток. Второй способ является Transwell миграции и вторжения анализ, который оценивает хемотаксического и инвазивной способности клеток.

Аннотация

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

Введение

Подвижность является существенным признаком живых клеток. Миграция клеток участвует в концепции жизни, эмбрионального развития, иммунного ответа, и многих патологических процессов, таких как метастаза рака и воспаления ^1-9. Поэтому методы для изучения миграционное поведение клеток очень полезные инструменты исследования для широкого круга дисциплин в области биомедицинских наук, биология, биотехнологии, и в смежных областях.

Изучение миграции клеток в исследовании рака представляет особый интерес, поскольку основной причиной смерти у больных раком связан с метастатическим прогрессии. Для того, чтобы рак распространения и распространение по всему организму, раковые клетки должны мигрировать и вторгнуться через внеклеточного матрикса (ECM), intravasate в кровь, приложить к далекой сайта, и, наконец, вытекать из сосудов в ткань, чтобы сформировать далекую очаги ^1,10-12. Различные биологические методы могут быть использованы для изучения этих событий в деталях. Культура клеток рана закрытиег миграции Transwell и вторжения анализы широко используются в научном сообществе ^1,10. Эти тесты могут представлять необходимые данные, которые могут позволить для понимания того, насколько хорошо конкретный тип клеток может самопроизвольно мигрировать или ответить на химио-аттрактанта и направленно мигрируют к нему. Несколько перелетные фенотипы были описаны. Клетки могут мигрировать в единой форме клеток, таких как видно на мезенхимальных или амебоидной-как движения или многоклеточного движения с надписью коллективную миграцию или ячейку потокового ^13. Способ движения, используемого в подвижных клеток можно легко наблюдать с помощью культуры клеток закрытия раны анализа.

Среди многочисленных способов изучения миграции клеток, клетка закрытия раны анализ является одним из самых простых. Этот метод полезен для определения миграции способность целых масс клеток. При приеме на шаг дальше он может быть использован для наблюдения морфологических характеристик отдельной клетки во время миграции ¹⁴. После анализа закрытия раны многие фенотипы могут быть выявлены. Измерение замкнутую дистанцию ​​со временем при сравнении с контролем может выявить конкретные изменения миграционных или с дефектами зрения миграционного фенотипа, который был неизвестен ранее. Кроме того, формирование одной клетки lamellipodium, хвост отвод, и направленное движение может дать ключ для того, что может быть нарушена или усиливается в клетках интерес ^14.

Миграция Transwell и инвазии анализы могут быть использованы для анализа на способность отдельных клеток с целью непосредственного реагировать на различные химио-аттрактантов являются ли они хемокинов, факторов роста, липиды, или нуклеотиды ^4,5,8,15,16. Он также может оценить дифференциальную миграционную способность в связи с чрезмерной экспрессией рецептора ^1,14. Эти анализы могут быть также использованы для идентификации и характеристики ключевых регуляторов клеточной миграции, такие как семейства Rho малых GTPases ^2. После них короткие и легкого доступаможных тесты, режим миграции клеток и способность клетки к вторжению в 3-D матрицы также может быть определена.

протокол

1. Закрытие Анализ клеточной культуры Рана

1. Отделить клетки от культуры ткани пластины с использованием 0,25% раствора трипсина-ЭДТА. Гранул клеток в 15 мл коническую пробирку центрифугированием, аспирата супернатант и вновь приостановить клеток в культуральной среде. Plate соответствующее количество клеток в 6-луночный планшет для 100% слияния в 24 часов.
   Примечание: Испытания могут быть необходимы, чтобы определить время и количество клеток для достижения 100% слияния в связи с типом клеток и размера хорошо используется (например, 1 х 10 ⁶ B16F10 меланомы клетки высевают в лунку 6-луночный планшет за 24 часа до генерации раны). В качестве альтернативы, можно использовать 12-луночных или 24-луночных планшетах.
   Примечание: Если возможно, клетки могут быть посеяны в культуру-Insert (от ibidi ООО) на обработанной планшета для культуры ткани делает рану предварительно приведением. Культура-патрон может защитить поверхность планшета для культуры ткани от повреждения кончика пипетки. Если культура-вставки используется пропустить шаг1.2.
2. В стерильной среде (обычно биологической безопасности капот) используют пипетки 200 мкл нажать плотно прижата к верхней части планшета для культуры ткани и быстро сделать вертикальную рану вниз через клеточный монослой. Разного размера наконечник пипетки может быть использован, чтобы размер раны, которая является желательной. Не прилагайте чрезмерных усилий против планшета для культуры ткани с кончика пипетки, как это может повредить поверхность. Если рана предварительно отлиты, этот шаг может быть пропущен.
3. Тщательно аспирата средств массовой информации и остатков клеток. Медленно добавить достаточно питательных сред против а стены, чтобы покрыть дно колодца и избежать отсоединения дополнительные ячейки. После генерации и проверки раны Исходная картина должны быть приняты. Поместите планшета для культуры ткани в инкубатор при соответствующей температуре и концентрации СО ₂ (обычно 37 ° C и 5% CO _2).
4. В разные моменты времени, например, каждые 3 часа, удалить пластину из incubatили и поместите его под инвертированным микроскопом, чтобы сделать снимок картины и для проверки наличия закрытия раны. Если покадровой микроскопии доступен, примите фото каждый X количество минут (обычно начиная с каждые 5 минут) для любой продолжительности времени в температуре и CO ₂ контролируемой камере. В зависимости от типа клеток, время закрытия раны может изменяться.
5. Для анализа результатов Снимки изображений, измерить расстояние от одной стороны раны к другому, используя масштабную линейку. Анализ и явно присутствует закрытие раны со временем, используя точечный график или гистограмма, например Рисунок 1.
6. Для анализа покадровой фотографии, импортировать фотографии в ImageJ программного обеспечения (в свободном доступе на http://rsb.info.nih.gov/ij/), чтобы сделать видео. Для этого откройте ImageJ в меню Файл выберите Импорт и последовательности изображений. Найдите файл с фотографиями; нажмите первую фотографию в файле. Сохранить видео, выбрав Файл, Сохранить как, и AVI. Холост мигрирующие клетки можно наблюдать в чараcterize направленное движение. Кроме того, морфологические характеристики, такие как формирование ламеллиподий и задней кромки отвода могут быть изучены, а (рис. 2 и дополнительного видео).

2. Transwell сотовый Миграция и Вторжение Анализ

1. В стерильных условиях (как правило, капот биобезопасности) отделить клетки от планшета для культуры ткани с использованием неферментативное буфер клеток диссоциации или 0,25% раствором трипсина-EDTA, гранул клеток путем центрифугирования, и аспирации существующая СМИ оставляя осажденные клетки. Повторное приостановить клеток в свободной клеточной культуральной среде сыворотки, содержащей 0,1% БСА (бычий сывороточный альбумин).
   Примечание: В зависимости от клеточной линии под следствием 0,25% Трипсин-ЭДТА может повлиять на миграцию клеток и инвазии в связи с расщеплением различных рецепторов на клеточной поверхности ^17.
   Примечание: число клеток на мл зависит от размера клеток. Дальнейшие тесты могут быть необходимы, чтобы найти плотность посева, что ProVides лучшие результаты. Обычно 1 х 10 ⁶ клеток / мл является хорошей отправной точкой для большинства типов клеток при использовании 24-а Transwell вставить. Существует целый ряд Transwell размеров вставки и количество клеток, добавленных должна быть скорректирована для соответствующим образом.
2. Тарелка 100 мкл раствора клеток в верхней части мембраны фильтра в Transwell вставки и инкубировать в течение 10 минут при 37 ° С и 5% СО _2, чтобы позволить клетки, чтобы успокоиться.
   Примечание: Конкретный размер пор мембраны, используемой Transwell зависит от индивидуального размера клеток в образце. Например, если клетки слишком малы, они могут проходить через поры без необходимости для облегчения миграции или если они слишком велики, они не могут проходить через поры. Есть несколько Transwell вставки с размером пор, которые варьируются от 3 мкм, 5 мкм и 8 мкм для миграции клеток анализов. В Transwell вставки являются коммерчески доступными от таких компаний, как Corning.
   Примечание: Transwell мigration анализ может быть легко модифицирована для выполнения вторжения клеток анализа. Чтобы сделать это, добавьте внеклеточный матрикс (ECM) материалов в верхней части Transwell мембраны, а затем добавить клетки в верхней части ECM. Например, Матригель оттаивают и сжиженный на льду, а затем 30-50 мкл Matrigel добавляется в 24-луночный Transwell вставить и затвердевает в инкубаторе 37 ° C в течение 15-30 минут, чтобы сформировать тонкий слой геля. Сотовый решение добавляется в верхней части покрытия Матригель имитировать вторжение через внеклеточного матрикса.
   Примечание: Есть четкие различия между миграцией Transwell клеток и вторжения Transwell клеток анализов. Миграция анализ Transwell клеток измеряет хемотактическую возможности клеток в сторону химио-аттрактанта. Вторжение Transwell клеток анализ, однако, измеряет как сотовые хемотаксис и нашествие клеток через внеклеточного матрикса, процесс, который обычно находится в метастазами рака или эмбрионального развития.
3. С помощью пипетки, очень carefUlly добавить 600 мкл требуемой химио-аттрактанта в нижней части нижней камеры в 24-луночный планшет. Добавьте химио-аттрактант без перемещения Transwell вставку и избежать образования пузырьков. Убедитесь, что химио-аттрактант жидкость в нижней скважины вступает в контакт с мембраной в верхней скважины, чтобы сформировать градиент хемотаксиса. Время инкубации зависит от типа клеток и химио-аттрактанта используется.
   Примечание: Дальнейшие тесты могут быть необходимы, чтобы определить, инкубационный период.
   Примечание: адгезивных клеток, перенесенные клетки приложить к другой стороне мембраны ^1,8. Количественное мигрировавших клеток могут быть выполнены следующие шаги 2,4 до 2,8 (шаги 2.4-2.8 не нужно быть выполнены в стерильной среде). Для не-прилипшие клетки, мигрировавшие клетки упадет в СМИ в нижней палате. Количество мигрировавших клеток можно пересчитать с помощью гемоцитометра или проточного цитометра ^5.
4. Извлеките вставку Transwell от пластины. Используйте ватный-наконечником аппликатором столько раз, сколько необходимо тщательно удалить средства массовой информации и оставшиеся клетки, которые не переносятся из верхней части мембраны, не повреждая ее.
5. Добавить 600-1000 мкл 70% этанола в лунку 24-луночного планшета. Поместите Transwell вставку в 70% этаноле в течение 10 минут, чтобы позволить прикрепление клеток. Удалить Transwell вставку из 24-луночного планшета и использовать ватным наконечником аппликатора для удаления оставшегося этанола из верхней части мембраны. Разрешить Transwell мембрана высохнуть (обычно 10-15 минут).
6. Добавить 600-1000 мкл 0,2% кристаллическим фиолетовым в лунку 24-луночного планшета и поместите в него мембрану для окрашивания. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5-10 минут.
7. Осторожно удалите кристаллический фиолетовый сверху мембраны с наконечником пипетки или хлопка наконечником аппликатора. Очень осторожно, чтобы избежать смывания фиксированные клетки, окуните мембрану в дистиллированной воде столько раз, сколько необходимо для удаления избытка кристально Violeт. Разрешить Transwell мембрана для просушки.
8. Вид под инвертированным микроскопом и подсчета количества клеток в различных полей зрения, чтобы получить среднюю сумму клеток, которые мигрировали через мембрану к химио-и аттрактанта, прикрепленных на нижней стороне мембраны (рис. 3).

Результаты

Рана закрытие анализа и миграции Transwell клеток анализа, представленные здесь проводились с использованием мыши B16F10 клетки меланомы в качестве модельной системы. В анализе закрытия раны, B16F10 клетки высевали в культуре ткани пластины 6-луночный и выращивали до 100% слияния в течение 24 часов...

Обсуждение

Миграция клеток является важным аспектом для изучения в исследовании рака, а также может быть применен в развитии, иммунологических и заживление ран исследований. Культуру клеток закрытия раны анализа и миграции Transwell клеток и вторжения анализы показывают подробную информацию о мигр?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Gibco	11995-073
Fetal bovine serum (FBS)	Gemini	100106
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503-50G
Trypsin EDTA 0.25%	Gibco	25200-056
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS)	Gibco	14190-250
Crystal violet	Sigma	C0775-100G	Dissolved in water at 0.2%
Cell disassociation buffer	Gibco	13151-014
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific		Model # 3145
SterilGARD biosafety hood	The Baker Company, Inc.		Model # VBM-600
EVOS Fl inverted microscope	Thermo Fisher Scientific		Model # AMF-4302-US
Tissue culture plate	Becton Dickinson	353046	Catalog number varies depending on the type of culture plate
Corning Transwell insert	Fisher	07-200-150	Catalog number varies depending on the pore size of the membrane