Nella migrazione delle cellule in vitro e saggi Invasion

Riepilogo

Comunemente utilizzati, sono descritti metodi altamente accessibili per l'esame migrazione cellulare e l'invasione in vitro. Il primo metodo è il saggio chiusura della ferita cella che misura la motilità cellulare. Il secondo metodo è il transwell migrazione e invasione test che valuta la chemiotassi e la capacità invasiva delle cellule.

Abstract

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

Introduzione

La motilità è una caratteristica essenziale di cellule vive. La migrazione cellulare è coinvolto nella concezione della vita, lo sviluppo embrionale, la risposta immunitaria, e molti processi patologici quali metastasi del cancro e l'infiammazione ^1-9. Pertanto, i metodi per lo studio delle cellule comportamento migratorio sono strumenti di ricerca molto utili per una vasta gamma di discipline nelle scienze biomediche, biologia, bioingegneria, e campi correlati.

Lo studio della migrazione cellulare nella ricerca sul cancro è di particolare interesse come la principale causa di morte nei pazienti affetti da cancro è correlata alla progressione metastatica. Affinché cancro di diffondersi e diffondere in tutto il corpo, le cellule tumorali devono migrare ed invadere attraverso matrice extracellulare (ECM), intravasate in circolazione sanguigna, collegare a un sito distante, e infine estravasare per formare lontano foci ^1,10-12. Vari metodi biologici possono essere utilizzati per studiare questi eventi in dettaglio. La coltura cellulare ferita alla chiusura und la migrazione transwell e invasione saggi sono ampiamente utilizzati nella comunità scientifica ^1,10. Questi test possono fornire i dati necessari che possono consentire una comprensione di come un particolare tipo di cellula può migrare spontaneamente o rispondere ad una chemio-attrattiva e direzionalmente migrare verso di essa. Sono stati descritti diversi fenotipi migratori. Cellule possono migrare in forma singola cella come visto in mesenchimali o movimento ameboide simile o dal movimento multicellulare etichettato migrazione collettivo o cella in streaming ^13. Il metodo di trasporto utilizzato nel cellule mobili può essere facilmente osservato utilizzando la coltura cellulare saggio chiusura della ferita.

Tra i numerosi modi per studiare la migrazione delle cellule, il saggio chiusura della ferita cellulare è uno dei più semplici. Questo metodo è utile per determinare la capacità di migrazione di masse di cellule intere. Quando compiuto un ulteriore passo può essere utilizzato per osservare le caratteristiche morfologiche delle cellule dell'individuo durante la migrazione ¹⁴. In seguito all'analisi della chiusura della ferita molti fenotipi possono essere rivelati. Misurazione della distanza chiuso nel tempo, quando si confrontano su un controllo può rivelare cambiamenti di migrazione specifica o un fenotipo migratorio alterata che era sconosciuto in precedenza. Inoltre, la formazione lamellipodium singola cella, coda di svincolo e movimento direzionale possono dare indizi su quello che potrebbe essere compromessa o rafforzata in cellule di interesse ^14.

La migrazione transwell e analisi d'invasione possono essere usati per analizzare la capacità delle singole cellule di rispondere direzionalmente a vari chemo-attrattivi se sono chemochine, fattori di crescita, lipidi, o nucleotidi ^4,5,8,15,16. Può anche valutare la capacità migratoria differenziale a causa della sovra-espressione di un recettore ^1,14. Questi saggi possono anche essere utilizzati per identificare e caratterizzare i regolatori chiave della migrazione cellulare come la famiglia delle piccole GTPasi Rho ^2. Dopo questi brevi e facilmente accestest sibili, la modalità di migrazione cellulare e la capacità di una cellula di invadere in una matrice 3-D possono anche essere determinate.

Protocollo

1. Cella Cultura ferita Chiusura Assay

1. Staccare le cellule dalla piastra di coltura tissutale con 0,25% di soluzione di tripsina-EDTA. Cellule pellet in un tubo da 15 ml di centrifugazione, aspirare il surnatante e risospendere le cellule in coltura. Piatto il numero appropriato di cellule in una piastra da 6 pozzetti per il 100% di confluenza in 24 ore.
   Nota: Le prove possono essere necessari per determinare il tempo e il numero di cellule per raggiungere il 100% di confluenza causa del tipo di cellula e la dimensione del pozzo utilizzato (ad esempio, 1 x 10 ⁶ cellule di melanoma B16F10 vengono seminate in un pozzetto di una 6 pozzetti 24 ore prima generazione ferita). In alternativa, possono essere utilizzate piastre da 12 pozzetti o 24 pozzetti.
   Nota: Se disponibile, le cellule possono essere seminate in una cultura-Insert (da LLC Ibidi) su un tessuto piastra di coltura trattata rendendo la ferita pre-colato. Una cultura-inserto può proteggere la superficie della piastra di coltura tissutale da danni dalla punta della pipetta. Se una Cultura-Insert viene utilizzato passo omettere1.2.
2. In un ambiente sterile (tipicamente una cappa di biosicurezza) utilizzano una punta di pipetta 200 microlitri per premere saldamente contro la sommità della piastra di coltura tissutale e rapidamente fare una ferita verticale verso il basso attraverso il monostrato cellulare. Un puntale di dimensioni diverse può essere utilizzato per ridurre le dimensioni della ferita che è desiderato. Non usare una forza eccessiva contro la piastra di coltura tissutale con la punta della pipetta in quanto potrebbe danneggiare la superficie. Se la ferita è pre-fuso, questo passaggio può essere omesso.
3. Con attenzione aspirare i media e detriti cellulari. Aggiungere lentamente abbastanza terreni di coltura contro la parete bene a coprire il fondo del pozzo e provocare distacchi celle aggiuntive. Dopo la generazione e l'ispezione della ferita una prima immagine dovrebbe essere presa. Posizionare la piastra di coltura tissutale in un incubatore a temperatura appropriata e concentrazione di CO ₂ (tipicamente 37 ° C e 5% CO _2).
4. In diversi punti del tempo, ad esempio ogni 3 ore, rimuovere la piastra dal incubato e posizionarlo sotto un microscopio invertito per scattare una foto snapshot e per controllare la chiusura della ferita. Se microscopia time-lapse è disponibile, scattare una foto ogni tot numero di minuti (generalmente a partire con ogni 5 minuti) per qualsiasi durata di tempo in temperatura e CO ₂ camera controllata. A seconda del tipo di cellula, tempo di chiusura della ferita può variare.
5. Per analizzare i risultati di immagini istantanee, misurare la distanza di un lato della ferita all'altro utilizzando una barra di scala. Analizzare e chiaramente presente la chiusura della ferita nel tempo utilizzando un diagramma a dispersione o grafico a barre, ad esempio, la figura 1.
6. Per analizzare le immagini time-lapse, di importare le immagini nel software ImageJ (liberamente disponibile a http://rsb.info.nih.gov/ij/) per fare un video. Per fare questo ImageJ aperta, fare clic su File, Importa, e Sequenza d'immagini. Trovare il file con le immagini; fare clic sulla prima foto nel file. Salvare video selezionando File, Salva con nome, e AVI. Cellule che migrano singoli possono essere osservati a characterize movimento direzionale. Inoltre, le caratteristiche morfologiche quali la formazione lamellipodia e bordo di uscita svincolo possono essere studiati come bene (Figura 2 e il video supplementare).

2. Transwell migrazione cellulare e Invasion test

1. In un ambiente sterile (tipicamente una cappa di biosicurezza) staccare le cellule dalla piastra di coltura utilizzando un buffer non enzimatica dissociazione cellulare o 0,25% di soluzione di tripsina-EDTA, cellule pellet per centrifugazione, e aspirare il supporto esistente lasciando le cellule pellet. Risospendere le cellule nel siero mezzi di coltura cellulare gratuito contenente 0,1% di BSA (albumina sierica bovina).
   Nota: A seconda della linea cellulare indagato 0,25% tripsina-EDTA può influenzare la migrazione cellulare e dell'invasione causa della scissione di vari recettori sulla superficie cellulare ^17.
   Nota: Il numero di cellule per ml dipende dalla dimensione delle celle. Ulteriori test possono essere necessari per trovare una densità di semina che pronisce i migliori risultati. Tipicamente 1 x 10 ⁶ cellule / ml è un buon punto di partenza per la maggior parte dei tipi di cellule quando si utilizza il 24 e Transwell inserire. Esiste una gamma di transwell dimensioni inserto e il numero di cellule aggiunte deve essere regolata per conseguenza.
2. Piastra 100 ml di soluzione di cellule sulla parte superiore della membrana filtrante in un inserto transwell e incubare per 10 minuti a 37 ° C e 5% di CO ₂ per permettere alle cellule di stabilirsi.
   Nota: La particolare dimensione dei pori della membrana transwell utilizzato dipende dalla dimensione individuale delle cellule nel campione. Ad esempio, se le cellule sono troppo piccole possono passare attraverso i pori senza la necessità di facilitare la migrazione o se sono troppo grandi non possono essere introdotte attraverso i pori. Ci sono diversi inserti transwell con dimensioni dei pori che variano da 3 micron, 5 micron, e 8 micron per saggi di migrazione cellulare. Gli inserti transwell sono disponibili in commercio da aziende come Corning.
   Nota: Il transwell msaggio igration può essere facilmente modificato per eseguire il saggio di invasione cellulare. A tale scopo, aggiungere matrice extracellulare (ECM) materiali sopra della membrana transwell e poi aggiungere celle sopra l'ECM. Ad esempio, Matrigel è stato scongelato e liquefatto in ghiaccio, e poi 30-50 ml di Matrigel viene aggiunto a un 24-ben transwell inserire e solidificato in un incubatore a 37 ° C per 15-30 minuti per formare uno strato sottile di gel. Soluzione di cellule viene aggiunto sulla parte superiore del rivestimento Matrigel per simulare invasione attraverso la matrice extracellulare.
   Nota: Ci sono chiare differenze tra la migrazione delle cellule transwell ed i saggi di invasione delle cellule transwell. Il saggio migrazione cellulare transwell misura la capacità chemiotattica delle cellule verso una chemio-attrattivo. Il saggio di invasione cellulare transwell, invece, misura sia la chemiotassi delle cellule e l'invasione delle cellule attraverso matrice extracellulare, un processo che si trova comunemente in metastasi del cancro o sviluppo embrionale.
3. Usando una pipetta, molto carefully aggiungere 600 microlitri della chemio-attractant desiderato nella parte inferiore della camera inferiore in una piastra da 24 pozzetti. Aggiungere la chemio-attrattivo senza spostare l'inserto transwell ed evitare la generazione di bolle. Assicurarsi che il liquido chemio-attractant nel ben inferiore a contatto con la membrana nel pozzo superiore per formare un gradiente chemiotattico. Il tempo di incubazione dipende dal tipo di cellula e la chemio-attrattore utilizzato.
   Nota: Ulteriori test possono essere necessari per determinare il periodo di incubazione.
   Nota: Per cellule aderenti, le cellule migrate legheranno verso l'altro lato della membrana ^1,8. La quantificazione delle cellule migrate può essere eseguita seguendo i punti 2.4 2.8 (passi 2,4-2,8 non hanno bisogno di essere eseguita in un ambiente sterile). Per le cellule non aderenti, le cellule migrate cadranno in media nella camera inferiore. Il numero di cellule migrate può essere contato utilizzando emocitometro o citofluorimetro ^5.
4. Rimuovere l'inserto transwell dalla piastra. Utilizzare un applicatore con punta di cotone come numero di volte necessario per rimuovere delicatamente il supporto e le cellule rimanenti che non sono migrati dalla parte superiore della membrana senza danneggiarlo.
5. Aggiungere 600-1,000 ml di etanolo al 70% in un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. Posizionare l'inserto transwell nel etanolo al 70% per 10 minuti per consentire la fissazione delle cellule. Rimuovere transwell inserto dalla piastra a 24 pozzetti e utilizzare un applicatore con punta di cotone per rimuovere l'etanolo residuo dalla parte superiore della membrana. Lasciare la membrana transwell asciugare (in genere 10-15 minuti).
6. Aggiungere 600-1,000 ml di 0,2% cristal violetto in un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti e posizionare la membrana in esso per la colorazione. Incubare a temperatura ambiente per 5-10 minuti.
7. Rimuovere delicatamente il violetto cristallo dalla parte superiore della membrana con un puntale o cotone applicatore capovolto. Con molta attenzione, per evitare di lavare le cellule fisse, immergere la membrana in acqua distillata tante volte quanto necessario per rimuovere l'eccesso di viole cristallot. Lasciare la membrana transwell ad asciugare.
8. Vista sotto un microscopio invertito e contare il numero di cellule in diverse condizioni di visibilità per ottenere una somma media di cellule che sono migrate attraverso la membrana verso la chemio-attrattiva e attaccati sul lato inferiore della membrana (Figura 3).

Risultati

La chiusura dosaggio ferita e il saggio migrazione delle cellule transwell qui presentata sono stati eseguiti utilizzando cellule di topo B16F10 melanoma come sistema modello. Nel saggio chiusura della ferita, B16F10 cellule sono state seminate in una piastra di coltura tissutale da 6 pozzetti e coltivate al 100% di confluenza in 24 ore. Una ferita di circa 700 micron di larghezza è stata generata utilizzando un puntale e la chiusura della ferita (la migrazione cellulare) è stato registrato utilizzando la microscopia ...

Discussione

La migrazione cellulare è un aspetto importante studiare nella ricerca sul cancro e può anche essere applicato a studi guarigione sviluppo, immunologici e ferita. La coltura cellulare ferita saggio di chiusura e la migrazione delle cellule transwell e invasione saggi di rivelare le informazioni dettagliate dei comportamenti migratori delle cellule e può essere utilizzato per studiare i meccanismi molecolari della migrazione cellulare ^1,2,10,14. Il nostro studio ha utilizzato questi saggi di motilità cellu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Gibco	11995-073
Fetal bovine serum (FBS)	Gemini	100106
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503-50G
Trypsin EDTA 0.25%	Gibco	25200-056
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS)	Gibco	14190-250
Crystal violet	Sigma	C0775-100G	Dissolved in water at 0.2%
Cell disassociation buffer	Gibco	13151-014
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific		Model # 3145
SterilGARD biosafety hood	The Baker Company, Inc.		Model # VBM-600
EVOS Fl inverted microscope	Thermo Fisher Scientific		Model # AMF-4302-US
Tissue culture plate	Becton Dickinson	353046	Catalog number varies depending on the type of culture plate
Corning Transwell insert	Fisher	07-200-150	Catalog number varies depending on the pore size of the membrane