JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وصفت وسائل لعزل وإعداد ذبابة الفاكهة الخصيتين عينات (العيش وثابتة) للتصوير من قبل على النقيض من المرحلة ومضان المجهري في هذه الوثيقة.

Abstract

ذبابة الفاكهة السوداء البطن هو نظام نموذجي القوية التي استخدمت على نطاق واسع لتوضيح مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية. على سبيل المثال، ساهمت الدراسات كل من الإناث والذكور خطوط الجرثومية من ذبابة الفاكهة إلى حد كبير في الفهم الحالي للالانقسام الاختزالي وكذلك بيولوجيا الخلايا الجذعية. تتوفر بروتوكولات ممتازة في الأدب لعزل والتصوير من المبيضين والخصيتين ذبابة الفاكهة 3-12. هنا، يتم وصف طرق للتشريح وإعداد الخصيتين ذبابة الفاكهة لتحليل مجهري مع مظاهرة الفيديو المرفقة. يتم عرض بروتوكول للعزل الخصيتين من البطن من الذكور البالغين وإعداد الشرائح من الأنسجة الحية لتحليلها من قبل على النقيض من المرحلة المجهري وكذلك بروتوكول لتحديد والمناعية الخصيتين لتحليلها من قبل مضان المجهري. هذه التقنيات يمكن تطبيقها في توصيف المسوخ ذبابة الفاكهة الذي يحمل دefects في الحيوانات المنوية وكذلك في تصور تعريب التحت خلوية من البروتينات.

Introduction

الخصيتين ذبابة الفاكهة هي نظام نموذج مثالي لدراسة العديد من العمليات البيولوجية بما في ذلك تنظيم الخلايا الجذعية، والانقسام الاختزالي، وتطوير الحيوانات المنوية 13-18. والخلايا المنوية ومغزل على الانتصافي كبيرة وبالتالي مريحة للتحليل الخلوي، واسترخاء نقاط التفتيش خلال دورة الخلية الحيوانات المنوية تيسير دراسة الطفرات في الجينات دورة الخلية. أنواع مختلفة من الخلايا يمكن ملاحظة التقدم في أمر على طول الخصيتين، وأي خلل في الحيوانات المنوية يمكن أن يؤدي إلى تغييرات في هذا الترتيب العام. هذه الميزات جنبا إلى جنب مع الأدوات الوراثية ذبابة الفاكهة قد سهلت تحليل طفرية من الحيوانات المنوية 21-23.

وقد تم تحديد مراحل تكوين الحيوانات المنوية ذبابة الفاكهة جيدا. خلايا سلالة الجرثومية التي تتطور بشكل متزامن داخل الخراجات بالتتابع تقدم من خلال مراحل تكوين الحيوانات المنوية على طول الخصية. خلال بوعشر والإنقسامية والانقسامات الانتصافي من الخلايا الجرثومية الذكور، يحدث الانقسام السيتوبلازمي مثل هذه غير كامل أن الخلايا الوليدة لا تزال متصلة بواسطة جسور حشوية المعروفة باسم قنوات حلقة (الشكل 1). غيض من قمية الخصية يحتوي على السكان من الخلايا الجذعية سلالة الجرثومية التي تؤدي إلى خلايا النطفة، التي تخضع لأربعة أقسام الإنقسامية مع الانقسام السيتوبلازمي غير مكتملة لتوليد الخراجات 16 خلية من الخلايا المنوية الأولية. بعد المرحلة S السابق للانتصاف، الخلايا المنوية الأولية أدخل G2، وهي فترة طويلة من النمو الذي يزيد من حجم ~ ~ الخلوية 25 أضعاف خلال 90 ساعة. التقدم من خلال الانقسام الاختزالي الأول والانقسام الاختزالي الثاني النتائج في تشكيل الخراجات 32 خلية من الخلايا المنوية الثانوية والخراجات 64 خلية من طلائع منوية فرداني، على التوالي. غير ناضجة، طلائع منوية الجولة الخضوع لإعادة عرض الخلوية واسعة لتشكيل الحيوانات المنوية الناضجة. الخلايا بعد الانتصافي، ولا سيما حزم من التمطيط وطلائع منوية ناضجة، تحتل جزءا كبيرا من حجم الخصية.

Tوقال انه نقل ناجحة من الحيوانات المنوية وظيفية لالذباب الإناث يتطلب التنسيق بين أجزاء مختلفة من الجهاز التناسلي الذكري، والتي تتألف من العديد من الهياكل تقرن (الخصيتين والحويصلات المنوية والغدد ملحق) والقناة قذفي واحد (الشكل 2). ويتم إنتاج الحيوانات المنوية داخل الخصيتين وتخزينها داخل الحويصلات المنوية حتى الجماع 24. الغدد التبعي تحتوي على خلايا إفرازية التي تنتج السائل المنوي. الحيوانات المنوية المهاجرة من الحويصلات المنوية تختلط مع السائل المنوي داخل القناة قذفي، التي يتم توصيلها إلى كل من الحويصلات المنوية والغدد التبعي. هذا الخليط من الحيوانات المنوية والسائل المنوي ويتم ضخ في نهاية المطاف للخروج من الذكور في المهبل من الإناث تطير من خلال لمبة قذفي تقع في نهاية الخلفي من البطن الذكور 25. البروتينات داخل السائل المنوي ضرورية لتخزين لفترة طويلة من الحيوانات المنوية داخل الأجهزة المتخصصة المعروفة باسم spermathecae في مندوبالمسالك roductive الإناث ذبابة الفاكهة 26.

تتوفر طرق ممتازة لعزل الخصيتين ذبابة الفاكهة والتصور من الخلايا في مراحل مختلفة من الحيوانات المنوية في الكتابات العلمية 3-12. نحن هنا لإضافة هذه الهيئة من المعرفة من خلال تقديم أمثلة من هذه البروتوكولات مع مظاهرة الفيديو المرفقة. ويستند بروتوكول لإعداد الخصيتين الحية عينات للمرحلة التباين المجهري على الطريقة الموصوفة سابقا 27. ويستند بروتوكول لتثبيت الفورمالديهايد والمناعية من الخصيتين أيضا على الطريقة الموصوفة سابقا 28. وقد استخدمت الأساليب الموصوفة هنا في العديد من الدراسات من ذبابة الفاكهة الحيوانات المنوية (على سبيل المثال، لتقييم أدوار داينين، أنيبيب المحركات الموجهة ناقص نهاية، خلال ذبابة الفاكهة الحيوانات المنوية).

بالإضافة إلى البروتوكولات الأساسية، وتقدم اقتراحات لvaryinز تشريح وذلك لإثراء للأمهات المني، الخلايا المنوية، أو الحيوانات المنوية الناضجة. طرق مختلفة لمعالجة الخصيتين بحيث الخراجات إما لا تزال سليمة أو تتعطل حسب الحاجة موصوفة. ميزة في استخدام الخصيتين ذبابة الفاكهة كنظام نموذج هو أنه، بالمقارنة مع البويضات والأجنة ذبابة الفاكهة، والأجسام المضادة والأصباغ يمكن بسهولة اختراق الخلايا التالية تشتتهم من الخصيتين، وأقل مطلوبة الخطوات الغسيل، وبالتالي، لا يمكن أن يؤديها البروتوكولات في نسبيا وقت قصير.

Protocol

1. تشريح الخصيتين

  1. تخدير الذباب في زجاجة أو قارورة باستخدام تيار من ثاني أكسيد الكربون 2 ونقل إلى لوحة الطاير.
  2. نوع الذباب تحت المجهر تشريح باستخدام الفرشاة الصغيرة، وجمع عدد مناسب (اعتمادا على التجربة) من الذكور ذبابة الفاكهة من المورثات المطلوب. الشباب الذكور (0-2 أيام من العمر) تعتبر مثالية لفحص الخلايا في جميع أنحاء المراحل السابقة من الحيوانات المنوية (مثل أمهات المني، الخلايا المنوية، وأوائل طلائع منوية بعد الانتصافي)، في حين أن الذكور الأكبر سنا قليلا (2-5 يوما) هي مثالية لدراسة الخلايا في المراحل النهائية من الحيوانات المنوية (على وجه الخصوص، تنضج الحيوانات المنوية).
  3. استخدام ملقط لإزالة الأجنحة من كل يطير (لمنع الذباب من عائمة في السائل خلال تشريح).
  4. إضافة ~ 500 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (130 ملي مول كلوريد الصوديوم، 7 ملم نا 2 هبو 4، 3 ملم ناه 2 ص 4؛ PBS) في قطرة إلى طبق تشريح المغلفة سيليكون علىخلفية سوداء. وقد استخدمت المحاليل المائية الأخرى بنجاح لتشريح الخصيتين 3.
  5. نقطة ملقط نحو الأمامي للذبابة، فهم من قبل الصدر، وتزج به في الانخفاض برنامج تلفزيوني. أثناء عرض من خلال مجهر تشريح، واستخدام زوج آخر من ملقط لفهم وسحب الأعضاء التناسلية الخارجية (هيكل البني الداكن تقع في نهاية الخلفي من البطن بطني) الخلف حتى يفصل من البطن. في معظم الحالات، سيتم إزالة الخصيتين والحويصلات المنوية، والغدة التبعي من البطن جنبا إلى جنب مع الأعضاء التناسلية الخارجية، وإذا لم يكن كذلك، اضافة الى وجود زوج واحد من ملقط في البطن وندف من الخصيتين.
  6. الخصيتين منفصلة من الغدة الإكسسوارات والأعضاء التناسلية الخارجية باستخدام اثنين من أزواج من ملقط في انخفاض PBS (الشكل 2). وتتميز البرية من نوع الخصيتين بسهولة من الأنسجة البيضاء المجاورة عن طريق لونها أصفر. الشروع فورا في الخطوة 2.
  7. لعزل الخصيتين من الذكور pharate (ط . البريد المغلقة داخل حالة العذراء)، يجب أولا أن يتم تنفيذ خطوة إضافية التي تنطوي على إزالة ذبابة من حالة العذراء، وقد تم هذه الخطوة هو موضح سابقا في مكان آخر 31. المضي قدما في تشريح أما الخصيتين الكبار تبدأ في الخطوة 1.2.
  8. لعزل الخصيتين من الذكور اليرقات، إجراء تعديل على بروتوكول للعزل المبايض اليرقات ذبابة الفاكهة 32. لفترة وجيزة، يرقات الذكور يمكن تمييزها عن يرقات الإناث من خلال وجود زوج من، واضحة، والهياكل بيضاوية كبيرة (الخصيتين اليرقات) جزءا لا يتجزأ في الثلث الخلفي من الدهون في الجسم. لعزل اليرقات الخصيتين، سلخ جزئيا فتح يرقة الذكور إلى عزل الخصيتين والدهون في الجسم المحيطة من البطن كما هو موضح لعزل اليرقات المبايض. الشروع فورا في الخطوة 2 من بروتوكول الموصوفة هنا، ويمكن في وقت لاحق يتم إزالة الخصيتين من الجسم الدهون فقط قبل تركيب (2.3 أو 3.14 خطوات) كما هو موضح في المبايض 32.

ق ق = "jove_title"> 2. تحضير العينة وتصوير لايف

  1. استخدام زوج من ملقط لوضع بلطف 2-3 أزواج من الخصيتين في قطرة من 4-5 مل من برنامج تلفزيوني على غطاء زجاجي مربع الانزلاق. نلاحظ أن نسبة عدد الخصيتين للحجم PBS قد تحتاج إلى تعديل: سوف الكثير من السائل منع الخلايا من الانتشار بشكل صحيح عندما سحق، في حين أن السائل القليل جدا سوف يسبب الخلايا لتنفجر عندما ممرود. اختياري: استخدام الغطاء siliconized زلات لتقليل الالتزام من الأنسجة لتغطية الانزلاق في الخطوة 3.2.
  2. استخدام زوج من ملقط لتمزيق مفتوحة لكل الخصية في الموقف المناسب وذلك لتحقيق أقصى قدر من وجود أنواع الخلايا سلالة الجرثومية المطلوب في إعداد (لاحظ أن محتويات الخصية سوف معظمهم من الخروج من المنطقة التي مزقتها على الشريحة أثناء السحق الخطوة.) لإثراء لأمهات المني والخلايا المنوية، المسيل للدموع فتح الخصية المجاورة للطرف القمي في (مستوى 1، الشكل 2B). لإثراء لالمنوية وطلائع منوية، المسيل للدموع فتح الخصية في نقاط البيعition القاعدية قليلا إلى المستوى 1 (مستوى 2، الشكل 2B). لإثراء للخلايا سلالة الجرثومية أكثر نضجا، المسيل للدموع مفتوحة الخصية أقرب إلى حيث يبدأ انحناء (المستوى 3، الشكل 2B).
  3. وضع بلطف شريحة المجهر والزجاج على زلة غطاء لسحق الخصيتين، لا الضغط يدويا كما وزن الغطاء زلة وحده يكفي للحصول على عينة ممرود بشكل صحيح. في محاولة لتجنب احتباس فقاعات الهواء. اختياري: استخدام بولي-L-يسين المغلفة شرائح المجهر لتشجيع الانضمام من الأنسجة إلى الشريحة في الخطوة 3.2.
  4. استخدام إعداد فورا (مثالي في غضون 15 دقيقة من إعداد) لمراقبة الخلايا الحية من قبل على النقيض من المرحلة المجهري، على الذباب المعدلة وراثيا مع التعبير عن البروتينات الموسومة fluorescently في الخصيتين، والخلايا الحية يمكن دراستها بواسطة المجهر مضان في هذه الخطوة. بدلا من ذلك، المضي قدما في تثبيت وتلوين الأجسام المضادة (بروتوكول 3).
  5. الفتيل بلطف أي السائل الزائد من تحت ساترة باستخدام تنظيف ثبورصة البترول الدولية للسماح تسطيح من التحضير، حتى الخلايا الجرثومية بشكل واضح في التركيز.

3. الفورمالديهايد تثبيت وتلوين الأجسام المضادة

  1. المفاجئة تجميد كل شريحة تحتوي على الخصيتين ممرود (من البروتوكول 2) باستخدام زوج من ملقط معدني لتزج به لفترة وجيزة في النيتروجين السائل (حتى يتوقف النيتروجين السائل محتدما).
  2. إزالة الغطاء زلة فورا باستخدام شفرة حلاقة.
  3. استخدام ملقط معدني لنقل الشرائح إلى رف شريحة زجاجية prechilled مليئة الجليد الباردة الايثانول 95٪ (الصف الطيفي، خالية من الميثانول). تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  4. استخدام ملقط معدني لنقل الشرائح إلى رف شريحة زجاجية مملوءة 4٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى 0.1٪ تريتون X-100 (PBS-T). تخزين في درجة حرارة الغرفة لمدة 7 دقائق.
  5. استخدام ملقط معدني لنقل الشرائح إلى رف شريحة زجاجية مليئة برنامج تلفزيوني. تغسل الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر 1X. تنفيذ كافة يغسل عن طريق تجاهل الحل في رف شريحة زجاجية ( مثال. بصب بها) واستبدالها مع حل جديد.
  6. تجاهل برنامج تلفزيوني وتزج الشرائح في برنامج تلفزيوني-T لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لpermeabilize أغشية الخلايا.
  7. تغسل الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تكرار 2X.
  8. عرقلة الخطوة (اختياري): تزج الشرائح في برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى 1٪ BSA لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  9. استخدام القلم حاجز مسعور لرسم دائرة على الشريحة في جميع أنحاء الأنسجة ممرود (مرئية بسهولة بالعين) من أجل حصر الحلول الضد (المضافة في الخطوات 3.9 و 3.11). يجب أن تبقى الأنسجة رطبة في جميع الأوقات أثناء أداء المناعية.
  10. إضافة 30-40 مل من الأجسام المضادة الأولية (المخفف في PBS-T، 1:400 إلى 1:50، اعتمادا على الضد) إلى الأنسجة داخل الدائرة. إذا تم تنفيذ حظر، تمييع الأجسام المضادة الأولية في برنامج تلفزيوني-T زائد 1٪ BSA. تم تخفيفه المضادة للأشعة غاما تويولين الضد (لتلطيخ centrosomes في الشكل 4) 1:100. احتضان في رطبة، غرفة مظلمة (على سبيل المثال. علبة بلاستيكية مغلقةمع المناشف مبللة ورقة) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  11. تغسل الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة 3X. إذا تم تنفيذ حظر، يغسل مرتين في برنامج تلفزيوني-T ومرة ​​واحدة في برنامج تلفزيوني (5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لكل منهما).
  12. إضافة 30-40 مل من fluorophore مترافق الضد الثانوية (1:400 المخفف في برنامج تلفزيوني) إلى الأنسجة واحتضان في الظلام لمدة 1-2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  13. تغسل الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تكرار 2X.
  14. إضافة 30-40 مل من دابي الحل (0.2 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني) إلى الأنسجة داخل الدائرة.
  15. وضع بلطف زلة غطاء زجاجي على الأنسجة، مع الحرص على تجنب احتباس فقاعات الهواء. إذا يجب أن تظهر فقاعات الهواء، تحرك بحذر حول انزلاق الغطاء دون تدمير الاسكواش حتى الفقاعات الهروب من جانبي انزلاق الغطاء.
  16. استخدام تنظيف مسح لطخة الزائدة دابي من حواف الشريحة.
  17. ختم زلة تغطية إلى الشريحة باستخدام طلاء الأظافر واضحة.
  18. استخدام هذا المستحضرداخل ساعة القادمة 3-4 لعرض الخلايا immunostained بواسطة المجهر الفلورسنت. للتخزين على المدى الطويل من الشرائح (تصل إلى عدة أسابيع على الأقل)، واستخدام وسائل الاعلام من الصعب القائم على جبل الجلسرين مع دابي، وتخزين الشرائح في -20 ˚ C.
  19. بدلا من ذلك، وتحديد العينات في الميثانول بدلا من الفورمالديهايد (اعتمادا على مستضد). بعد الانتهاء من البروتوكول بأكمله من خلال الخطوة 3.2، تزج الشرائح من الخصيتين ممرود في الميثانول لمدة 10 دقيقة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية، والمضي قدما في الخطوة 3.5 فصاعدا.

النتائج

ويرد مثال على الزوج تشريح بشكل صحيح من ذبابة الفاكهة الذكور الأجهزة التناسلية في الشكل 2A. وترد الخصيتين إزالتها من البطن من الكبار ذبابة الذكور عادة إلى القناة قذفي (البني والشكل 2A ') وزوج من الغدد التبعي (الأخضر والشكل 2A') عن طريق ز...

Discussion

على الرغم من أن الخصيتين من نوع البرية الذباب يمكن تحديدها بسهولة بسبب اللون الأصفر بهم (على النقيض من الأنسجة البيضاء المجاورة)، الخصيتين متحولة من الذباب الأبيض هم من البيض، وبالتالي يمكن أحيانا أن الخلط بينه وبين القناة الهضمية. سلالات معظم المعدلة وراثيا، ا...

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

فإن الكتاب أود أن أشكر مايكل اندرسون لإقامة في المختبر لي هذه الطرق المقبولة لدراسة الحيوانات المنوية مع مشورة الخبراء من كارين هيلز. H. أودا وY. أكياما-أودا قدمت بسخاء γ-تويولين-GFP تطير الأوراق المالية. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01 منحة لLAL (GM074044).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
SylgardWorld Precision InstrumentsSYLG184Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish
PAP penFisher ScientificNC9888126Ted Pella #22309
Clear nail protectorWet n Wild7780235001
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPILife TechnologiesP36931
Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88)Sigma-AldrichT6557
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG Jackson ImmunoResearch115-165-003
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
EthanolFisher ScientificAC61511-0040
MethanolFisher ScientificA412-4
16% FormaldehydeThermo Fisher Scientific28908
SigmacoteSigma-AldrichSL2Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips
DAPISigma-AldrichD-95420.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20 °C
NaClResearch Products International Corp.S23020
Na2HPO4Sigma-AldrichS9763
NaH2PO4Sigma-AldrichS0751
Kimwipes delicate task wipersFisher ScientificS47299
BSAResearch Products International Corp.A30075Molecular biology grade
Glass Coplin staining jar, screw capElectron Microscopy Sciences70315
Single frosted microscope slidesCorning2948-75X25
Poly-L-lysine coated microscope slidesPolysciences, Inc.22247-1Optional (to replace untreated microscope slides )
Square cover glassCorning2865-22
Razor bladesFisher Scientific12-640
Kimax Petri dishFisher ScientificS31473Kimble #23060 10015 EMD
ForcepsDumont52100-51SPattern 5 INOX
Stemi 2000-CS stereoscopeCarl Zeiss
Eclipse 80iNikon
Plan-Fluor 40X objectiveNikon
AxiophotCarl Zeiss
Plan-Neofluar Ph2 40X objectiveCarl Zeiss

References

  1. McKim, K. S., Joyce, E. F., Jang, J. K. Cytological analysis of meiosis in fixed Drosophila ovaries. Methods Mol. Biol. 558, 197-216 (2009).
  2. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J. Vis. Exp. , (2012).
  3. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. . Drosophila Protocols. , 87-109 (2000).
  4. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Immunostaining of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1273-1275 (2011).
  5. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Methanol-acetone fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1270-1272 (2011).
  6. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Preparation of live testis squashes in Drosophila. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, (2011).
  7. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Formaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, (2012).
  8. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 102-104 (2012).
  9. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. F-actin staining of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 105-106 (2012).
  10. Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis. Anal. Biochem. 436, 55-64 (2013).
  11. Singh, S. R., Hou, S. X. Immunohistological techniques for studying the Drosophila male germline stem cell. Methods Mol. Biol. 450, 45-59 (2008).
  12. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster Testes. J. Vis. Exp. (2641), (2011).
  13. de Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis. Development. 138, 2861-2869 (2011).
  14. Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).
  15. Giansanti, M. G., Sechi, S., Frappaolo, A., Belloni, G., Piergentili, R. Cytokinesis in Drosophila male meiosis. Spermatogenesis. 2, 185-196 (2012).
  16. Matunis, E. L., Stine, R. R., de Cuevas, M. Recent advances in Drosophila male germline stem cell biology. Spermatogenesis. 2, 137-144 (2012).
  17. McKee, B. D., Yan, R., Tsai, J. H. Meiosis in male Drosophila. Spermatogenesis. 2, 167-184 (2012).
  18. Zoller, R., Schulz, C. The Drosophila cyst stem cell lineage: Partners behind the scenes. Spermatogenesis. 2, 145-157 (2012).
  19. Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. J. Cell Sci.. 107, 3521-3534 (1994).
  20. Rebollo, E., Gonzalez, C. Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes. EMBO Rep. 1, 65-70 (2000).
  21. Castrillon, D. H., et al. Toward a molecular genetic analysis of spermatogenesis in Drosophila melanogaster: characterization of male-sterile mutants generated by single P element mutagenesis. Genetics. 135, 489-505 (1993).
  22. Giansanti, M. G., et al. Genetic dissection of meiotic cytokinesis in Drosophila males. Mol. Biol. Cell. 15, 2509-2522 (2004).
  23. Wakimoto, B. T., Lindsley, D. L., Herrera, C. Toward a comprehensive genetic analysis of male fertility in Drosophila melanogaster. Genetics. 167, 207-216 (2004).
  24. Fuller, M. T., Bate, M., Martinez-Arias, A. . The Development of Drosophila melanogaster. , 71-147 (1993).
  25. Wolfner, M. F. Tokens of love: functions and regulation of Drosophila male accessory gland products. Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 179-192 (1997).
  26. Tram, U., Wolfner, M. F. Male seminal fluid proteins are essential for sperm storage in Drosophila melanogaster. Genetics. 153, 837-844 (1999).
  27. Kemphues, K. J., Raff, E. C., Raff, R. A., Kaufman, T. C. Mutation in a testis-specific beta-tubulin in Drosophila: analysis of its effects on meiosis and map location of the gene. Cell. 21, 445-451 (1980).
  28. Gunsalus, K. C., et al. Mutations in twinstar, a Drosophila gene encoding a cofilin/ADF homologue, result in defects in centrosome migration and cytokinesis. J. Cell Biol. 131, 1243-1259 (1995).
  29. Anderson, M. A., et al. Asunder is a critical regulator of dynein-dynactin localization during Drosophila spermatogenesis. Mol. Biol. Cell. 20, 2709-2721 (2009).
  30. Sitaram, P., Anderson, M. A., Jodoin, J. N., Lee, E., Lee, L. A. Regulation of dynein localization and centrosome positioning by Lis-1 and asunder during Drosophila spermatogenesis. Development. 139, 2945-2954 (2012).
  31. Martins, A. R., Machado, P., Callaini, G., Bettencourt-Dias, M. Microscopy methods for the study of centriole biogenesis and function in Drosophila. Methods in cell biology. 97, 223-242 (2010).
  32. Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and staining of Drosophila larval ovaries. J. Vis. Exp. (10), (2011).
  33. Gonzalez, C., Casal, J., Ripoll, P. Relationship between chromosome content and nuclear diameter in early spermatids of Drosophila melanogaster. Genet. Res. 54, 205-212 (1989).
  34. Liebrich, W. The effects of cytochalasin B and colchicine on the morphogenesis of mitochondria in Drosophila hydei during meiosis and early spermiogenesis. An in vitro study. Cell Tissue. Res. 224, 161-168 (1982).
  35. Wong, R., et al. PIP2 hydrolysis and calcium release are required for cytokinesis in Drosophila spermatocytes. Curr. Biol. 15, 1401-1406 (2005).
  36. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  37. White-Cooper, H. Tissue cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis. Spermatogenesis. 2, 11-22 (2012).
  38. Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes. PLoS Biol. 2, (2004).
  39. Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse live imaging of stem cells in Drosophila testis. Curr. Protoc. Stem Cell. Biol.. 2, 10-1002 (2009).
  40. Sheng, X. R., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138, 3367-3376 (2011).
  41. Belloni, G., et al. Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis. J. Cell Sci. 125, 5441-5452 (2012).
  42. Moon, S., Cho, B., Min, S. H., Lee, D., Chung, Y. D. The THO complex is required for nucleolar integrity in Drosophila spermatocytes. Development. 138, 3835-3845 (2011).
  43. Wang, Z., Mann, R. S. Requirement for two nearly identical TGIF-related homeobox genes in Drosophila spermatogenesis. Development. 130, 2853-2865 (2003).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

83

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved