Citológica Análise da espermatogênese: Preparados ao vivo e fixo<em&gt; Drosophila</em&gt; Testes

Resumo

Os métodos para isolar e preparar amostras de testículos de Drosophila (ao vivo e fixo) para geração de imagens por contraste de fase e microscopia de fluorescência são descritos aqui.

Resumo

Drosophila melanogaster é um poderoso sistema modelo que tem sido amplamente utilizado para elucidar de uma variedade de processos biológicos. Por exemplo, estudos, tanto do sexo feminino e as linhas germinativas masculinas de Drosophila têm contribuído grandemente para a compreensão atual da meiose, bem como a biologia de células-tronco. Excelente protocolos estão disponíveis na literatura para o isolamento e imagiologia de ovários e testículos ^3-12 Drosophila. Aqui, os métodos para a dissecação e preparação de testes de Drosophila para análise microscópica são descritos com uma demonstração em vídeo que o acompanha. Um protocolo para o isolamento de testículos do abdómen de adultos do sexo masculino e preparar as lâminas de tecido vivo, para análise por microscopia de contraste de fase, bem como o protocolo para a fixação e imunocoloração testículos para análise por microscopia de fluorescência são apresentados. Estas técnicas podem ser aplicadas na caracterização de mutantes de Drosophila que exibem defects na espermatogénese, assim como na visualização de localizações subcelulares de proteínas.

Introdução

Testículos de Drosophila são um sistema modelo ideal para o estudo de muitos processos biológicos incluindo a regulação das células estaminais, a meiose, e desenvolvimento do esperma ^13-18. Os espermatócitos e os seus fusos meióticos são grandes e, portanto, conveniente para análise citológica e relaxado checkpoints do ciclo celular durante a espermatogênese facilitar o estudo de mutações em genes do ciclo celular. Diferentes tipos de células pode ser observada na progressão ordenada ao longo do comprimento dos testículos, e qualquer interrupção da espermatogénese pode conduzir a alterações neste arranjo global. Estas características combinadas com ferramentas genéticas Drosophila têm facilitado a análise mutacional da espermatogênese ^21-23.

As fases de Drosophila espermatogénese foram bem definidos. As células da linha germinativa que se desenvolvem de forma síncrona nos cistos progredir sequencialmente através das fases de espermatogénese ao longo do comprimento do testículo. Durante both da mitose e meiose divisões das células germinais masculinas, citocinese ocorre de forma incompleta de modo a que as células filhas permanecem ligados por pontes citoplasmáticos conhecidos como canais de anel (Figura 1). A extremidade apical do testículo contém uma população de células estaminais da linha germinativa, que dá origem a células spermatogonial, que se submetem a quatro divisões mitóticas com citocinese incompletos para gerar cistos de 16 células de espermatócitos primários. Após a fase S pré-meiótica, espermatócitos primários entrar G2, um período prolongado de crescimento ~ 90 horas, durante o qual o volume celular aumenta ~ 25 vezes. Progressão através da meiose I e meiose II resulta na formação de quistos de 32 células de espermatócitos secundários e de cistos de 64 células de espermatídeos haplóides, respectivamente. As espermátides arredondadas, imaturos passam por extensos remodelamento celular para formar espermatozóides maduros. Células pós-meióticas, em especial os molhos de alongamento e espermatídeos maduros, ocupam a maior parte do volume do testículo.

Tele o transporte de sucesso de esperma funcional para moscas fêmeas requer a coordenação entre as diferentes partes do sistema reprodutor masculino, a qual é composta de várias estruturas emparelhados (os testículos, vesículas seminais e glândulas acessórias) e de uma única conduta ejaculatório (Figura 2). Os espermatozóides são produzidos dentro dos testículos e armazenado dentro das vesículas seminais até a cópula ^24. As glândulas acessórias conter células secretoras de fluido seminal. O esperma migração das vesículas seminais são misturados com o fluido seminal dentro do ducto ejaculatório, a qual está ligada a ambas as vesículas seminais e glândulas acessórias. Esta mistura de esperma e fluido seminal é finalmente bombeado para fora do macho no interior da vagina da fêmea voar através do bulbo ejaculatório localizado na extremidade posterior do abdómen macho ^25. As proteínas no fluido seminal, são essenciais para a armazenagem prolongada de esperma dentro de órgãos especializados conhecidos como Espermatecas na reptrato roductive de Drosophila fêmeas ^26.

Excelentes métodos para o isolamento de testículos de Drosophila e a visualização de células em vários estádios da espermatogénese estão disponíveis na literatura científica ^3-12. Nós aqui acrescentar a este corpo de conhecimento, apresentando exemplos desses protocolos com uma demonstração em vídeo que o acompanha. O protocolo para a preparação de amostras de testículos vivos para microscopia de fase de contraste baseia-se num método anteriormente descrito ^27. O protocolo para a fixação de formaldeído e imunocoloração de testículos também se baseia em um método previamente descrito ^28. As abordagens aqui descritos têm sido utilizados em vários estudos de Drosophila espermatogénese (por exemplo, para avaliar as funções da dineína, um motor de microtúbulos menos dirigida-fim, durante a espermatogénese de Drosophila).

Além dos protocolos básicos, são apresentadas sugestões para varying a dissecação, de modo a enriquecer a espermatogônias, espermatócitos, ou espermatozóides maduros. Diferentes métodos para o processamento dos testículos tais que cistos ou permanecem intactos ou são interrompidos quando necessário são descritos. Uma vantagem no uso de testículos de Drosophila como sistema modelo é que, em comparação com oócitos e embriões de Drosophila, os anticorpos e corantes podem facilmente penetrar nas células após a sua dispersão a partir dos testículos, e menos passos de lavagem são necessários, assim, os protocolos podem ser realizadas em um relativamente curto espaço de tempo.

Protocolo

1. Testes Dissection

1. Anestesiar moscas em uma garrafa ou frasco, usando um fluxo de CO ₂ e transferir para uma almofada de mosca.
2. Ordenar opera sob um microscópio de dissecação com um pequeno pincel, e recolher um número apropriado (dependendo do ensaio) de Drosophila, os machos dos genótipos desejáveis. Jovens do sexo masculino (0-2 dias de idade) são ideais para examinar as células ao longo das etapas anteriores da espermatogênese (por exemplo, espermatogônias, espermatócitos e espermátides iniciais pós-meióticas), enquanto que os homens um pouco mais velhos (2-5 dias de idade) são ideais para examinar células nos estágios finais da espermatogénese (em particular, o esperma maduro).
3. Use uma pinça para remover as asas de cada voar (para evitar que as moscas de flutuando no líquido durante a dissecção).
4. Adicionar ~ 500 ml de solução salina tamponada com fosfato (130 mM de NaCl, 7 mM de Na ₂ HPO _4, 3 mM de NaH ₂ PO _4; PBS) numa gota de um prato de dissecação com revestimento de silicone emum fundo preto. Outras soluções aquosas têm sido usados ​​com sucesso para os testículos dissecção ^3.
5. Ponto de fórceps para o anterior da mosca, segure-o pelo tórax e mergulhá-lo na queda PBS. Durante a visualização através do microscópio de dissecação, use outro par de fórceps para agarrar e puxar a genitália externa (estrutura marrom escuro localizado na extremidade posterior do abdome ventral) posteriormente até que ele se separa do abdômen. Na maioria dos casos, os testículos, vesículas seminais e glândula acessória vai ser removido do abdómen, juntamente com os órgãos genitais externos e, se não, inserir um único par de fórceps para o abdómen e provocar os testículos.
6. Testículos separadas de glândula acessória e genitais externos utilizando dois pares de pinças na gota de PBS (Figura 2). De tipo selvagem testículos são facilmente distinguidos dos tecidos brancos vizinhos por sua cor amarela. Vá imediatamente para a etapa 2.
7. Para isolar os testículos dos machos pharate (i.. E fechada dentro da caixa de pupa), um passo adicional tem de ser realizada primeiramente que envolve a remoção da mosca do caso de pupa, este passo tem sido previamente descrita ^31. Prossiga com dissecção como para os testículos adultos começando no passo 1.2.
8. Para isolar os testículos dos machos larvais, realizar uma modificação de um protocolo para isolar ovários de larvas de Drosophila ^32. Resumidamente, as larvas do sexo masculino pode ser distinguido a partir de larvas femininas pela presença de um par de estruturas grandes, claros, ovais (testículos larva) incorporados no terço posterior do corpo gordo. Para isolar os testículos larvais, parcialmente esfolar abrir a larva do sexo masculino para isolar os testículos e o corpo gordo circundante do abdómen, tal como descrito para o isolamento de ovários de larvas. Prosseguir imediatamente para a etapa 2 do protocolo aqui descrito, os testículos pode depois ser removido do corpo gordo pouco antes da montagem (passos 2.3 ou 3.14) como descrito para os ovários ^32.

2. Preparação de Amostras e imagem ao vivo

1. Use uma pinça para colocar suavemente 2-3 pares de testículos em uma gota de 4-5 ml de PBS em uma praça lamínula de vidro. Note-se que a razão entre o número testículos ao volume PBS pode precisar de ser ajustado: muito líquido vai evitar que as células se espalhe corretamente quando esmagado, enquanto muito pouco líquido fará com que as células de estourar quando esmagado. Opcional: Use capa siliconizada desliza para minimizar a aderência de tecido para cobrir deslizamento no passo 3.2.
2. Utilizar um par de pinças para rasgar cada testículo numa posição apropriada de modo a maximizar a presença de tipos de células da linha germinal desejados na preparação (notar que o conteúdo do testículo principalmente vai egresso da região rasgada na lâmina durante o esmagamento etapa.) Para enriquecer para espermatogônias e espermatócitos, rasgar abrir o testículo adjacente à sua ponta apical (nível 1, Figura 2B). Para enriquecer para espermatócitos e espermátides, rasgar abrir o testículo em um position ligeiramente basal ao nível 1 (nível 2, Figura 2B). Para enriquecimento em células da linha germinal mais maduros, rasgar a testículo mais perto de onde a curvatura começa (nível 3, Figura 2B).
3. Delicadamente, coloque uma lâmina de vidro sobre a lamínula para esmagar os testículos; não aplique pressão manualmente, como o peso de só a lamínula é suficiente para obter uma amostra adequada esmagado. Tente evitar bolhas de interceptação. Opcional: Utilização de poli-L-lisina revestido lâminas de microscópio para promover a aderência do tecido a deslizar no passo 3.2.
4. Use preparação imediatamente (de preferência dentro de 15 minutos de preparação) para observar células vivas por microscopia de contraste de fase, pois moscas transgênicas com expressão de proteínas fluorescentes marcados nos testículos, células vivas podem ser examinados por microscopia de fluorescência nesta etapa. Alternativamente, proceder com a fixação e coloração de anticorpos (Protocolo 3).
5. Gentilmente pavio qualquer excesso de líquido sob a lamela usando uma limpeza wipe para permitir o achatamento de preparação até que as células germinais são claramente em foco.

3. Formaldeído Fixação e Coloração Anticorpo

1. Encaixar congelar cada slide contendo testículos esmagados (das Protocolo 2) usando um par de pinças de metal para mergulhá-lo brevemente em nitrogênio líquido (até nitrogênio líquido pára borbulhando).
2. Retire a tampa de deslizamento imediatamente usando uma lâmina de barbear.
3. Use pinças metálicas para transferir lâminas para uma grade deslizante de vidro previamente arrefecido com gelo-etanol frio a 95% (grau de espectrofotometria, livre de metanol). Armazenar a -20 ° C durante 10 min.
4. Use pinças metálicas para transferir lâminas para uma grade deslizante de vidro cheio com 4% de formaldeído em PBS mais 0,1% de Triton X-100 (PBS-T). Armazenar à temperatura ambiente durante 7 min.
5. Use pinças de metal para transferir slides para um porta-lâminas de vidro cheio de PBS. Lavar as lâminas com PBS durante 5 minutos à temperatura ambiente. Repetir 1x. Executar todas as lavagens de solução descartando no rack lâmina de vidro ( Ie. derramando-o para fora) e substituindo com solução fresca.
6. Descartar o PBS e mergulhar as lâminas em PBS-T, durante 30 minutos à temperatura ambiente, para permeabilizar as membranas das células.
7. Lavar as lâminas com PBS durante 5 minutos à temperatura ambiente. Repetir 2x.
8. Bloqueio passo (opcional): mergulhar as lâminas em PBS mais 1% de BSA durante 45 min à temperatura ambiente.
9. Use uma caneta barreira hidrofóbica para desenhar um círculo no slide em torno de tecido amassado (facilmente visível a olho nu), a fim de limitar as soluções de anticorpos (adicionados em passos 3,9 e 3,11). O tecido deve ser mantido úmido em todos os momentos durante a execução de imunomarcação.
10. Adicionar 30-40 mL de anticorpo primário (diluído em PBS-T, 1:400 a 1:50, dependendo do anticorpo) para o tecido no interior do círculo. Se o bloqueio foi realizado, diluir o anticorpo primário em PBS-T + 1% de BSA. Anticorpo anti-gama-tubulina (por coloração de centrossomas na Figura 4) foi diluída de 1:100. Incubar em uma câmara escura úmida (caixa de plástico, por exemplo. Fechadocom toalhas de papel húmidas) durante 2 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
11. Lavar as lâminas em PBS por 5 min a sala de 3x de temperatura. Se o bloqueio foi realizado, lavar duas vezes em PBS-T, e uma vez em PBS (5 min a temperatura ambiente, cada um).
12. Adicionar 30-40 mL de anticorpo secundário conjugado com fluoróforo (diluído 1:400 em PBS) para o tecido e incubar no escuro durante 1-2 horas à temperatura ambiente.
13. Lavar as lâminas com PBS durante 5 minutos à temperatura ambiente. Repetir 2x.
14. Adicionar 30-40 mL de solução DAPI (0,2 mg / ml em PBS) para o tecido no interior do círculo.
15. Delicadamente, coloque uma lamínula de vidro sobre o tecido, tomando cuidado para evitar bolhas de interceptação. Se bolhas de ar devem aparecer, cuidadosamente mover ao redor da lamínula sem destruir a abóbora até que as bolhas escapar dos lados da lamínula.
16. Use uma limpeza limpar para apagar o excesso de DAPI a partir das bordas do slide.
17. Selar a lamela para o slide usando claro unha polonês.
18. Use esta preparaçãono próximo 3-4 hr para ver células imunomarcadas por microscopia fluorescente. Para o armazenamento de longo prazo de lâminas (até, pelo menos, várias semanas), use uma mídia difícil montar à base de glicerol com DAPI, e armazenar a -20 ˚ lâminas C.
19. Em alternativa, fixar as amostras em metanol em vez de formaldeído (dependendo do antigénio). Depois de completar todo o protocolo até a etapa 3.2, mergulhe as lâminas de testículos esmagados em metanol por 10 min a -20 ° C e prossiga com o passo 3.5 em diante.

Resultados

Um exemplo de um par adequadamente dissecados dos órgãos reprodutores masculinos de Drosophila é mostrado na Figura 2A. Testículos do abdómen da mosca adulta masculina está normalmente ligado ao ducto ejaculatório (castanho, Figura 2A ') e um par de glândulas acessórias (verde, Figura 2A'), através de um par de vesículas seminais (azul, Figura 2A ') . Para separar os testículos da maioria do tecido somático que o acompa...

Discussão

Embora os testículos de moscas do tipo selvagem pode ser facilmente identificado, devido à sua cor amarela (em contraste, os tecidos brancos vizinhos), os testículos de moscas mutantes brancos são brancos e, assim, eventualmente, pode ser confundido com o intestino. Mais estirpes transgénicas, que são tipicamente num fundo branco, também têm testículos branco porque o mini-gene de branco encontrada em P-elementos não promove a acumulação de pigmentos nos testículos. Quand...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard	World Precision Instruments	SYLG184	Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish
PAP pen	Fisher Scientific	NC9888126	Ted Pella #22309
Clear nail protector	Wet n Wild	7780235001
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI	Life Technologies	P36931
Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88)	Sigma-Aldrich	T6557
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-165-003
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100
Ethanol	Fisher Scientific	AC61511-0040
Methanol	Fisher Scientific	A412-4
16% Formaldehyde	Thermo Fisher Scientific	28908
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2	Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips
DAPI	Sigma-Aldrich	D-9542	0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20 °C
NaCl	Research Products International Corp.	S23020
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S9763
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S0751
Kimwipes delicate task wipers	Fisher Scientific	S47299
BSA	Research Products International Corp.	A30075	Molecular biology grade
Glass Coplin staining jar, screw cap	Electron Microscopy Sciences	70315
Single frosted microscope slides	Corning	2948-75X25
Poly-L-lysine coated microscope slides	Polysciences, Inc.	22247-1	Optional (to replace untreated microscope slides )
Square cover glass	Corning	2865-22
Razor blades	Fisher Scientific	12-640
Kimax Petri dish	Fisher Scientific	S31473	Kimble #23060 10015 EMD
Forceps	Dumont	52100-51S	Pattern 5 INOX
Stemi 2000-CS stereoscope	Carl Zeiss
Eclipse 80i	Nikon
Plan-Fluor 40X objective	Nikon
Axiophot	Carl Zeiss
Plan-Neofluar Ph2 40X objective	Carl Zeiss