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Method Article
Os métodos para isolar e preparar amostras de testículos de Drosophila (ao vivo e fixo) para geração de imagens por contraste de fase e microscopia de fluorescência são descritos aqui.
Drosophila melanogaster é um poderoso sistema modelo que tem sido amplamente utilizado para elucidar de uma variedade de processos biológicos. Por exemplo, estudos, tanto do sexo feminino e as linhas germinativas masculinas de Drosophila têm contribuído grandemente para a compreensão atual da meiose, bem como a biologia de células-tronco. Excelente protocolos estão disponíveis na literatura para o isolamento e imagiologia de ovários e testículos 3-12 Drosophila. Aqui, os métodos para a dissecação e preparação de testes de Drosophila para análise microscópica são descritos com uma demonstração em vídeo que o acompanha. Um protocolo para o isolamento de testículos do abdómen de adultos do sexo masculino e preparar as lâminas de tecido vivo, para análise por microscopia de contraste de fase, bem como o protocolo para a fixação e imunocoloração testículos para análise por microscopia de fluorescência são apresentados. Estas técnicas podem ser aplicadas na caracterização de mutantes de Drosophila que exibem defects na espermatogénese, assim como na visualização de localizações subcelulares de proteínas.
Testículos de Drosophila são um sistema modelo ideal para o estudo de muitos processos biológicos incluindo a regulação das células estaminais, a meiose, e desenvolvimento do esperma 13-18. Os espermatócitos e os seus fusos meióticos são grandes e, portanto, conveniente para análise citológica e relaxado checkpoints do ciclo celular durante a espermatogênese facilitar o estudo de mutações em genes do ciclo celular. Diferentes tipos de células pode ser observada na progressão ordenada ao longo do comprimento dos testículos, e qualquer interrupção da espermatogénese pode conduzir a alterações neste arranjo global. Estas características combinadas com ferramentas genéticas Drosophila têm facilitado a análise mutacional da espermatogênese 21-23.
As fases de Drosophila espermatogénese foram bem definidos. As células da linha germinativa que se desenvolvem de forma síncrona nos cistos progredir sequencialmente através das fases de espermatogénese ao longo do comprimento do testículo. Durante both da mitose e meiose divisões das células germinais masculinas, citocinese ocorre de forma incompleta de modo a que as células filhas permanecem ligados por pontes citoplasmáticos conhecidos como canais de anel (Figura 1). A extremidade apical do testículo contém uma população de células estaminais da linha germinativa, que dá origem a células spermatogonial, que se submetem a quatro divisões mitóticas com citocinese incompletos para gerar cistos de 16 células de espermatócitos primários. Após a fase S pré-meiótica, espermatócitos primários entrar G2, um período prolongado de crescimento ~ 90 horas, durante o qual o volume celular aumenta ~ 25 vezes. Progressão através da meiose I e meiose II resulta na formação de quistos de 32 células de espermatócitos secundários e de cistos de 64 células de espermatídeos haplóides, respectivamente. As espermátides arredondadas, imaturos passam por extensos remodelamento celular para formar espermatozóides maduros. Células pós-meióticas, em especial os molhos de alongamento e espermatídeos maduros, ocupam a maior parte do volume do testículo.
Tele o transporte de sucesso de esperma funcional para moscas fêmeas requer a coordenação entre as diferentes partes do sistema reprodutor masculino, a qual é composta de várias estruturas emparelhados (os testículos, vesículas seminais e glândulas acessórias) e de uma única conduta ejaculatório (Figura 2). Os espermatozóides são produzidos dentro dos testículos e armazenado dentro das vesículas seminais até a cópula 24. As glândulas acessórias conter células secretoras de fluido seminal. O esperma migração das vesículas seminais são misturados com o fluido seminal dentro do ducto ejaculatório, a qual está ligada a ambas as vesículas seminais e glândulas acessórias. Esta mistura de esperma e fluido seminal é finalmente bombeado para fora do macho no interior da vagina da fêmea voar através do bulbo ejaculatório localizado na extremidade posterior do abdómen macho 25. As proteínas no fluido seminal, são essenciais para a armazenagem prolongada de esperma dentro de órgãos especializados conhecidos como Espermatecas na reptrato roductive de Drosophila fêmeas 26.
Excelentes métodos para o isolamento de testículos de Drosophila e a visualização de células em vários estádios da espermatogénese estão disponíveis na literatura científica 3-12. Nós aqui acrescentar a este corpo de conhecimento, apresentando exemplos desses protocolos com uma demonstração em vídeo que o acompanha. O protocolo para a preparação de amostras de testículos vivos para microscopia de fase de contraste baseia-se num método anteriormente descrito 27. O protocolo para a fixação de formaldeído e imunocoloração de testículos também se baseia em um método previamente descrito 28. As abordagens aqui descritos têm sido utilizados em vários estudos de Drosophila espermatogénese (por exemplo, para avaliar as funções da dineína, um motor de microtúbulos menos dirigida-fim, durante a espermatogénese de Drosophila).
Além dos protocolos básicos, são apresentadas sugestões para varying a dissecação, de modo a enriquecer a espermatogônias, espermatócitos, ou espermatozóides maduros. Diferentes métodos para o processamento dos testículos tais que cistos ou permanecem intactos ou são interrompidos quando necessário são descritos. Uma vantagem no uso de testículos de Drosophila como sistema modelo é que, em comparação com oócitos e embriões de Drosophila, os anticorpos e corantes podem facilmente penetrar nas células após a sua dispersão a partir dos testículos, e menos passos de lavagem são necessários, assim, os protocolos podem ser realizadas em um relativamente curto espaço de tempo.
1. Testes Dissection
2. Preparação de Amostras e imagem ao vivo
3. Formaldeído Fixação e Coloração Anticorpo
Um exemplo de um par adequadamente dissecados dos órgãos reprodutores masculinos de Drosophila é mostrado na Figura 2A. Testículos do abdómen da mosca adulta masculina está normalmente ligado ao ducto ejaculatório (castanho, Figura 2A ') e um par de glândulas acessórias (verde, Figura 2A'), através de um par de vesículas seminais (azul, Figura 2A ') . Para separar os testículos da maioria do tecido somático que o acompa...
Embora os testículos de moscas do tipo selvagem pode ser facilmente identificado, devido à sua cor amarela (em contraste, os tecidos brancos vizinhos), os testículos de moscas mutantes brancos são brancos e, assim, eventualmente, pode ser confundido com o intestino. Mais estirpes transgénicas, que são tipicamente num fundo branco, também têm testículos branco porque o mini-gene de branco encontrada em P-elementos não promove a acumulação de pigmentos nos testículos. Quand...
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Os autores gostariam de agradecer a Michael Anderson para a criação em laboratório Lee estes métodos aceitos para estudar espermatogênese com aconselhamento especializado de Karen Hales. H. Oda e Y. Akiyama-Oda generosamente forneceu a γ-tubulina-GFP voar estoque. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa NIH R01 para LAL (GM074044).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Sylgard | World Precision Instruments | SYLG184 | Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish |
PAP pen | Fisher Scientific | NC9888126 | Ted Pella #22309 |
Clear nail protector | Wet n Wild | 7780235001 | |
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88) | Sigma-Aldrich | T6557 | |
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-003 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
Ethanol | Fisher Scientific | AC61511-0040 | |
Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
16% Formaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | |
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips |
DAPI | Sigma-Aldrich | D-9542 | 0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20°C |
NaCl | Research Products International Corp. | S23020 | |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9763 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
Kimwipes delicate task wipers | Fisher Scientific | S47299 | |
BSA | Research Products International Corp. | A30075 | Molecular biology grade |
Glass Coplin staining jar, screw cap | Electron Microscopy Sciences | 70315 | |
Single frosted microscope slides | Corning | 2948-75X25 | |
Poly-L-lysine coated microscope slides | Polysciences, Inc. | 22247-1 | Optional (to replace untreated microscope slides ) |
Square cover glass | Corning | 2865-22 | |
Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
Kimax Petri dish | Fisher Scientific | S31473 | Kimble #23060 10015 EMD |
Forceps | Dumont | 52100-51S | Pattern 5 INOX |
Name of Equipment | Company | ||
Stemi 2000-CS stereoscope | Carl Zeiss | ||
Eclipse 80i | Nikon | ||
Plan-Fluor 40x objective | Nikon | ||
Axiophot | Carl Zeiss | ||
Plan-Neofluar Ph2 40x objective | Carl Zeiss |
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