ניתוח ציטולוגית של תאי זרע: הכנות בשידור חי והקבועות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אשכים

Summary

שיטות לבידוד והכנת דגימות דרוזופילה אשכים (לחיות וקבוע) להדמיה על ידי שלב בניגוד ומיקרוסקופ פלואורסצנטי מתוארים במסמך זה.

Abstract

תסיסנית היא מערכת מודל רבת עוצמה שכבר בשימוש נרחב על מנת להבהיר מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים. לדוגמא, מחקרים של שתי נשים וקווים נבט זכר של דרוזופילה תרמו רב להבנה הנוכחית של מיוזה כמו גם ביולוגיה של תאי גזע. פרוטוקולים מצוינים זמינים בספרות לבידוד וההדמיה של השחלות ואשכים דרוזופילה ^3-12. בזאת, שיטות לנתיחה והכנת האשכים דרוזופילה ניתוח מיקרוסקופי מתוארות בהפגנת וידאו נלווית. פרוטוקול לבידוד אשכים מהבטן של זכרים בוגרים והכנת שקופיות של רקמת חיה לניתוח על ידי מיקרוסקופ שלב בניגוד, כמו גם פרוטוקול לתיקון וimmunostaining אשכים לניתוח על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי מוצגים. ניתן ליישם את הטכניקות הללו באפיון של מוטציות דרוזופילה כי תערוכת דefects בתאי זרע, כמו גם בהדמיה של מגויר subcellular של חלבונים.

Introduction

האשכים דרוזופילה הם מערכת מודל אידיאלית לחקר תהליכים ביולוגיים רבים, כולל רגולציה של תאי גזע, מיוזה, ופיתוח זרע ^13-18. Spermatocytes וצירי meiotic שלהם הם גדולים, ולכן נוחים לניתוח ציטולוגית, ומחסומי מחזור התא רגועים במהלך spermatogenesis להקל על המחקר של מוטציות בגנים מחזור התא. ניתן להבחין בסוגים שונים של תאים בהתקדמות הורה לאורכו של האשכים, ושיבוש כלשהו בתאי זרע יכול להוביל לשינויים בהסדר הכולל הזה. תכונות אלה בשילוב עם כלים גנטיים דרוזופילה הקלו ניתוח מוטאציות של תאי הזרע ^21-23.

השלבים של spermatogenesis דרוזופילה כבר מוגדרים היטב. תאים בתאי מין שמתפתחים באופן סינכרוני בתוך ציסטות התקדמות רציפות בשלבים של תאי זרע לאורכו של האשך. במהלך בוה המיטוטי וחטיבות meiotic של תאי נבט הזכר, cytokinesis מתרחש באופן חלקי כך שתאי הבת להישאר מחוברים על ידי גשרי cytoplasmic המכונים תעלות טבעת (איור 1). קצה הקודקוד של האשך מכיל אוכלוסייה של תאי גזע בתאי מין שמעוררת תאי spermatogonial, אשר עוברים ארבע חטיבות המיטוטי עם cytokinesis שלם כדי לייצר ציסטות 16 תאים של spermatocytes העיקרי. לאחר שלב S premeiotic, spermatocytes העיקרי להיכנס G2, תקופת צמיחה ממושכת של ~ 90 שעות שבמהלכו עליות נפח סלולארי ~ פי 25. התקדמות דרכי מיוזה ומיוזה השנייה תוצאות בהיווצרות ציסטות 32 תא של spermatocytes המשני וציסטות 64 תא של spermatids הפלואידים, בהתאמה. Spermatids לא בשלה, העגול עובר שיפוץ נרחב סלולארי כדי ליצור זרע בוגרים. תאים שלאחר meiotic, בפרט הצרורות של מתארך וspermatids הבוגר, תופסים הרבה הנפח של האשך.

Tהוא הובלה מוצלחת של זרע פונקציונלי לזבובים נשיים דורשת תיאום בין החלקים השונים של מערכת הרבייה הגברית, שמורכבת מכמה מבני זיווג (האשכים, שלפוחית ​​זרע ובלוטות עזר) ותעלת שופכה אחד (איור 2). זרע מיוצר בתוך האשכים ומאוחסן בתוך שלפוחית ​​הזרע עד הזדווגות ^24. בלוטות האבזר מכילות תאי הפרשה המייצרים את נוזל זרע. הזרע נודד משלפוחית ​​הזרע מעורבב עם נוזל זרע בתוך צינור השופכה, אשר מחובר לשתי שלפוחית ​​הזרע ובלוטות האבזר. תערובת זו של זרע ונוזל זרע נשאבת סופו של דבר מחוץ לזכר לתוך הנרתיק של הנקבה לעוף בנורת השפיכה ממוקמת בקצה האחורי של ²⁵ בטן הגברית. חלבונים בתוך נוזל הזרע הם חיוניים לאחסון ממושך של זרע בתוך איברים מתמחים המכונים spermathecae בנציגמערכת roductive של נקבות דרוזופילה ^26.

שיטות מצוינות לבידודה של אשכים דרוזופילה ויזואליזציה של תאים בשלבים שונים של תאי זרע זמינות בספרות המדעית ^3-12. אנחנו בזאת להוסיף לגוף זה של ידע על ידי הצגת דוגמאות של פרוטוקולים אלה עם הפגנת וידאו נלווית. הפרוטוקול להכנת דגימות אשכים חיים למיקרוסקופ שלב בניגוד מבוסס על שיטה שתוארה לעיל ^27. הפרוטוקול לקיבעון פורמלדהיד וimmunostaining של אשכים מבוססים גם על שיטה שתוארה לעיל ^28. הגישות המתוארות כאן נעשו שימוש במחקרים רבים של תאי זרע דרוזופילה (לדוגמא, על מנת להעריך את התפקידים של dynein, מנוע microtubule מינוס מכוון סופו של דבר בתאי זרע דרוזופילה).

בנוסף לפרוטוקולים הבסיסיים, הצעות ניתנות לvaryinגרם לנתיחה על מנת להעשיר לspermatogonia, spermatocytes, או זרע בוגרים. שיטות שונות לעיבוד האשכים כך שציסטות או יישארו ללא שינוי או הם שיבשו במידת הצורך מתוארים. יתרון בשימוש באשכי דרוזופילה כמערכת מודל הוא כי בהשוואה לביציות דרוזופילה ועוברים, נוגדנים וצבעים יכולים בקלות לחדור לתאים הבאים פיזורם מהאשכים, ושלבי כביסה פחות נדרשים, ולכן ניתן לבצע פרוטוקולים באופן יחסי זמן קצר.

Protocol

1. Dissection אשכים

1. הרדימי זבובים בבקבוק או בקבוקון באמצעות זרם של CO ₂ ולהעביר למשטח לטוס.
2. מיין זבובים תחת מיקרוסקופ לנתח באמצעות מכחול קטן, ולאסוף מספר מתאים (תלוי בניסוי) של הזכרים דרוזופילה של גנוטיפים הרצויים. זכרים צעירים (בן 0-2 ימים) הם אידיאליים לבחינת תאים בשלבים המוקדמים של תאי זרע (למשל spermatogonia, spermatocytes, וspermatids פוסט meiotic המוקדם), ואילו גברים מעט מבוגרים (בן 2-5 ימים) הם אידיאליים לבחינת תאים בשלבים הסופיים של תאי זרע (בפרט, להבשיל זרע).
3. שימוש במלקחיים כדי להסיר את הכנפיים מלטוס (כדי למנוע מהזבובים צפים בנוזל בזמן נתיחה).
4. להוסיף ~ 500 מיליליטר של פוספט שנאגרו מלוח (130 mM NaCl, 7 מ"מ Na ₂ HPO _4, 3 מ"מ לאא ₂ PO _4; PBS) בירידה לצלחת לנתיחה מצופה סיליקון עלרקע שחור. תמיסות מימיות אחרות שימשו בהצלחה לאשכים לנתיחה ^3.
5. נקודת המלקחיים לכיוון הקדמי של הזבוב, לתפוס אותו על ידי בית החזה, ולטבול אותו בטיפת PBS. במהלך הצגה מבעד למיקרוסקופ לנתח, להשתמש בזוג נוסף של מלקחיים לתפוס ולמשוך את אברי המין החיצוניים (מבנה בצבע חום כהה הממוקם בקצה האחורי של בטן הגחון) בדיעבד עד שהוא מתנתק מהבטן. ברוב המקרים, האשכים, שלפוחית ​​זרע ובלוטת אבזר יוסרו מהבטן יחד עם אברי המין החיצוניים, אם לא, להכניס זוג אחד של מלקחיים לתוך הבטן ולהקניט את האשכים.
6. אשכים נפרדים מבלוטת אבזר ואברי מין חיצוני באמצעות שני זוגות מלקחיים בירידת PBS (איור 2). אשכים wild-type בקלות להבחין בין רקמות שכנות הלבנות לפי צבעם הצהוב. פנה מייד לצעד 2.
7. כדי לבודד אשכים מזכרי pharate (i .. הדואר הסגור בתוך המקרה גלמי), צריך קודם לבצע צעד נוסף שכרוך בהסרה לטוס מהמקרה גלמי; שלב זה כבר תואר בעבר במקום אחר ^{ביום 31.} להמשיך עם נתיחה כלאשכים למבוגרים מתחילים בצעד 1.2.
8. כדי לבודד אשכים מזכרי זחל, לבצע שינוי של פרוטוקול לבידוד השחלות זחל דרוזופילה ^32. בקצרה, זחלי זכר ניתן להבחין בין זחלים נשיים על ידי הנוכחות של זוג המבנים גדולים, ברורים, סגלגלים (אשכים זחל) משובצים בשליש האחורי של השומן בגוף. כדי לבודד אשכים זחל, באופן חלקי לפשוט את העור לפתוח את זחל הזכר לבודד את האשכים ושומן הגוף סביב מהבטן כפי שתואר עבור הבידוד של השחלות זחל. פנה מייד לשלב 2 של הפרוטוקול המתואר במסמך זה; האשכים יכולים להיות מאוחר יותר הוסרו מהגוף השומן רק לפני ההרכבה (שלבים 2.3 או 3.14) כפי שתואר לשחלות ^32.

ss = "jove_title"> 2. לדוגמא הכנה והדמית חיה

1. השתמש זוג מלקחיים למקום בעדינות 2-3 זוגות של אשכים בירידה של 4-5 מיליליטר של PBS על להחליק את מכסה זכוכית מרובע. שים לב שהיחס בין מספר אשכים לPBS עוצמת שמע עשוי צריך להיות מותאם: יותר מדי נוזלים ימנעו תאים מלהתפשט כראוי כאשר נמעכו, ואילו נוזל מעט מדי יגרום לתאים להתפוצץ כאשר מעוך. אופציונאלי: כיסוי siliconized שימוש מחליק כדי למזער את ההיצמדות של רקמות כדי לכסות להחליק בשלב 3.2.
2. השתמש זוג המלקחיים לקרוע פתוח כל אשך בעמדה מתאימה כדי למקסם את נוכחותם של סוגי התאים הרצויים בתאי מין בהכנה (שים לב שהתוכן של האשך תהיה בעיקר יציאה מהאזור הקרוע לשקופית במעיכה צעד.) כדי להעשיר לspermatogonia וspermatocytes, לקרוע לפתוח את האשך סמוך לקצה הקודקוד שלה (ברמה 1, איור 2). כדי להעשיר לspermatocytes וspermatids, דמעה לפתוח את האשך בקופהition מעט בסיס לרמת 1 (רמה 2, איור 2). כדי להעשיר את תאים בתאי מין בוגרים יותר, קורע את האשך קרוב יותר למקום שבי העקמומיות מתחילה (רמה 3, תרשים 2B).
3. מניח בעדינות שקופית מיקרוסקופ זכוכית על להחליק את המכסה למחוץ את האשכים; לא להפעיל לחץ באופן ידני כמו המשקל של להחליק את המכסה בלבד מספיק כדי להשיג מדגם מעוך כמו שצריך. נסה להימנע מלכידת בועות אוויר. אופציונאלי: מיקרוסקופ השתמש פולי-L-ליזין מצופה מחליק לקדם היצמדות של רקמות כדי להחליק בשלב 3.2.
4. להשתמש בתכשיר באופן מיידי (באופן אידיאלי בתוך 15 דקות של הכנה) להתבונן תאי חיים על ידי מיקרוסקופ שלב בניגוד; לזבובים מהונדסים עם ביטוי של חלבונים מתויגים fluorescently באשכים, ניתן לבדוק תאי חיים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשלב זה. לחלופין, להמשיך עם קיבעון ומכתים נוגדן (פרוטוקול 3).
5. בעדינות פתיל את נוזלי עודפים מתחת coverslip באמצעות ניקוי wipe לאפשר השטחת ההכנה עד תאי הנבט הם בבירור בפוקוס.

3. פורמלדהיד קיבוע ונוגדן מכתים

1. הצמד להקפיא כל שקופית המכילה אשכים מעוכים (מפרוטוקול 2) באמצעות מלקחי מתכת כדי לטבול אותו בקצרה בחנקן נוזלי (עד חנקן נוזלי מפסיק מבעבע).
2. הסר את תלוש לכסות באופן מיידי באמצעות סכין גילוח.
3. השתמש במלקחי מתכת כדי להעביר שקופיות למדף זכוכית שקופית prechilled מלא באתנול 95% קרים כקרח (הכיתה spectrophotometric, נטול מתנול). חנות ב -20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
4. השתמש במלקחי מתכת כדי להעביר שקופיות למתלת שקופיות זכוכית מלאות בפורמלין 4% ב-PBS בתוספת 0.1% טריטון X-100 (PBS-T). לאחסן בטמפרטורת חדר למשך 7 דקות.
5. השתמש במלקחי מתכת כדי להעביר שקופיות למתלת שקופיות זכוכית מלאות PBS. לשטוף שקופיות PBS במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. חזור על 1x. לבצע את כל שוטף על ידי השלכת פתרון במעמד שקופיות זכוכית ( כלומר. על ידי שפיכתו החוצה) והחלפה עם פתרון טרי.
6. מחק את PBS ולטבול את השקופיות ב-PBS-T ל30 דקות בטמפרטורת חדר כדי permeabilize קרום תא.
7. לשטוף שקופיות PBS במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. חזור על 2x.
8. חסימת צעד (לא חובה): לטבול את השקופיות ב PBS בתוספת BSA 1% ל45 דקות בטמפרטורת חדר.
9. השתמש בעט מחסום הידרופובי לצייר עיגול בשקופית סביב רקמה מעוכה (נראית בקלות בעין) על מנת להגביל את פתרונות הנוגדנים (הוסיפו בצעדי 3.9 ו3.11). הרקמות צריכה להישמר לחה בכל העת בעת ביצוע immunostaining.
10. הוספת 30-40 מיליליטר של נוגדן ראשוני (בדילול מלא PBS-T, 1:400 ל1:50, בהתאם לנוגדנים) לרקמה בתוך המעגל. אם החסימה בוצעה, לדלל נוגדן ראשוני ב-PBS-T בתוספת BSA 1%. נוגדן אנטי גמא טובולין (לצביעת centrosomes באיור 4) היה מדולל 1:100. דגירה בתא לח, כהה (קופסא פלסטיק סגורה לדוגמא.במגבות לחות נייר) עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 ° C.
11. לשטוף שקופיות PBS במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר 3x. אם החסימה בוצעה, לשטוף פעמים PBS-T ופעם אחת ב-PBS (5 דקות בטמפרטורת חדר כל אחד).
12. הוספת 30-40 מיליליטר של נוגדן fluorophore מצומדות המשני (בדילול 1:400 ב-PBS) לרקמות דגירה בחושך במשך 1-2 שעות בטמפרטורת חדר.
13. לשטוף שקופיות PBS במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. חזור על 2x.
14. הוספת 30-40 מיליליטר של תמיסת DAPI (0.2 מ"ג / מיליליטר PBS) לרקמה בתוך המעגל.
15. מניח בעדינות להחליק את מכסה זכוכית על הרקמות, לטפל כדי למנוע לכידת בועות אוויר. אם בועות האוויר אמורות להופיע, לנוע בזהירות סביב להחליק את המכסה מבלי להרוס את הקישואים עד שהבועות לברוח מן הצדדים של להחליק את המכסה.
16. השתמש ניקוי לנגב למחוק DAPI העודף מהקצוות של השקופיות.
17. לאטום להחליק את המכסה לשקופית באמצעות לק ברור.
18. להשתמש בתכשיר זהבתוך 3-4 שעות הבאות כדי להציג תאי immunostained על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עבור אחסון לטווח ארוך של שקופיות (עד לפחות כמה שבועות), יש להשתמש באמצעי תקשורת קשה הר מבוסס גליצרול עם DAPI, ושקופיות חנות ב -20 ˚ C.
19. לחלופין, לתקן את הדגימות במתנול במקום פורמלדהיד (תלוי באנטיגן). לאחר שסיים את הפרוטוקול כולו דרך שלב 3.2, לטבול את השקופיות של אשכים מעוכים במתנול 10 דקות ב -20 מעלות צלזיוס ולהמשיך בשלב 3.5 ואילך.

תוצאות

דוגמא של זוג גזור כהלכה של איברי הרבייה של גבר דרוזופילה מוצגת באיור 2 א. אשכים הוסרו מהבטן של זבוב זכר הבוגר מצורפים בדרך כלל לצינור השופכה (חום, איור 2 א ') וזוג בלוטות אבזר (הירוק, איור 2 א') באמצעות זוג שלפוחית ​​זרע (הכחול, איו?...

Discussion

למרות שהאשכים של זבובים פראי מסוג ניתן לזהות בקלות בשל צבעם הצהוב (בניגוד לרקמות שכנות הלבנות), האשכים של זבובים שעברו מוטציה לבנים הם לבנים ולכן לעתים ניתן להתבלבל עם הבטן. זנים מהונדסים ביותר, אשר בדרך כלל ברקע לבן, יש גם אשכים לבנים בגלל גן המיני לבן ש...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard	World Precision Instruments	SYLG184	Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish
PAP pen	Fisher Scientific	NC9888126	Ted Pella #22309
Clear nail protector	Wet n Wild	7780235001
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI	Life Technologies	P36931
Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88)	Sigma-Aldrich	T6557
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-165-003
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100
Ethanol	Fisher Scientific	AC61511-0040
Methanol	Fisher Scientific	A412-4
16% Formaldehyde	Thermo Fisher Scientific	28908
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2	Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips
DAPI	Sigma-Aldrich	D-9542	0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20°C
NaCl	Research Products International Corp.	S23020
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S9763
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S0751
Kimwipes delicate task wipers	Fisher Scientific	S47299
BSA	Research Products International Corp.	A30075	Molecular biology grade
Glass Coplin staining jar, screw cap	Electron Microscopy Sciences	70315
Single frosted microscope slides	Corning	2948-75X25
Poly-L-lysine coated microscope slides	Polysciences, Inc.	22247-1	Optional (to replace untreated microscope slides )
Square cover glass	Corning	2865-22
Razor blades	Fisher Scientific	12-640
Kimax Petri dish	Fisher Scientific	S31473	Kimble #23060 10015 EMD
Forceps	Dumont	52100-51S	Pattern 5 INOX
Name of Equipment	Company
Stemi 2000-CS stereoscope	Carl Zeiss
Eclipse 80i	Nikon
Plan-Fluor 40x objective	Nikon
Axiophot	Carl Zeiss
Plan-Neofluar Ph2 40x objective	Carl Zeiss