Análisis citológico de espermatogénesis: Los preparativos en directo y fijas de<em&gt; Drosophila</em&gt; Testículos

Resumen

Los métodos para aislar y preparar muestras de Drosophila testículos (en directo y fijo) para obtener imágenes de contraste de fase y microscopía de fluorescencia se describen en este documento.

Resumen

Drosophila melanogaster es un sistema modelo de gran alcance que ha sido ampliamente utilizado para dilucidar una variedad de procesos biológicos. Por ejemplo, los estudios tanto de la mujer y las líneas germinales masculinas de Drosophila han contribuido en gran medida a la comprensión actual de la meiosis, así como la biología de células madre. Excelente protocolos están disponibles en la literatura para el aislamiento y formación de imágenes de los ovarios y los testículos ^3-12 de Drosophila. En la presente memoria, los métodos para la disección y preparación de testículos de Drosophila para el análisis microscópico se describen con una demostración de vídeo adjunto. Un protocolo para el aislamiento de los testículos del abdomen de los hombres adultos y preparar diapositivas de tejido vivo para el análisis por microscopía de contraste de fase, así como un protocolo para la fijación y la inmunotinción testículos para el análisis por microscopía de fluorescencia se presentan. Estas técnicas se pueden aplicar en la caracterización de mutantes de Drosophila que exhiben defects en la espermatogénesis, así como en la visualización de localizaciones subcelulares de las proteínas.

Introducción

Testículos de Drosophila son un sistema modelo ideal para el estudio de muchos procesos biológicos, incluyendo la regulación de células madre, la meiosis, y el desarrollo del esperma ^13-18. Los espermatocitos y sus husos meióticos son grandes y por lo tanto, conveniente para el análisis citológico, y los puntos de control del ciclo celular relajado durante la espermatogénesis facilitar el estudio de mutaciones en los genes del ciclo celular. Diferentes tipos de células se pueden observar en la progresión ordenada a lo largo de la longitud de los testículos, y cualquier interrupción de la espermatogénesis pueden conducir a cambios en esta disposición general. Estas características, combinadas con herramientas genéticas Drosophila han facilitado el análisis mutacional de la espermatogénesis ^21-23.

Las etapas de la espermatogénesis de Drosophila han sido bien definido. Células de la línea germinal que se desarrollan de forma sincrónica dentro de quistes progresan secuencialmente a través de las etapas de la espermatogénesis a lo largo de la longitud de los testículos. Durante boª de la mitosis y divisiones meióticas de las células germinales masculinas, la citocinesis ocurre de forma incompleta de manera que las células hijas permanecen conectadas por puentes citoplásmicos conocidas como canales de anillo (Figura 1). La punta apical del testículo contiene una población de células madre de línea germinal que da lugar a células de espermatogonias, que se someten a cuatro divisiones mitóticas con la citocinesis incompleta para generar quistes 16 de células de espermatocitos primarios. Después de la fase S premeiotic, espermatocitos primarios entran G2, un período de crecimiento prolongado de ~ 90 horas durante el cual aumenta el volumen celular ~ 25 veces. La progresión a través de la meiosis I y la meiosis II resultados en la formación de quistes 32 de células de espermatocitos secundarios y quistes 64 de células de espermátides haploides, respectivamente. Las espermátidas redondas, inmaduros experimentan una amplia remodelación celular para formar espermatozoides maduros. Células post-meióticas, en particular, los haces de alargamiento y espermátidas maduras, ocupan gran parte del volumen de los testículos.

Tque el transporte de los espermatozoides éxito funcional a las moscas hembras requiere la coordinación entre las diferentes partes del sistema reproductor masculino, que se compone de varias estructuras apareadas (los testículos, las vesículas seminales y glándulas accesorias) y un único conducto eyaculador (Figura 2). Los espermatozoides se producen en los testículos y se almacenan en las vesículas seminales hasta la cópula ^24. Las glándulas accesorias contienen células secretoras que producen el líquido seminal. El esperma de la migración de las vesículas seminales se mezclan con el líquido seminal dentro del conducto eyaculador, que está conectado tanto a las vesículas seminales y las glándulas accesorias. Esta mezcla de espermatozoides y fluido seminal se bombea en última instancia fuera del macho en la vagina de la hembra volar a través de la bombilla de la eyaculación situado en el extremo posterior del macho abdomen ^25. Las proteínas en el líquido seminal son esenciales para el almacenamiento prolongado de espermatozoides dentro de los órganos especializados conocidos como espermatecas en el representantetracto roductiva de las hembras de Drosophila ^26.

Excelente métodos para el aislamiento de los testículos de Drosophila y visualización de células en diversas etapas de la espermatogénesis están disponibles en la literatura científica ^3-12. Estamos aquí añadimos a este conjunto de conocimientos mediante la presentación de ejemplos de estos protocolos con una demostración en video que lo acompaña. El protocolo para la preparación de los testículos en vivo muestras para microscopía de contraste de fase se basa en un método descrito previamente ^27. El protocolo para la fijación de formaldehído y la inmunotinción de testículos también se basa en un método descrito previamente ^28. Los enfoques descritos en el presente documento se han utilizado en muchos estudios de Drosophila espermatogénesis (por ejemplo, para evaluar las funciones de la dineína, un motor de microtúbulos menos de extremo-dirigido, durante la espermatogénesis de Drosophila).

Además de los protocolos básicos, se proporcionan sugerencias para varying la disección con el fin de enriquecer las espermatogonias, espermatocitos, o espermatozoide maduro. Diferentes métodos para el procesamiento de los testículos de tal manera que los quistes o bien permanecen intactas o se interrumpen, se describen, según sea necesario. Una ventaja en el uso de testículos de Drosophila como sistema modelo es que, en comparación con los ovocitos y embriones de Drosophila, anticuerpos y colorantes pueden penetrar fácilmente en las células después de su dispersión de los testículos, y se requieren menos etapas de lavado, por lo tanto, los protocolos se pueden realizar en un tiempo relativamente tiempo corto.

Protocolo

1. Testículos Disección

1. Anestesie moscas en una botella o frasco con una corriente de CO ₂ y la transferencia a una almohadilla de mosca.
2. Ordenar moscas bajo un microscopio de disección usando un pequeño pincel, y recoger un número apropiado (dependiendo del experimento) de los machos de Drosophila de los genotipos deseados. Los hombres jóvenes (0-2 días de edad) son ideales para el examen de las células a través de las primeras etapas de la espermatogénesis (por ejemplo espermatogonias, espermatocitos y espermátidas tempranas post-meióticas), mientras que los machos ligeramente mayores (2-5 días de edad) son ideales para el examen de las células en las últimas etapas de la espermatogénesis (en particular, maduran los espermatozoides).
3. Use unas pinzas para quitar las alas de cada vuelo (para evitar que las moscas que flotan en el líquido durante la disección).
4. Añadir ~ 500 ml de solución salina tamponada con fosfato (NaCl 130 mM, 7 mM Na ₂ HPO _4, 3 mM NaH ₂ PO _4, PBS) en una gota a una disección plato cubierto con silicona porun fondo negro. Otras soluciones acuosas se han utilizado con éxito para la disección testículos ^3.
5. Punto fórceps hacia la parte anterior de la mosca, agarrarlo por el tórax, y sumergirlo en la gota de PBS. Mientras observa a través del microscopio de disección, utilice otro par de pinzas para agarrar y tirar de los genitales externos (estructura de color marrón oscuro situado en el extremo posterior del abdomen ventral) posteriormente hasta que se separe del abdomen. En la mayoría de los casos, los testículos, las vesículas seminales y las glándulas accesorias serán removidos del abdomen, junto con los órganos genitales externos, si fuera necesario, introduzca un solo par de pinzas en el abdomen y se burlan de los testículos.
6. Separe los testículos y las glándulas accesorias genitales externos utilizando dos pares de pinzas en la caída de PBS (Figura 2). Testículos de tipo salvaje se distinguen fácilmente de los tejidos blancos vecinos por su color amarillo. Proceda inmediatamente al paso 2.
7. Para aislar los testículos de los machos pharate (i.. E incluido dentro de la caja de pupa), un paso adicional primero se debe realizar que implica la eliminación de la marcha de la caja de pupa; este paso ha sido descrito previamente en otro lugar ^31. Proceda con la disección como para los testículos adultos a partir del paso 1.2.
8. Para aislar los testículos de los machos de larvas, lleve a cabo una modificación de un protocolo para el aislamiento de ovarios de larvas de Drosophila ^32. Brevemente, las larvas macho se puede distinguir de larvas hembra por la presencia de un par de estructuras grandes, claras ovales (testículos de larvas) incrustados en el tercio posterior de la grasa corporal. Para aislar los testículos de larvas, desollar parcialmente abierta la larva macho para aislar los testículos y el cuerpo de grasa que rodea el abdomen como se describe para el aislamiento de ovarios de larvas. Proceder inmediatamente al paso 2 del protocolo descrito en el presente documento; los testículos más tarde pueden ser eliminados del cuerpo grasa justo antes de montar (pasos 2.3 o 3.14) como se describió para los ovarios ^32.

2. Preparación de la muestra y de imágenes en vivo

1. Use un par de pinzas para colocar suavemente 2-3 pares de testículos en una gota de 4-5 ml de PBS en una cubierta de vidrio cuadrado deslizamiento. Tenga en cuenta que puede necesitar la relación del número testículos al volumen de PBS para ajustar: el exceso de líquido evitar que las células se propaguen correctamente cuando aplastado, mientras que demasiado poco líquido hará que las células revienten cuando aplastada. Opcional: Uso cubierta siliconada desliza para minimizar la adherencia de tejido para cubrir deslizamiento en el paso 3.2.
2. Use un par de pinzas para rasgar cada testículo en una posición apropiada para maximizar la presencia de los tipos de células de la línea germinal deseadas en la preparación (tenga en cuenta que los contenidos de los testículos en su mayoría será la salida de la región desgarrada sobre el portaobjetos durante el aplastamiento paso.) Para enriquecer espermatogonias y espermatocitos, rasgar el testículo adyacente a su extremo apical (nivel 1, la Figura 2B). Para enriquecer espermatocitos y espermátidas, desgarro abrir los testículos a un position ligeramente basal al nivel 1 (nivel 2, la Figura 2B). Para enriquecer las células germinales más maduras, rasgar los testículos más cerca de donde comienza la curvatura (nivel 3, Figura 2B).
3. Con suavidad, coloque un portaobjetos de vidrio sobre la hoja de la cubierta para aplastar los testículos; no presione manualmente como el peso de la hoja de la cubierta es suficiente para obtener una muestra adecuada aplastada. Trate de evitar que queden atrapadas burbujas de aire. Opcional: Uso revestido de poli-L-lisina portaobjetos para promover la adhesión de tejido se deslice en el paso 3.2.
4. Utilice la preparación inmediata (idealmente dentro de 15 minutos de preparación) para observar células vivas por microscopía de contraste de fase, porque las moscas transgénicas con expresión de las proteínas marcadas con fluorescencia en los testículos, las células vivas pueden ser examinadas por microscopía de fluorescencia en este paso. Por otra parte, proceder a la fijación y la tinción de anticuerpos (Protocolo n º 3).
5. Absorber suavemente el exceso de líquido bajo el cubreobjetos usando una limpieza wipe para permitir que el aplanamiento de la preparación hasta que las células germinales son claramente enfocado.

3. Formaldehído La fijación y la tinción de anticuerpos

1. Snap congelar cada diapositiva que contiene los testículos aplastados (del Protocolo 2) usando un par de pinzas de metal para sumergirlo brevemente en nitrógeno líquido (nitrógeno líquido hasta que se detiene el burbujeo).
2. Retire la hoja de la cubierta inmediatamente usando una cuchilla de afeitar.
3. Utilice pinzas de metal para transferir diapositivas en una parrilla corrediza de vidrio preenfriado lleno de etanol al 95% enfriado con hielo (grado espectrofotométrico, exento de metanol). Almacenar a -20 ° C durante 10 min.
4. Utilice pinzas de metal para transferir diapositivas a un estante de portaobjetos de vidrio lleno con 4% de formaldehído en PBS más 0,1% de Triton X-100 (PBS-T). Guarde a temperatura ambiente durante 7 min.
5. Utilice pinzas de metal para transferir diapositivas en una parrilla corrediza de vidrio lleno de PBS. Lavar los portaobjetos en PBS durante 5 min a temperatura ambiente. Repita 1x. Realice todos los lavados descartando la solución en la parrilla corrediza de vidrio ( Ie. vertiendo hacia fuera) y la sustitución con solución fresca.
6. Desechar el PBS y sumergir los portaobjetos en PBS-T durante 30 min a temperatura ambiente para permeabilizar las membranas celulares.
7. Lavar los portaobjetos en PBS durante 5 min a temperatura ambiente. Repita 2x.
8. El bloqueo de paso (opcional): Sumergir los portaobjetos en PBS más 1% de BSA durante 45 min a temperatura ambiente.
9. Use una barrera hidrofóbica lápiz para dibujar un círculo en la diapositiva alrededor del tejido aplastado (fácilmente visible a simple vista) con el fin de limitar las soluciones de anticuerpos (agregado en los pasos 3,9 y 3,11). El tejido debe mantenerse húmedo en todo momento durante la realización de la inmunotinción.
10. Añadir 30-40 ml de anticuerpo primario (diluido en PBS-T, 1:400 a 1:50, dependiendo de anticuerpo) en el tejido dentro del círculo. Si se ha realizado el bloqueo, diluir anticuerpo primario en PBS-T más 1% de BSA. El anticuerpo anti-gamma-tubulina (para la tinción de los centrosomas en la Figura 4) se diluyó 1:100. Incubar en una cámara oscura húmeda (por ejemplo. Caja de plástico cerradacon toallas húmedas de papel) durante 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
11. Lavar los portaobjetos con PBS durante 5 min a temperatura de habitación 3x. Si se realizó el bloqueo, lavar dos veces en PBS-T y una vez en PBS (5 min a temperatura ambiente, cada una).
12. Añadir 30-40 ml de anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo (diluido 1:400 en PBS) a los tejidos y se incuba en la oscuridad durante 1-2 horas a temperatura ambiente.
13. Lavar los portaobjetos en PBS durante 5 min a temperatura ambiente. Repita 2x.
14. Añadir 30-40 ml de solución de DAPI (0,2 mg / ml en PBS) para el tejido dentro del círculo.
15. Con suavidad, coloque una hoja de cubierta de vidrio sobre el tejido, teniendo cuidado de evitar que queden atrapadas burbujas de aire. Si deben aparecer burbujas de aire, mueva con cuidado alrededor de la hoja de la cubierta sin destruir la calabaza hasta que las burbujas se escapan de los lados de la hoja de la cubierta.
16. Utilice una toallita de limpieza para borrar el exceso de DAPI de los bordes de la diapositiva.
17. Sellar el cubreobjetos a la diapositiva utilizando el esmalte de uñas transparente.
18. Utilice esta preparacióndentro de los próximos 3 a 4 horas para ver las células immunostained por microscopía fluorescente. Para el almacenamiento a largo plazo de las diapositivas (hasta por lo menos varias semanas), utilice un medio difícil montar a base de glicerol con DAPI, y almacenar a -20 ˚ diapositivas C.
19. Alternativamente, fijar muestras en metanol en lugar de formaldehído (dependiendo del antígeno). Después de completar todo el protocolo hasta el paso 3.2, sumerja las diapositivas de los testículos aplastados en metanol durante 10 minutos a -20 º C y continúe con el paso 3.5 en adelante.

Resultados

Un ejemplo de un par adecuadamente diseccionado de los órganos reproductores masculinos de Drosophila se muestra en la Figura 2A. Testículos retirados desde el abdomen de la mosca macho adulto están típicamente unidos al conducto eyaculador (marrón, Figura 2A ') y un par de glándulas accesorias (verde, Figura 2A') a través de un par de vesículas seminales (azul, Figura 2A ') . Para separar los testículos de la mayor parte d...

Discusión

Aunque los testículos de los de tipo salvaje moscas pueden ser fácilmente identificados por su color amarillo (a diferencia de los tejidos blancos vecinos), los testículos de las moscas mutantes blancos son de color blanco y por lo tanto a veces se puede confundir con el intestino. Mayoría de las cepas transgénicas, que son típicamente en un fondo blanco, también tienen testículos blancos porque el gen de mini-blanco que se encuentra en P-elementos no promueve la acumulación ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard	World Precision Instruments	SYLG184	Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish
PAP pen	Fisher Scientific	NC9888126	Ted Pella #22309
Clear nail protector	Wet n Wild	7780235001
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI	Life Technologies	P36931
Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88)	Sigma-Aldrich	T6557
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-165-003
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100
Ethanol	Fisher Scientific	AC61511-0040
Methanol	Fisher Scientific	A412-4
16% Formaldehyde	Thermo Fisher Scientific	28908
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2	Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips
DAPI	Sigma-Aldrich	D-9542	0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20 °C
NaCl	Research Products International Corp.	S23020
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S9763
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S0751
Kimwipes delicate task wipers	Fisher Scientific	S47299
BSA	Research Products International Corp.	A30075	Molecular biology grade
Glass Coplin staining jar, screw cap	Electron Microscopy Sciences	70315
Single frosted microscope slides	Corning	2948-75X25
Poly-L-lysine coated microscope slides	Polysciences, Inc.	22247-1	Optional (to replace untreated microscope slides )
Square cover glass	Corning	2865-22
Razor blades	Fisher Scientific	12-640
Kimax Petri dish	Fisher Scientific	S31473	Kimble #23060 10015 EMD
Forceps	Dumont	52100-51S	Pattern 5 INOX
Stemi 2000-CS stereoscope	Carl Zeiss
Eclipse 80i	Nikon
Plan-Fluor 40X objective	Nikon
Axiophot	Carl Zeiss
Plan-Neofluar Ph2 40X objective	Carl Zeiss