Die zytologische Analyse der Spermatogenese: Live-und Fest Zubereitungen aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Hoden

Zusammenfassung

Verfahren zur Isolierung und Herstellung von Drosophila Hoden Proben (leben und fest) für die Bildgebung durch Phasenkontrast-und Fluoreszenzmikroskopie sind hierin beschrieben.

Zusammenfassung

Drosophila melanogaster ist ein leistungsfähiges Modellsystem, das in großem Umfang verwendet wurde, um eine Vielzahl von biologischen Prozessen aufzuklären. Beispielsweise haben Studien sowohl der männlichen und weiblichen Keimlinien Drosophila zur derzeitigen Verständnis der Meiose und Stammzellenbiologie beigetragen. Ausgezeichnete Protokolle sind in der Literatur für die Isolierung und Darstellung von Drosophila Ovarien und Hoden ^3-12 erhältlich. Hierin sind Verfahren für die Präparation und Herstellung von Drosophila Hoden für die mikroskopische Analyse mit einem zugehörigen Video-Demonstration beschrieben. Ein Protokoll für die Isolierung Hoden aus dem Bauch von erwachsenen Männern und Herstellung von Folien lebendes Gewebe zur Analyse durch Phasenkontrastmikroskopie als auch ein Protokoll für die Befestigung und die Immunfärbung Hoden für die Analyse durch Fluoreszenzmikroskopie dargestellt. Diese Techniken können bei der Charakterisierung von Drosophila-Mutanten, d aufweisen angewendetefects der Spermatogenese sowie der Visualisierung der subzellulären Lokalisation von Proteinen.

Einleitung

Drosophila Hoden sind eine ideale Modellsystem für die Untersuchung von vielen biologischen Prozessen, einschließlich der Regulation von Stammzellen, Meiose und Samenentwicklung ^13-18. Die Spermatozyten und ihre Reife Spindeln sind groß und damit praktisch für die zytologische Analyse und entspannt Zellzyklus-Kontrollpunkte während der Spermatogenese erleichtern die Untersuchung von Mutationen in Zellzyklus-Genen. Verschiedene Zelltypen können in geordneten Ablauf entlang der Länge der Hoden beobachtet werden, und jede Störung der Spermatogenese zu Änderungen in dieser Gesamtanordnung führen. Diese Eigenschaften kombiniert mit Drosophila genetische Werkzeuge haben die Mutationsanalyse der Spermatogenese ^21-23 erleichtert.

Die Stadien der Drosophila Spermatogenese haben gut definiert. Keimbahnzellen, die synchron in Zysten Fortschritte sequentiell durch die Stadien der Spermatogenese entlang der Länge des Hodens. Während boten der mitotischen und meiotischen Teilungen der männlichen Keimzellen, tritt Zytokinese unvollständig, so dass die Tochterzellen bleiben zytoplasmatische Brücken Ringkanäle bekannt sind (Abbildung 1). Die apikale Spitze des Hodens enthält eine Bevölkerung von Keimbahn-Stammzellen, die Anlass zu den Spermatogonien, die vier mitotische Teilungen mit unvollständiger Zytokinese unterziehen, um 16-Zellen-Zysten primären Spermatozyten generieren. Nach premeiotic S-Phase, primären Spermatozyten geben G2, eine längere Wachstumsperiode von ~ 90 Stunden, während der zellulären Volumensteigerungen ~ 25-fache. Progression durch Meiose I und Meiose II führt zur Bildung von 32-Zell-Zysten sekundären Spermatozyten und 64-Zellen-Zysten von haploiden Spermatiden sind. Die unreifen, runden Spermatiden in umfangreichen zellulären Umbau zu reifen Spermien bilden. Post-meiotischen Zellen, insbesondere die Bündel der Verlängerung und reife Spermatiden, besetzen viel von dem Volumen der Hoden.

Ter erfolgreich den Transport von Funktions Spermien weibliche Fliegen erfordert die Koordination zwischen den verschiedenen Teilen des männlichen Fortpflanzungssystem, das aus mehreren gekoppelten Strukturen (die Hoden, Samenblasen und akzessorischen Drüsen) und einem Einzel Ejakulationsleitung zusammengesetzt ist (Abbildung 2). Spermien werden in den Hoden produziert und innerhalb der Samenbläschen, bis Kopulation ²⁴ gespeichert. Die Zubehör sekretorischen Drüsen enthalten Zellen, die Samenflüssigkeit zu produzieren. Die Spermien Migration aus den Samenbläschen mit Samenflüssigkeit innerhalb des Ejakulationsleitung, die sowohl für die Samenbläschen und die Anhangsdrüsen verbunden ist gemischt. Diese Mischung von Spermien und Samenflüssigkeit wird schließlich aus dem männlichen in die Vagina der weiblichen Fliegen durch die Ejakulation Lampe am hinteren Ende des männlichen Bauch ²⁵ angeordnet gepumpt. Proteine ​​in der Samenflüssigkeit sind für eine längere Lagerung von Spermien in spezialisierten Organen wie Spermatheken in der rep bekanntroductive Trakt von Drosophila-Weibchen ^26.

Ausgezeichnete Methoden zur Isolierung von Drosophila Hoden und Visualisierung von Zellen in verschiedenen Stadien der Spermatogenese sind in der wissenschaftlichen Literatur ^3-12 erhältlich. Wir hier in diesem Körper von Wissen hinzufügen, indem Beispiele für diese Protokolle mit einem begleitenden Video-Demonstration. Das Protokoll für die Herstellung von Lebendproben Hoden zur Phasenkontrastmikroskopie auf einem zuvor beschriebenen Verfahren auf der Basis ^27. Das Protokoll für die Formaldehyd-Fixierung und Immunfärbung von Hoden wird auch auf einem zuvor beschriebenen Verfahren auf der Basis ^28. Die hier beschriebenen Ansätze wurden in vielen Studien von Drosophila Spermatogenese verwendet (zum Beispiel die Rollen von Dynein beurteilen, ein Minus-Ende gerichtet Mikrotubuli Motor während der Drosophila Spermatogenese).

Zusätzlich zu den grundlegenden Protokolle werden Vorschläge für varyin bereitgestelltg der Dissektion, um für Spermatogonien, Spermatozyten, oder reifen Spermien zu bereichern. Verschiedene Verfahren zum Verarbeiten der Hoden, so daß Zysten entweder erhalten bleiben oder zerstört werden, wie nötig sind, beschrieben. Ein Vorteil bei der Verwendung Hoden Drosophila als Modellsystem ist, dass, im Vergleich zu Drosophila Eizellen und Embryonen, Antikörper und Farbstoffe können leicht eindringen Zellen nach ihrer Streuung aus den Hoden und weniger Waschschritte erforderlich sind, so können Protokolle in einer relativ durchgeführt werden kurze Zeit.

Protokoll

1. Hoden Dissection

1. Anesthetize Fliegen in einer Flasche oder einem Fläschchen mit einem Strom von CO ₂ und übertragen, um eine Fliege Pad.
2. Sortieren fliegt unter einem Binokular mit einem kleinen Pinsel, und sammeln eine entsprechende Anzahl (je nach Experiment) von Drosophila Männchen der gewünschten Genotypen. Junge Männer (0-2 Tage alt) sind ideal für die Prüfung Zellen in den früheren Stadien der Spermatogenese (zB Spermatogonien, Spermatozyten und frühen postmeiotischen Spermatiden), während etwas ältere Männer (2-5 Tage alt) sind ideal für die Prüfung der Zellen in den letzten Stadien der Spermatogenese (insbesondere reifen Spermien).
3. Verwenden einer Pinzette, um die Flügel aus jeder fliegen zu entfernen (um die Fliegen aus variabel in Flüssigkeit während der Präparation zu verhindern).
4. Hinzufügen ~ 500 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (130 mM NaCl, 7 mM Na ₂ HPO _4, 3 mM NaH ₂ PO _4, PBS) in einem Tropfen auf eine silikonbeschichtete Dissektion Schale aufein schwarzer Hintergrund. Andere wässrige Lösungen wurden erfolgreich Hoden Präparation ³ verwendet.
5. Punkt in Richtung der vorderen Zange der Fliege, fassen Sie es durch den Brustkorb, und tauchen es in der PBS-Tropfen. Während Sie durch das Binokular, verwenden Sie eine andere Pinzette zu greifen und ziehen Sie den äußeren Genitalien (dunkelbraun Struktur am hinteren Ende des ventralen Bauch gelegen) hinten, bis es aus dem Bauch löst. In den meisten Fällen werden die Hoden, Samenblasen und Zubehör-Drüse aus dem Bauch zusammen mit der äußeren Genitalien entfernt werden, wenn nicht, kann eine einzelne Pinzette in den Bauch und necken sich die Hoden.
6. Separate Hoden aus dem Zubehördrüse und äußeren Genitalien mit zwei Pinzetten in der PBS-Tropfen (Abbildung 2). Wildtyp-Hoden werden leicht von benachbarten weißen Gewebe durch ihre gelbe Farbe aus. Gehen Sie sofort zu Schritt 2 über.
7. Um Hoden von Männern pharate (i isolieren.. E innerhalb der Puppenhülle eingeschlossen), ist ein weiterer Schritt zuerst durchgeführt, die das Entfernen der Fliege aus der Puppenhülle umfasst werden, dieser Schritt wurde bereits an anderer Stelle ³¹ beschrieben. Fahren Sie mit der Präparation wie bei den Erwachsenen Hoden ab Schritt 1.2.
8. Um Hoden von männlichen Larven zu isolieren, führen Sie eine Modifikation eines Protokolls zur Isolierung von Drosophila-Larven ³² Eierstöcke. Kurz gesagt, können männliche Larven von weiblichen Larven durch die Anwesenheit von einem Paar große, klare, ovale Strukturen (Larven Hoden) im hinteren Drittel der Fettkörper eingebettet unterschieden werden. Um Larven Hoden isolieren, teilweise die Haut abziehen öffnen die männliche Larve, die Hoden und die umgebende Fettkörper aus dem Bauch zu isolieren, wie für die Isolierung der Larven Eierstöcke beschrieben. Gehen Sie sofort zu Schritt 2 von dem hier beschriebenen Protokoll, die Hoden können später von der fetten Körper nur vor der Montage (Schritte 2.3 oder 3.14) als für den Eierstöcken ³² beschrieben, entfernt werden.

2. Probenvorbereitung und Live-Imaging

1. Verwenden Sie eine Pinzette vorsichtig platzieren 2-3 Paar Hoden in einem Tropfen 5.4 ml PBS auf einem quadratischen Deckglas. Beachten Sie, dass das Verhältnis der Hoden Nummer PBS Lautstärke kann angepasst werden müssen: zu viel Flüssigkeit aus Zellen richtig Ausbreitung zu verhindern, wenn gequetscht, während zu wenig Flüssigkeit führt zu Zellen platzen, wenn gequetscht. Optional: Verwenden silikonisierte Deckgläser, um die Einhaltung von Gewebe zu minimieren, um den Schlupf in Schritt 3.2 zu decken.
2. Verwenden Sie eine Zange, um jeden Hoden offen an einer geeigneten Stelle zu reißen, um das Vorhandensein der gewünschten Keimbahn-Zelltypen in der Vorbereitung zu maximieren (beachten Sie, dass der Inhalt des Hodens wird meist Austritt aus dem zerrissenen Region auf den Objektträger während der Quetschung Schritt aus.) Um Spermatogonien und Spermatozyten zu bereichern, aufreißen die Hoden neben seinem apikalen Spitze (Ebene 1, 2B). Um Spermatozyten und Spermatiden bereichern, Tränen öffnen Sie die Hoden bei einer posITION leicht basalen auf Stufe 1 (Ebene 2, 2B). Um reifer Keimbahnzellen zu bereichern, reißen die Hoden näher an offen, wo die Krümmung beginnt (Stufe 3, Abbildung 2B).
3. Sanft statt einen Glasobjektträger über das Deckglas, um die Hoden quetschen, nicht Druck manuell anwenden, wie das Gewicht des Deckglases allein ist ausreichend, um eine richtig gequetscht Probe zu erhalten. Versuchen Sie zu vermeiden Luftblasen. Optional: Verwenden Poly-L-Lysin beschichteten Objektträger, um die Einhaltung des Gewebes zu fördern, um in Schritt 3.2 gleiten.
4. Verwenden Vorbereitung sofort (idealerweise innerhalb von 15 Minuten der Vorbereitung), um lebende Zellen durch Phasenkontrastmikroskopie beobachten, für transgenen Fliegen mit der Expression von fluoreszenzmarkierten Proteine ​​in den Hoden, können lebende Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie in diesem Schritt untersucht werden. Alternativ fahren Sie mit der Fixierung und Antikörperfärbung (Protokoll 3).
5. Docht vorsichtig überschüssige Flüssigkeit unter dem Deckglas mit einer Reinigungs wipe zu Abflachung der Vorbereitung zu ermöglichen, bis die Keimzellen sind deutlich im Fokus.

3. Formaldehyd-Fixierung und Antikörperfärbung

1. Schnellfrost jede Folie mit Hoden gequetscht (von Protokoll Nr. 2) mit einem Paar Metallzange, um es kurz in flüssigen Stickstoff tauchen (bis flüssigem Stickstoff stoppt Blasenbildung).
2. Entfernen Sie das Deckglas sofort mit einer Rasierklinge.
3. Verwenden Metallzange, um Folien in eine vorgekühlte Glasobjektträger mit eiskaltem 95% Ethanol gefüllt (spektrophotometrische grade, Methanol-frei) zu übertragen. Lagerung bei -20 ° C für 10 min.
4. Verwenden Metallzangen Dias auf einen Objektträger-Rack mit 4% Formaldehyd in PBS plus 0,1% Triton X-100 (PBS-T) gefüllt übertragen. Lagern bei Raumtemperatur für 7 min.
5. Verwenden Metallzangen Dias auf einen Objektträger mit PBS gefüllten Rack übertragen. Waschen Folien in PBS für 5 min bei Raumtemperatur. Wiederholen 1x. Führen Sie alle Waschungen durch Verwerfen Lösung in der Glasobjektträgergestell ( Dh. durch Gießen out) und Ersetzen durch frische Lösung.
6. Verwerfen die PBS und tauchen Folien in PBS-T für 30 min bei Raumtemperatur, Zellmembranen durchlässig zu machen.
7. Waschen Folien in PBS für 5 min bei Raumtemperatur. 2x wiederholen.
8. Blockierungsschritt (optional): Tauchen Folien in PBS plus 1% BSA für 45 min bei Raumtemperatur.
9. Verwenden Sie eine hydrophobe Barriere Stift einen Kreis auf der Folie herum gequetscht Gewebe (mit dem Auge gut sichtbar), um die Antikörperlösungen (in Schritten 3.9 und 3.11 hinzugefügt) beschränken zu ziehen. Das Gewebe sollte feucht zu allen Zeiten während der Durchführung Immunfärbung gehalten werden.
10. Hinzufügen 30-40 ml primärem Antikörper (in PBS-T, 1:400 bis 1:50 verdünnt, je Antikörper), um Gewebe innerhalb des Kreises. Wenn Sperrung durchgeführt wurde, verdünnte primäre Antikörper in PBS-T plus 1% BSA. Anti-Gamma-Tubulin-Antikörper (für die Färbung von Zentrosomen in Fig. 4) wurde 1:100 verdünnt. Inkubation in einer feuchten, dunklen Kammer (z. B. geschlossene Kunststoff-Box.mit feuchten Papiertüchern) für 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C.
11. Waschen Folien in PBS für 5 min bei Raumtemperatur 3x. Wenn Sperrung durchgeführt wurde, zweimal waschen in PBS-T und einmal in PBS (5 min bei Raumtemperatur jeweils).
12. Hinzufügen 30-40 ml Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper (verdünnt 1:400 in PBS) auf das Gewebe und Inkubieren im Dunkeln für 1-2 h bei Raumtemperatur.
13. Waschen Folien in PBS für 5 min bei Raumtemperatur. 2x wiederholen.
14. Hinzufügen 30-40 ml DAPI-Lösung (0,2 mg / ml in PBS) zu dem Gewebe innerhalb des Kreises.
15. Sanft statt ein Deckglas über das Gewebe, kümmert sich um Luftblasen zu vermeiden. Wenn Luftblasen erscheinen soll, sorgfältig um das Deckglas zu bewegen, ohne die Squash bis die Blasen von den Seiten des Deckglases zu entkommen.
16. Verwenden Sie ein Reinigungstuch, um überschüssige DAPI von den Rändern der Folie tupfen.
17. Dichten Sie das Deckglas auf den Objektträger mit klarem Nagellack.
18. Mit dieser Vorbereitunginnerhalb der nächsten 3-4 h auf immungefärbten Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie zu sehen. Für längerfristige Speicherung von Dias (bis mindestens mehrere Wochen), verwenden Sie eine Glycerin-basierte Festmontage Medien mit DAPI und speichern Objektträger bei -20 ˚ C
19. Alternativ fixieren Proben in Methanol anstelle von Formaldehyd (je nach Antigen). Nach Abschluss der gesamten Protokoll über den Schritt 3.2, tauchen Dias von gequetschten Hoden in Methanol für 10 min bei -20 ° C und fahren Sie mit Schritt 3.5 weiter.

Ergebnisse

Ein Beispiel eines gut präpariert Paar von Drosophila männlichen Geschlechtsorgane ist in 2A gezeigt. Hoden aus dem Abdomen der erwachsenen männlichen Fliege entfernt werden typischerweise zum Ejakulationsleitung (braun, 2A ') und einem Paar Anhangsdrüsen (grün, 2A') über ein Paar von Samenblasen (blau, 2A ') befestigt . Die Hoden von den meisten zugehörigen somatischen Gewebe, das Ejakulationsleitung und die Anhangsdrüsen t...

Diskussion

Obwohl die Hoden von Wildtyp-Fliegen können ohne weiteres durch ihre gelbe Farbe (im Gegensatz die benachbarten weißen Gewebe) identifiziert werden kann, sind die Hoden von weißen mutierten Fliegen weiß und kann daher gelegentlich mit dem Darm zu verwechseln. Die meisten transgenen Linien, die typischerweise in einem weißen Hintergrund, haben auch weiße Hoden, weil die Mini-white-Gen in P-Elementen funktioniert Pigmentakkumulation in den Hoden nicht fördern. Bei Drosophila<...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard	World Precision Instruments	SYLG184	Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish
PAP pen	Fisher Scientific	NC9888126	Ted Pella #22309
Clear nail protector	Wet n Wild	7780235001
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI	Life Technologies	P36931
Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88)	Sigma-Aldrich	T6557
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-165-003
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100
Ethanol	Fisher Scientific	AC61511-0040
Methanol	Fisher Scientific	A412-4
16% Formaldehyde	Thermo Fisher Scientific	28908
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2	Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips
DAPI	Sigma-Aldrich	D-9542	0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20°C
NaCl	Research Products International Corp.	S23020
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S9763
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S0751
Kimwipes delicate task wipers	Fisher Scientific	S47299
BSA	Research Products International Corp.	A30075	Molecular biology grade
Glass Coplin staining jar, screw cap	Electron Microscopy Sciences	70315
Single frosted microscope slides	Corning	2948-75X25
Poly-L-lysine coated microscope slides	Polysciences, Inc.	22247-1	Optional (to replace untreated microscope slides )
Square cover glass	Corning	2865-22
Razor blades	Fisher Scientific	12-640
Kimax Petri dish	Fisher Scientific	S31473	Kimble #23060 10015 EMD
Forceps	Dumont	52100-51S	Pattern 5 INOX
Name of Equipment	Company
Stemi 2000-CS stereoscope	Carl Zeiss
Eclipse 80i	Nikon
Plan-Fluor 40x objective	Nikon
Axiophot	Carl Zeiss
Plan-Neofluar Ph2 40x objective	Carl Zeiss