Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
Izole edilmesi ve faz kontrast ve floresan mikroskobu ile görüntüleme için Drosophila testis örnekleri (canlı ve sabit) hazırlanması için yöntemler burada tarif edilmiştir.
Drosophila melanogaster yaygın olarak biyolojik süreçlerin çeşitli aydınlatmak için kullanılmış olan güçlü bir model sistem. Örneğin, kadın ve Drosophila erkek germ hatlarının hem de çalışmaları mevcut mayoz anlayış yanı sıra kök hücre biyolojisi büyük ölçüde katkıda bulunmuştur. Mükemmel protokolleri Drosophila yumurtalık ve testis 3-12 izolasyonu ve görüntüleme için literatürde mevcuttur. Burada, mikroskobik analiz için diseksiyon ve Drosophila testis hazırlanması için yöntemler, eşlik eden bir video gösterimi ile tarif edilmiştir. Yetişkin erkeklerin karından testisler izole edilmesi ve faz kontrast mikroskopisi ile analiz hem de floresan mikroskobu ile analiz için sabitleme testisler ve immünboyama için bir protokol için canlı doku slaytlar hazırlanması için bir protokol sunulmaktadır. Bu teknikler, d gösteren Drosophila mutantlar karakterizasyonunda uygulanabilirspermatogenezde yanı sıra, proteinlerin hücre içi yerleşimlerin görselleştirme efects.
Drosophila testis kök hücrelerin düzenlenmesi, mayoz, ve sperm gelişimi 13-18 dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçlerin çalışma için ideal bir model sistem. Spermatosit ve öz değişmesine ait iğ büyük ve sitolojik analiz için bu nedenle uygun olan ve spermatogenez sırasında rahat bir hücre döngüsü kontrol noktası hücre döngüsü genlerdeki mutasyonların çalışma kolaylaştırır. Farklı hücre tipleri testislerin uzunluğu boyunca düzenli ilerleme gözlenebilir, spermatogenez ve herhangi bir bozulma bu genel düzenleme değişikliklere yol açabilir. Drosophila genetik araçlar ile birlikte bu özellikler, spermatogenez 21-23 mutasyonel analiz kolaylaştırmıştır.
Drosophila Spermatogenezin evreleri çok iyi tanımlanmıştır. Kistlerinin içinde eşzamanlı geliştirmek Germline hücreleri testis uzunluğu boyunca spermatogenez aşamalarında sırayla ilerleme. Bo sırasındamitoz ve erkek germ hücrelerinin miyoza bölünmeler inci, sitokinez kızı hücreleri (Şekil 1) halka kanallar olarak bilinen sitoplazmik köprülerle bağlı kalmasını eksik böyle oluşur. Testisin apikal uç birincil spermatositlerin 16-hücre kistler oluşturmak için eksik sitokinez dört mitotik bölünmeleri geçmesi spermatogonial hücreleri doğurur germ kök hücrelerin bir nüfus içerir. Premeiotic S aşamasından sonra, birincil spermatosit G2, ~ 90 saat hangi hücresel hacmi artar ~ 25 kat sırasında uzun bir büyüme dönemine giriyoruz. Mayoz I ve sırasıyla ikincil spermatositlerin ve haploid spermatidlerin 64-hücreli kist, 32-hücreli kist oluşumu mayoz II sonuçları yoluyla ilerleme. Olgunlaşmamış, yuvarlak spermatidlere olgun sperm oluşturmak için kapsamlı hücresel yeniden geçmesi. Post-öz değişmesine ait hücreler, uzatma demetleri ve olgun spermatidler özellikle, testis hacminin çok işgal.
Tdişi sinek fonksiyonel sperm o başarılı taşıma birkaç eşleştirilmiş yapıların (testisler, seminal kesecikler ve aksesuar bezleri) ve tek bir boşalma yolunun oluşan erkek üreme sistemi, (Şekil 2) farklı parçaları arasındaki koordinasyonu gerektirir. Sperm testislerde içinde üretilen ve çiftleşme 24 kadar seminal keseler içinde saklanır. Aksesuar bezleri seminal sıvıyı üreten salgı hücreleri içerir. Seminal veziküllerin göç sperm seminal keseler ve aksesuar bezleri hem de bağlı olduğu ejakülasyon kanal içerisindeki seminal sıvı ile karıştırılır. Sperm ve seminal sıvı Bu karışım sonuçta kadın erkek karın 25 arka ucunda bulunan ejakülasyon ampul sayesinde sinek vajina içine erkek dışarı pompalanır. Seminal sıvı içinde Proteinler rep spermatekada olarak bilinen uzman organların içinde sperm uzun süreli depolama için gerekli olanDrosophila kadın 26 roductive yolu.
Drosophila testislerin izolasyonu ve spermatogenez çeşitli aşamalarında hücreleri görselleştirilmesi için mükemmel yöntemler bilimsel literatürde 3-12 mevcuttur. Biz burada beraberindeki video gösterimi ile bu protokollerin örnekleri sunarak bu bilgi gövdesine ekleyin. Faz-kontrast mikroskopi için canlı testis numunelerin hazırlanması için protokol daha önce tarif edilen yönteme 27 dayanmaktadır. Formaldehit tespit ve testislerde immün için protokol, aynı zamanda, daha önce tarif edilen metodu takip 28 dayanmaktadır. Burada tarif edilen yaklaşımlar, (örneğin, Drosophila spermatogenez sırasında, bir eksi uç yönlendirilmiş mikrotübül motoru dinein rollerini değerlendirmek için) Drosophila spermatogenez birçok çalışmada kullanılmıştır.
Temel protokol ek olarak, öneri varyin verilmektedirg diseksiyon spermatogonia spermatositler, ya da olgun sperm için zenginleştirecek şekilde. Bu kistlerin ki testisler işlenmesi için farklı yöntemler bozulmadan kalması ya da tarif edilmektedir gerektiği gibi bozulur ya. Bir model sistem olarak Drosophila testisler kullanılmasının bir avantajı, Drosophila oositler ve embriyolar ile karşılaştırıldığında, antikorlar ve boyalar kolayca testis kendi dağılımı aşağıdaki hücreleri nüfuz edebilir ve daha az sayıda yıkama adımları gereklidir, yani, bu yüzden, protokoller nispeten gerçekleştirilebilir kısa bir süre.
1.. Testisler Diseksiyon
2. Numune Hazırlama ve Canlı Görüntüleme
3. Formaldehit Fiksasyon ve Antikor Boyama
Drosophila erkek üreme organlarının bir şekilde parçalanmış bir çiftin bir örneği, Şekil 2A'da gösterilmiştir. Yetişkin erkek sineğin karın çıkarıldı Deneyler tipik haliyle seminal veziküllerin bir çift (mavi, Şekil 2A ') ile boşalma kanalına (kahverengi, Şekil 2A') ve yardımcı bezleri bir çift (yeşil, Şekil 2A ') bağlıdırlar . Ekteki somatik doku, ejakülasyon kanal ve aksesuar bezlerinin çoğ...
Vahşi tip sinekler testisler kolayca nedeniyle sarı renk (aksine komşu beyaz dokular) ile tespit edilebilir, ancak beyaz sinek mutant testisler beyazdır ve bu nedenle zaman zaman gut ile karışabilir. P-elemanları bulunan beyaz mini-gen testislerde pigment birikimini teşvik etmez, çünkü beyaz bir arka planda genellikle çoğu transgenik suşları, aynı zamanda beyaz testisler var. Drosophila testisler renk ile ayırt edilemeyen zaman, diğer kolayca tanınabilir ö...
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Yazarlar Lee laboratuarda Karen Hales uzman tavsiyesi ile spermetogenez eğitim için kabul edilen bu yöntemlerin kurulması için Michael Anderson teşekkür etmek istiyorum. H. Oda ve Y. Akiyama-Oda cömertçe γ-tubulin-GFP stok sinek sağladı. Bu çalışma LAL (GM074044) bir NIH R01 hibe tarafından desteklenmiştir.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Sylgard | World Precision Instruments | SYLG184 | Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish |
PAP pen | Fisher Scientific | NC9888126 | Ted Pella #22309 |
Clear nail protector | Wet n Wild | 7780235001 | |
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88) | Sigma-Aldrich | T6557 | |
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-003 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
Ethanol | Fisher Scientific | AC61511-0040 | |
Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
16% Formaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | |
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips |
DAPI | Sigma-Aldrich | D-9542 | 0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20°C |
NaCl | Research Products International Corp. | S23020 | |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9763 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
Kimwipes delicate task wipers | Fisher Scientific | S47299 | |
BSA | Research Products International Corp. | A30075 | Molecular biology grade |
Glass Coplin staining jar, screw cap | Electron Microscopy Sciences | 70315 | |
Single frosted microscope slides | Corning | 2948-75X25 | |
Poly-L-lysine coated microscope slides | Polysciences, Inc. | 22247-1 | Optional (to replace untreated microscope slides ) |
Square cover glass | Corning | 2865-22 | |
Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
Kimax Petri dish | Fisher Scientific | S31473 | Kimble #23060 10015 EMD |
Forceps | Dumont | 52100-51S | Pattern 5 INOX |
Name of Equipment | Company | ||
Stemi 2000-CS stereoscope | Carl Zeiss | ||
Eclipse 80i | Nikon | ||
Plan-Fluor 40x objective | Nikon | ||
Axiophot | Carl Zeiss | ||
Plan-Neofluar Ph2 40x objective | Carl Zeiss |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır