JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Izole edilmesi ve faz kontrast ve floresan mikroskobu ile görüntüleme için Drosophila testis örnekleri (canlı ve sabit) hazırlanması için yöntemler burada tarif edilmiştir.

Özet

Drosophila melanogaster yaygın olarak biyolojik süreçlerin çeşitli aydınlatmak için kullanılmış olan güçlü bir model sistem. Örneğin, kadın ve Drosophila erkek germ hatlarının hem de çalışmaları mevcut mayoz anlayış yanı sıra kök hücre biyolojisi büyük ölçüde katkıda bulunmuştur. Mükemmel protokolleri Drosophila yumurtalık ve testis 3-12 izolasyonu ve görüntüleme için literatürde mevcuttur. Burada, mikroskobik analiz için diseksiyon ve Drosophila testis hazırlanması için yöntemler, eşlik eden bir video gösterimi ile tarif edilmiştir. Yetişkin erkeklerin karından testisler izole edilmesi ve faz kontrast mikroskopisi ile analiz hem de floresan mikroskobu ile analiz için sabitleme testisler ve immünboyama için bir protokol için canlı doku slaytlar hazırlanması için bir protokol sunulmaktadır. Bu teknikler, d gösteren Drosophila mutantlar karakterizasyonunda uygulanabilirspermatogenezde yanı sıra, proteinlerin hücre içi yerleşimlerin görselleştirme efects.

Giriş

Drosophila testis kök hücrelerin düzenlenmesi, mayoz, ve sperm gelişimi 13-18 dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçlerin çalışma için ideal bir model sistem. Spermatosit ve öz değişmesine ait iğ büyük ve sitolojik analiz için bu nedenle uygun olan ve spermatogenez sırasında rahat bir hücre döngüsü kontrol noktası hücre döngüsü genlerdeki mutasyonların çalışma kolaylaştırır. Farklı hücre tipleri testislerin uzunluğu boyunca düzenli ilerleme gözlenebilir, spermatogenez ve herhangi bir bozulma bu genel düzenleme değişikliklere yol açabilir. Drosophila genetik araçlar ile birlikte bu özellikler, spermatogenez 21-23 mutasyonel analiz kolaylaştırmıştır.

Drosophila Spermatogenezin evreleri çok iyi tanımlanmıştır. Kistlerinin içinde eşzamanlı geliştirmek Germline hücreleri testis uzunluğu boyunca spermatogenez aşamalarında sırayla ilerleme. Bo sırasındamitoz ve erkek germ hücrelerinin miyoza bölünmeler inci, sitokinez kızı hücreleri (Şekil 1) halka kanallar olarak bilinen sitoplazmik köprülerle bağlı kalmasını eksik böyle oluşur. Testisin apikal uç birincil spermatositlerin 16-hücre kistler oluşturmak için eksik sitokinez dört mitotik bölünmeleri geçmesi spermatogonial hücreleri doğurur germ kök hücrelerin bir nüfus içerir. Premeiotic S aşamasından sonra, birincil spermatosit G2, ~ 90 saat hangi hücresel hacmi artar ~ 25 kat sırasında uzun bir büyüme dönemine giriyoruz. Mayoz I ve sırasıyla ikincil spermatositlerin ve haploid spermatidlerin 64-hücreli kist, 32-hücreli kist oluşumu mayoz II sonuçları yoluyla ilerleme. Olgunlaşmamış, yuvarlak spermatidlere olgun sperm oluşturmak için kapsamlı hücresel yeniden geçmesi. Post-öz değişmesine ait hücreler, uzatma demetleri ve olgun spermatidler özellikle, testis hacminin çok işgal.

Tdişi sinek fonksiyonel sperm o başarılı taşıma birkaç eşleştirilmiş yapıların (testisler, seminal kesecikler ve aksesuar bezleri) ve tek bir boşalma yolunun oluşan erkek üreme sistemi, (Şekil 2) farklı parçaları arasındaki koordinasyonu gerektirir. Sperm testislerde içinde üretilen ve çiftleşme 24 kadar seminal keseler içinde saklanır. Aksesuar bezleri seminal sıvıyı üreten salgı hücreleri içerir. Seminal veziküllerin göç sperm seminal keseler ve aksesuar bezleri hem de bağlı olduğu ejakülasyon kanal içerisindeki seminal sıvı ile karıştırılır. Sperm ve seminal sıvı Bu karışım sonuçta kadın erkek karın 25 arka ucunda bulunan ejakülasyon ampul sayesinde sinek vajina içine erkek dışarı pompalanır. Seminal sıvı içinde Proteinler rep spermatekada olarak bilinen uzman organların içinde sperm uzun süreli depolama için gerekli olanDrosophila kadın 26 roductive yolu.

Drosophila testislerin izolasyonu ve spermatogenez çeşitli aşamalarında hücreleri görselleştirilmesi için mükemmel yöntemler bilimsel literatürde 3-12 mevcuttur. Biz burada beraberindeki video gösterimi ile bu protokollerin örnekleri sunarak bu bilgi gövdesine ekleyin. Faz-kontrast mikroskopi için canlı testis numunelerin hazırlanması için protokol daha önce tarif edilen yönteme 27 dayanmaktadır. Formaldehit tespit ve testislerde immün için protokol, aynı zamanda, daha önce tarif edilen metodu takip 28 dayanmaktadır. Burada tarif edilen yaklaşımlar, (örneğin, Drosophila spermatogenez sırasında, bir eksi uç yönlendirilmiş mikrotübül motoru dinein rollerini değerlendirmek için) Drosophila spermatogenez birçok çalışmada kullanılmıştır.

Temel protokol ek olarak, öneri varyin verilmektedirg diseksiyon spermatogonia spermatositler, ya da olgun sperm için zenginleştirecek şekilde. Bu kistlerin ki testisler işlenmesi için farklı yöntemler bozulmadan kalması ya da tarif edilmektedir gerektiği gibi bozulur ya. Bir model sistem olarak Drosophila testisler kullanılmasının bir avantajı, Drosophila oositler ve embriyolar ile karşılaştırıldığında, antikorlar ve boyalar kolayca testis kendi dağılımı aşağıdaki hücreleri nüfuz edebilir ve daha az sayıda yıkama adımları gereklidir, yani, bu yüzden, protokoller nispeten gerçekleştirilebilir kısa bir süre.

Protokol

1.. Testisler Diseksiyon

  1. CO2 akımı kullanılarak bir şişe ya da viyal sinekleri anestezisi ve bir sinek ped transfer.
  2. Sıralama küçük bir fırça kullanarak bir diseksiyon mikroskop altında uçar, ve istenilen genotiplerin Drosophila erkek (deneye bağlı olarak) uygun bir sayı toplamak. (2-5 gün) biraz eski erkek hücrelerin incelenmesi için ideal olan ise (0-2 gün), genç erkekler, spermatogenez önceki aşamalarında (örn. spermatogonium, spermatosit ve erken post-miyoza Spermatidler) boyunca hücrelerin incelenmesi için idealdir spermatogenez son aşamasında (özellikle sperm olgun).
  3. (Diseksiyon sırasında sıvı içinde yüzen sinekler önlemek için) her sinek gelen kanatları çıkarmak için forseps kullanın.
  4. Bir silikon kaplı diseksiyon çanak bir damla olarak, fosfat-tamponlu tuzlu su (PBS 130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3 mM NaH 2 PO 4) arasında ~ 500 ml eklesiyah bir arka plan. Diğer sulu çözeltiler, başarılı bir şekilde testis diseksiyon 3 için kullanılmıştır.
  5. Noktası sineğin öne doğru forseps, toraks bunu kavramak ve PBS açılan batırmayın. Diseksiyon mikroskobu ile görüntüleme iken, karın ayrılana kadar posteriora dış genital (ventral karın arka ucunda bulunan koyu kahverengi yapısı) kavramak ve çekin forseps başka bir çift kullanın. Çoğu durumda, testisler, seminal veziküller ve aksesuar bez dış genital ile karın boyunca kaldırılır olacak; değilse, karın içine forseps bir tek bir çift eklemek ve testisler didiklemek.
  6. PBS damla forseps iki çift (Şekil 2) kullanılarak aksesuar bezi ve dış genital ayırın testisler. Yabani tip testis kolayca sarı renk ile komşu beyaz dokulardan ayırt edilirler. 2. adıma hemen geçin.
  7. Pharate erkeklerden (i Testisler izole etmek.. E pupa durum içinde kapalı), ek bir adım ilk pupa kasasından kaldırılması sinek içermesidir gerçekleştirilmelidir, bu adım, daha önce başka bir yerde 31 tarif edilmiştir. Adım 1.2 başlayan erişkin testis gibi diseksiyon ile devam edin.
  8. Larva erkeklerden testisler ayırmak için, Drosophila larva overler 32 izole etmek için bir protokol bir değişiklik yapmak. Kısaca, erkek larva yağ gövdesinin arka üçte gömülü büyük, berrak, oval yapı (larva testis) bir çift varlığı ile dişi larva ayırt edilebilir. Larva testisler izole edilmesi için, kısmen larva yumurtalıkların izolasyonu için tarif edildiği gibi karından testisler ve çevredeki vücut yağ izole etmek için erkek larva açık parasını. Burada tarif edilen protokolün adım 2'ye geçin hemen, testisler, daha sonra hemen önce yumurtalık 32 için tarif edildiği gibi (2.3 ya da 3.14 adım) montaj için yağ vücuttan çıkarılabilir.

2. Numune Hazırlama ve Canlı Görüntüleme

  1. Nazikçe bir kare cam kapak slip PBS 4-5 ml'lik bir damla testisler 2-3 çiftleri yerleştirmek için bir çift forseps kullanın. Çok az sıvı ne zaman ezilmiş hücrelerinin patlamasına neden olacak ise, çok fazla sıvı ezilmiş düzgün yayılmasını hücrelerini engeller: PBS hacmine testisler sayısına oranının ayarlanması gerekebilir unutmayın. İsteğe bağlı: Kullanım silikonlu kapak adım 3.2 'de kayma kapsayacak doku yapışmasını en aza indirmek için kayıyor.
  2. (Not hazırlanmasında istenen tohum çizgisi hücre tiplerinin varlığını en üst düzeye çıkarmak üzere uygun bir konumda açık her testis gözyaşı forseps bir çift kullanım olup ezilmesini sırasında slayt üzerine testis parçalanmış bölgeden olacak çok çıkış içeriğinin adım.) spermatogonia ve spermatositlerin için zenginleştirmek için, apikal ucu (seviye 1, Şekil 2B) bitişik testis açın gözyaşı. Spermatositlerin ve Spermatidler zenginleştirmek için, gözyaşı bir pos testis açınseviye 1 (düzey 2, Şekil 2B) biraz bazal ition. , Daha olgun germ hücreleri zenginleştirmek yakın eğrilik (düzey 3, Şekil 2B) nerede başladığını açık testis gözyaşı.
  3. Yavaşça testisler squash kapak kayma üzerinde bir cam mikroskop lamı yerleştirmek; yalnız kapak kayma ağırlığı düzgün ezilmiş numune elde etmek için yeterli olduğu gibi elle baskı uygulamayın. Hava kabarcıklarını yakalama önlemek için deneyin. İsteğe bağlı: Kullanım poli-L-lizin kaplı mikroskop aşama 3.2 'de kayma doku uyumu geliştirmek için kayar.
  4. Faz-kontrast mikroskobu ile canlı hücreleri gözlemlemek (ideal hazırlık 15 dakika içinde) hemen hazırlanmasını kullanarak, testislerde floresan etiketli proteinlerin ekspresyonu ile transgenik Sinekler için, canlı hücreler bu aşamada floresan mikroskobu ile incelenebilir. Alternatif olarak, tespit ve antikor boyama (Protokolü 3) ile devam.
  5. Yavaşça bir temizlik w kullanarak coverslip altında herhangi bir aşırı sıvı fitilgerm hücreleri, odak net kadar ipe preparasyonun düzleşme izin vermek.

3. Formaldehit Fiksasyon ve Antikor Boyama

  1. Yapış (sıvı azot köpüren durana kadar) sıvı azot içinde kısaca batırmak için metal maşa kullanılarak (Protokolü 2) ezilmiş testisler içeren her slayt dondurma.
  2. Bir jilet kullanarak hemen kapak kayma çıkarın.
  3. Buz soğukluğundaki% 95 etanol ile dolu önceden soğutulmuş bir cam slayt, raf (spektrofotometrik sınıf, metanol içermeyen) Slaytları aktarmak için metal maşa kullanın. 10 dakika boyunca -20 ° C'de saklayın.
  4. % 4 formaldehid, PBS artı% 0.1 Triton X-100 (PBS-T) ile dolu bir cam slayt raf Slaytları aktarmak için metal maşa kullanın. 7 dakika boyunca oda sıcaklığında saklayın.
  5. PBS ile dolu bir cam slayt rafa slaytlar aktarmak için metal maşa kullanın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde slaytlar yıkayın. 1x tekrarlayın. (Cam slayt rafa çözüm atarak tüm yıkar gerçekleştirin Örneğin. dışarı dökme) ve taze çözelti ile değiştirerek.
  6. PBS atın ve hücre zarının geçirgen hale getirilmesi, oda sıcaklığında 30 dakika için PBS-T içinde slaytlar bırakın.
  7. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde slaytlar yıkayın. 2x tekrarlayın.
  8. Adım (isteğe bağlı) Bloklama: oda sıcaklığında 45 dakika boyunca PBS içinde slaytlar artı% 1 BSA bırakın.
  9. (Adımları 3.9 ve 3.11 'de eklenmiştir) antikor çözümleri sınırlandırmak için (gözle kolayca görülebilir) ezilmiş doku etrafında slayt üzerinde bir daire çizmek için hidrofobik bir bariyer kalem kullanın. Immün yaparken doku her zaman nemli tutulmalıdır.
  10. Daire içinde dokuya (antikora bağlı olarak 1:50 PBS-T içinde seyreltilmiş 1:400) birincil antikor 30-40 ml ilave edilir. Engelleme ile gerçekleştirilen, PBS-T artı% 1 BSA içinde birincil antikor seyreltin. (Şekil 4'te sentrozom boyanması için) Anti-gamma-tubulin antikoru 1:100 seyreltilmiştir. Nemli, karanlık odaya (örn.. Kapalı plastik kutu içinde inkübenemli kağıt, oda sıcaklığında 2 saat boyunca havlu) veya gece boyunca 4 ° C sıcaklıkta ile
  11. Oda sıcaklığında 3 x 5 dakika boyunca PBS içinde slaytlar yıkayın. Engelleme ile gerçekleştirilen, PBS-T içinde iki kez yıkayın ve bir kez PBS (oda sıcaklığında her biri 5 dakika).
  12. Dokuya fluorofor-konjuge sekonder antikor (PBS içinde 1:400 seyreltilmiş) 30-40 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 1-2 saat boyunca karanlıkta inkübe edilir.
  13. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde slaytlar yıkayın. 2x tekrarlayın.
  14. 30-40 daire içinde dokuya DAPI çözeltisi (PBS içinde 0.2 mg / ml) ilave edin.
  15. Yavaşça, hava kabarcığı oluşmaması için dikkat çekici, doku üzerinde bir cam kapak kayma yerleştirin. Hava kabarcıkları görünmesi gerekiyorsa, kabarcıkları kapak kayma tarafına kaçmak kadar kabak bozmadan kapak kayma etrafında dikkatli hareket.
  16. Bir temizlik kullanabilirsiniz slayt kenarları aşırı DAPI leke silin.
  17. Net oje kullanarak slayt kapak kayma mühür.
  18. Bu hazırlık kullanınfloresan mikroskop ile immunosteyn hücreler görüntülemek için sonraki 3-4 saat içinde. (En azından birkaç haftaya kadar) slaytlar uzun süreli saklama için -20 ˚ C'de gliserol tabanlı monte sert DAPI ile medya, ve mağaza slaytlar kullanın
  19. Seçenek olarak ise, (antijen bağlı olarak) metanol yerine formaldehitle örnekleri saptamak. Adım 3.2 ile tüm protokol tamamladıktan sonra, -20 ° C'de 10 dakika boyunca metanol içinde ezilmiş testislerin slaytlar daldırın ve ileriye adım 3.5 ile devam edin.

Sonuçlar

Drosophila erkek üreme organlarının bir şekilde parçalanmış bir çiftin bir örneği, Şekil 2A'da gösterilmiştir. Yetişkin erkek sineğin karın çıkarıldı Deneyler tipik haliyle seminal veziküllerin bir çift (mavi, Şekil 2A ') ile boşalma kanalına (kahverengi, Şekil 2A') ve yardımcı bezleri bir çift (yeşil, Şekil 2A ') bağlıdırlar . Ekteki somatik doku, ejakülasyon kanal ve aksesuar bezlerinin çoğ...

Tartışmalar

Vahşi tip sinekler testisler kolayca nedeniyle sarı renk (aksine komşu beyaz dokular) ile tespit edilebilir, ancak beyaz sinek mutant testisler beyazdır ve bu nedenle zaman zaman gut ile karışabilir. P-elemanları bulunan beyaz mini-gen testislerde pigment birikimini teşvik etmez, çünkü beyaz bir arka planda genellikle çoğu transgenik suşları, aynı zamanda beyaz testisler var. Drosophila testisler renk ile ayırt edilemeyen zaman, diğer kolayca tanınabilir ö...

Açıklamalar

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Teşekkürler

Yazarlar Lee laboratuarda Karen Hales uzman tavsiyesi ile spermetogenez eğitim için kabul edilen bu yöntemlerin kurulması için Michael Anderson teşekkür etmek istiyorum. H. Oda ve Y. Akiyama-Oda cömertçe γ-tubulin-GFP stok sinek sağladı. Bu çalışma LAL (GM074044) bir NIH R01 hibe tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
SylgardWorld Precision InstrumentsSYLG184Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish
PAP penFisher ScientificNC9888126Ted Pella #22309
Clear nail protectorWet n Wild7780235001
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPILife TechnologiesP36931
Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88)Sigma-AldrichT6557
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG Jackson ImmunoResearch115-165-003
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
EthanolFisher ScientificAC61511-0040
MethanolFisher ScientificA412-4
16% FormaldehydeThermo Fisher Scientific28908
SigmacoteSigma-AldrichSL2Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips
DAPISigma-AldrichD-95420.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20 °C
NaClResearch Products International Corp.S23020
Na2HPO4Sigma-AldrichS9763
NaH2PO4Sigma-AldrichS0751
Kimwipes delicate task wipersFisher ScientificS47299
BSAResearch Products International Corp.A30075Molecular biology grade
Glass Coplin staining jar, screw capElectron Microscopy Sciences70315
Single frosted microscope slidesCorning2948-75X25
Poly-L-lysine coated microscope slidesPolysciences, Inc.22247-1Optional (to replace untreated microscope slides )
Square cover glassCorning2865-22
Razor bladesFisher Scientific12-640
Kimax Petri dishFisher ScientificS31473Kimble #23060 10015 EMD
ForcepsDumont52100-51SPattern 5 INOX
Stemi 2000-CS stereoscopeCarl Zeiss
Eclipse 80iNikon
Plan-Fluor 40X objectiveNikon
AxiophotCarl Zeiss
Plan-Neofluar Ph2 40X objectiveCarl Zeiss

Referanslar

  1. McKim, K. S., Joyce, E. F., Jang, J. K. Cytological analysis of meiosis in fixed Drosophila ovaries. Methods Mol. Biol. 558, 197-216 (2009).
  2. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J. Vis. Exp. , (2012).
  3. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. . Drosophila Protocols. , 87-109 (2000).
  4. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Immunostaining of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1273-1275 (2011).
  5. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Methanol-acetone fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1270-1272 (2011).
  6. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Preparation of live testis squashes in Drosophila. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, (2011).
  7. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Formaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, (2012).
  8. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 102-104 (2012).
  9. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. F-actin staining of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 105-106 (2012).
  10. Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis. Anal. Biochem. 436, 55-64 (2013).
  11. Singh, S. R., Hou, S. X. Immunohistological techniques for studying the Drosophila male germline stem cell. Methods Mol. Biol. 450, 45-59 (2008).
  12. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster Testes. J. Vis. Exp. (2641), (2011).
  13. de Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis. Development. 138, 2861-2869 (2011).
  14. Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).
  15. Giansanti, M. G., Sechi, S., Frappaolo, A., Belloni, G., Piergentili, R. Cytokinesis in Drosophila male meiosis. Spermatogenesis. 2, 185-196 (2012).
  16. Matunis, E. L., Stine, R. R., de Cuevas, M. Recent advances in Drosophila male germline stem cell biology. Spermatogenesis. 2, 137-144 (2012).
  17. McKee, B. D., Yan, R., Tsai, J. H. Meiosis in male Drosophila. Spermatogenesis. 2, 167-184 (2012).
  18. Zoller, R., Schulz, C. The Drosophila cyst stem cell lineage: Partners behind the scenes. Spermatogenesis. 2, 145-157 (2012).
  19. Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. J. Cell Sci.. 107, 3521-3534 (1994).
  20. Rebollo, E., Gonzalez, C. Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes. EMBO Rep. 1, 65-70 (2000).
  21. Castrillon, D. H., et al. Toward a molecular genetic analysis of spermatogenesis in Drosophila melanogaster: characterization of male-sterile mutants generated by single P element mutagenesis. Genetics. 135, 489-505 (1993).
  22. Giansanti, M. G., et al. Genetic dissection of meiotic cytokinesis in Drosophila males. Mol. Biol. Cell. 15, 2509-2522 (2004).
  23. Wakimoto, B. T., Lindsley, D. L., Herrera, C. Toward a comprehensive genetic analysis of male fertility in Drosophila melanogaster. Genetics. 167, 207-216 (2004).
  24. Fuller, M. T., Bate, M., Martinez-Arias, A. . The Development of Drosophila melanogaster. , 71-147 (1993).
  25. Wolfner, M. F. Tokens of love: functions and regulation of Drosophila male accessory gland products. Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 179-192 (1997).
  26. Tram, U., Wolfner, M. F. Male seminal fluid proteins are essential for sperm storage in Drosophila melanogaster. Genetics. 153, 837-844 (1999).
  27. Kemphues, K. J., Raff, E. C., Raff, R. A., Kaufman, T. C. Mutation in a testis-specific beta-tubulin in Drosophila: analysis of its effects on meiosis and map location of the gene. Cell. 21, 445-451 (1980).
  28. Gunsalus, K. C., et al. Mutations in twinstar, a Drosophila gene encoding a cofilin/ADF homologue, result in defects in centrosome migration and cytokinesis. J. Cell Biol. 131, 1243-1259 (1995).
  29. Anderson, M. A., et al. Asunder is a critical regulator of dynein-dynactin localization during Drosophila spermatogenesis. Mol. Biol. Cell. 20, 2709-2721 (2009).
  30. Sitaram, P., Anderson, M. A., Jodoin, J. N., Lee, E., Lee, L. A. Regulation of dynein localization and centrosome positioning by Lis-1 and asunder during Drosophila spermatogenesis. Development. 139, 2945-2954 (2012).
  31. Martins, A. R., Machado, P., Callaini, G., Bettencourt-Dias, M. Microscopy methods for the study of centriole biogenesis and function in Drosophila. Methods in cell biology. 97, 223-242 (2010).
  32. Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and staining of Drosophila larval ovaries. J. Vis. Exp. (10), (2011).
  33. Gonzalez, C., Casal, J., Ripoll, P. Relationship between chromosome content and nuclear diameter in early spermatids of Drosophila melanogaster. Genet. Res. 54, 205-212 (1989).
  34. Liebrich, W. The effects of cytochalasin B and colchicine on the morphogenesis of mitochondria in Drosophila hydei during meiosis and early spermiogenesis. An in vitro study. Cell Tissue. Res. 224, 161-168 (1982).
  35. Wong, R., et al. PIP2 hydrolysis and calcium release are required for cytokinesis in Drosophila spermatocytes. Curr. Biol. 15, 1401-1406 (2005).
  36. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  37. White-Cooper, H. Tissue cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis. Spermatogenesis. 2, 11-22 (2012).
  38. Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes. PLoS Biol. 2, (2004).
  39. Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse live imaging of stem cells in Drosophila testis. Curr. Protoc. Stem Cell. Biol.. 2, 10-1002 (2009).
  40. Sheng, X. R., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138, 3367-3376 (2011).
  41. Belloni, G., et al. Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis. J. Cell Sci. 125, 5441-5452 (2012).
  42. Moon, S., Cho, B., Min, S. H., Lee, D., Chung, Y. D. The THO complex is required for nucleolar integrity in Drosophila spermatocytes. Development. 138, 3835-3845 (2011).
  43. Wang, Z., Mann, R. S. Requirement for two nearly identical TGIF-related homeobox genes in Drosophila spermatogenesis. Development. 130, 2853-2865 (2003).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Temel ProtokolSay 83Drosophila melanogasterDiseksiyontestisspermatogenezmayozgerm h crelerifaz kontrast mikroskobuimmunofloresan

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır