صدمة الموجة التطبيق إلى الخلية الثقافات

Summary

موجات الصدمة في الوقت الحاضر معروفة جيدا لآثارها التجدد. لذا في المختبر التجارب هي من اهتمام متزايد. لذا طورنا نموذجا لفي المختبر صدمة موجة المحاكمات (IVSWT) التي تمكننا من تقليد في ظروف الجسم الحي وبالتالي تجنب الآثار المادية تشتيت.

Abstract

موجات الصدمة في الوقت الحاضر معروفة جيدا لآثارها التجدد. وأظهرت نتائج البحوث الأساسية التي لا تسبب موجات الصدمة حافزا البيولوجية لاستهداف الخلايا أو الأنسجة من دون أي ضرر لاحق. وبالتالي، في التجارب المختبرية ذات أهمية متزايدة. وقد وصفت وسائل مختلفة لتطبيق موجات الصدمة على الثقافات الخلية. بشكل عام، والتركيز كل النماذج القائمة على كيفية تطبيق أفضل موجات الصدمة على الخلايا.

ومع ذلك، لا يزال هذا السؤال: ماذا يحدث لموجات بعد اجتياز خلية ثقافة؟ الفرق من مقاومة الصوتية من مستنبت الخلية والهواء المحيط هو أن عالية، أن أكثر من 99٪ من موجات الصدمة ينعكس! لذا قمنا بتطوير النموذج الذي يتكون أساسا من وعاء زجاجي بنيت التي تسمح للموجات لنشر في الماء بعد اجتياز ثقافة الخلية. هذا يتجنب الآثار التجويف فضلا عن انعكاس الموجات التي من شأنها أن تعكر صفو إلا تلك القادمة. وايعشر هذا النموذج ونحن قادرون على محاكاة الظروف في الجسم الحي وبالتالي كسب المزيد والمزيد من المعرفة حول كيفية يحصل ترجمة التحفيز المادي للموجات صدمة في إشارة الخلية البيولوجية ("mechanotransduction").

Introduction

موجات الصدمة هي موجات ضغط الصوت الناتجة عن الافراج المفاجئ للطاقة، على سبيل المثال. كما الرعد عند البرق. في الطب وقد استخدمت موجات صدمة لأكثر من 30 عاما في تفتيت الحصى لتفكك حصى الكلى. منذ الاكتشاف العرضي للالحرقفي سماكة العظام في المرضى الذين تفتيت الحصى في 1980s في وقت مبكر، وأجريت أولى الدراسات لتقييم تأثير العلاج موجة الصدمة (سبحانه وتعالى) على العظام الشفاء ^1. نتائج باهرة لتحسين الشفاء من nonunions العظام الطويلة يمكن ملاحظة ^2. في وقت لاحق، تم توسيع مؤشرات لجروح الأنسجة الرخوة ^3. وأظهرت نتائج البحوث الأساسية التي لا تسبب موجات الصدمة حافزا البيولوجية إلى الأنسجة المستهدفة دون أي ضرر لاحق. ويتبع الافراج عن عوامل النمو عائية (مثل VEGF، PlGF، جمعية جيل المستقبل) من خلال الأوعية الدموية كبيرة. أدى هذا إلى مزيد من التوسع في المؤشرات نحو الأمراض الدماغية. أظهرت مجموعتنا وآخرون ممثل المؤسسة إيجابيةإلخ من سبحانه وتعالى على مرض القلب الإقفاري في النماذج الحيوانية، وكذلك في التجارب السريرية ^4-6.

ومع ذلك، لا تزال الآلية الدقيقة لكيفية ترجمة الحافز المادي للسبحانه وتعالى في إشارة البيولوجية (mechanotransduction) مجهولة إلى حد كبير. كما الاهتمام سبحانه وتعالى من عدة مجالات الطب زيادات مستمر، والسعي لآلية يتم الحصول على أكثر وأكثر كثافة. لذلك، في المختبر التجارب صدمة الموجة تكتسب أهمية. إلى جانب الحد من التجارب على الحيوانات والفعالية من حيث التكلفة، وأكبر ميزة في المختبر صدمة الموجة العلاج (IVSWT) قد تكون إمكانية دراسة سلوك معين من نوع خلية معينة. في موجة الصدمة بوساطة تجديد الأنسجة على الأرجح وتشارك جميع الخلايا من الأنسجة المعالجة، وتناقش حتى الآثار النظامية. ومع ذلك، كل نوع من الخلايا تلعب دورا محددة ولها وظيفة جوهرية خاصة بها. IVSWT تمكننا من الكشف عن هذا خاصة على وظيفةالثانية مما يعطينا فهم أفضل للعمليات الأساسية المعقدة.

المعرفة اليوم حول آثار موجة صدمة على الثقافات الخلية يتضمن زيادة الانتشار، تغيير مستقبلات غشاء الخلية، وزيادة وتسريع تمايز الخلايا، وإطلاق سراح من عوامل النمو والكيماوي جاذبة فضلا عن زيادة الهجرة الخلية ^7-9.

وقد وصفت الآثار المادية تشتيت في معظم نماذج في المختبر طرق مختلفة لتطبيق موجات الصدمة على الثقافات الخلية. هذه الحقيقة يؤدي إلى المشكلة أنه من الصعب للغاية لمقارنة النتائج، والظروف المادية من التحفيز الخلية هي مختلفة تماما بين هذه النماذج. بشكل عام، والتركيز كل النماذج القائمة على كيفية تطبيق أفضل موجات الصدمة على الخلايا.

ومع ذلك، لا يزال هذا السؤال: ماذا يحدث لموجات بعد اجتياز خلية ثقافة؟ المشكلة الرئيسية هي أن اختلاف الصوتيةمقاومة من مستنبت الخلية والهواء المحيط هو أن عالية، أن أكثر من 99٪ من موجات الصدمة ينعكس الشكل 1.

بسبب الاختلاف في مقاومة الصوتية من وسائل الإعلام اثنين تنعكس ليس فقط على موجات ولكن يحدث انتهاء مرحلة التحول من 180 درجة مما أدى إلى القوات الشد القوي للخلايا الشكل 2.

يتم تعريف مقاومة الصوتية بوصفها نتاجا لكثافة مادة ولها Z سرعة الصوت = ρ خ ج. للمياه مقاومة الصوتية هو ZWater = 1،440،000 نانوثانية / م ^3، لأنها ليست سوى الهواء 420 نانوثانية / م ^3. الفرق كبير من هذه القيمتين النتائج في التأمل ومرحلة التحول من موجات الصدمة. مرحلة التحول يتحول نبض الضغط الايجابي إلى موجة الشد.

حتى لو كان هذا قوة الشد ليست ضارة للخلايا، كونها تتعارض مع فكرة محاكاة آثار موجة الصدمة في الجسم الحي في المختبر. في الجسم الحي هذهقوات الشد بالكاد تحدث نتيجة لهياكل الجسم كبيرة.

وعلاوة على ذلك، والجزء الخلفي تشغيل موجات يمكن حتى تعكر صفو تلك الواردة. قد يسبب هذا التدخل. ومن المعروف نوعين من التدخل. تدخل بناءة يعني أن يتم إضافة كل من موجات مما يؤدي إلى تضاعف السعة الشكل 3. يحدث التدخل المدمرة إذا تلبية موجات على طرفي نقيض. أنه يسبب الغاء موجات (الشكل 3). وبالتالي، IVSWT يحتاج إلى النموذج الذي تمكن موجات صدمة للنشر بعد اجتياز ثقافة الخلية.

IVSWT حمام مائي

الاعتبارات التالية المخاوف المذكورة أعلاه تقودنا إلى تصميم حمام مائي لتفادي المشاكل المذكورة الشكل 4. في الأساس، فإنه يتكون من زجاجي بني الحاويات مع غشاء لتوصيل كل نوع من موجة الصدمة قضيب. للاقتران بين هذا الغشاء ونقل قضيب الموجات فوق الصوتية جنرال الكتريكل لابد من استخدامها. يتم تعبئة حمام الماء بالماء degassed لتجنب التجويف يمكن أن تحدث إذا كان soluted الغاز داخل الماء. ألف سخان في أسفل مع جهاز استشعار درجة الحرارة مرتبطة إلى وحدة تحكم تمكن لتنظيم درجة الحرارة لتقليد في الجسم الحي والظروف لتجنب مزارع الخلايا ليبرد أثناء العملية. ويمكن عقد درجة حرارة ثابتة عند 37 درجة مئوية كما هو الحال عليه في حاضنة. حامل لعينات الخلايا يسمح لتخبط أي نوع من قارورة الثقافة أو أنبوب. وبالتالي، يتعين على السفينة العينة المراد شغلها تماما مع الثقافة المتوسطة، وفقاعات الهواء ستمنع موجات الصدمة! اسفين على شكل امتصاص في الجدار الخلفي للحمام يدمر موجات لكي لا ينعكس وتشغيل مرة أخرى لتفادي أي تشويش.

وثمة ميزة أخرى لنماذج IVSWT الآخر هو إمكانية متفاوتة المسافة بين قضيب وقوارير الثقافة. نتائج مجموعتنا والآخرين الذين يستخدمون ليالي هذا النموذج بوضوحكيف أن كل نوع من الخلايا يتفاعل على وجه التحديد جدا لمعلمات معاملة مختلفة. وعلاوة على ذلك، وتحديد المسافة بين مصدر موجات وعينة أمر بالغ الأهمية، لأنها تتيح لنا السيطرة على الخلايا لتكون في موضع معين في ما يتعلق محور قضيب موجة الصدمة.

Protocol

إذن الأخلاقية

بعد الحصول على الموافقة المسبقة الخطية من المرضى، تم الحصول على الحبل السري من العملية القيصرية في قسم أمراض النساء لعزل الخلايا البطانية الوريد السري الإنسان (HUVECs). أعطيت إذن من لجنة الأخلاق في جامعة انسبروك الطبية (رقم UN4435).

1. إعداد حمام الماء IVSWT

1. إعداد 3.5 لتر من ماء الصنبور في دبابة المناسبة. يحتاج الماء إلى أن يسخن إلى 37 درجة مئوية (انظر البروتوكول 6).
2. ملء الماء في حمام مائي حتى مستوى المياه ما يقرب من 3 سم تحت الحافة. مانع لتغطية كامل الغشاء بالماء. وسوف يتطلب ذلك ما يقرب من 3.5 استعداد L.
3. توصيل جهاز استشعار درجة الحرارة لإمدادات الطاقة.
4. وضع أجهزة الاستشعار في تركيب المقصود على الجدار الخلفي من حمام الماء.
5. ربط التدفئة لإمدادات الطاقة من أجهزة الاستشعار درجة الحرارة. لا تفعل هذا دونأن المياه في الحمام كما سخان إذابة زجاجي.
6. انتظر حتى وصلت درجة حرارة الماء ثابتة من 37 درجة مئوية. حرك الماء بانتظام مع بعض نوع من عصا لضمان درجة حرارة ثابتة طوال حمام الماء.

2. إعداد خلايا وقوارير الثقافة

1. خلايا البذور أكثر من ليلة في الكثافة المطلوبة في قوارير T25 الثقافة أو ثقافة الخلايا في قوارير مباشرة حتى وصلت إلى نقطة التقاء المطلوب.
2. قبل التجربة، محاذاة عموديا القوارير.
3. ملء قوارير الثقافة مع ثقافة متوسطة حتى الحق دون أعناقهم. لا تملأ كثيرا المتوسطة في قوارير كوسط على اتصال في الرقبة أو إغلاق الغطاء سوف تحصل الملوثة.
4. المسمار القوارير مع قبعات صلبة دون مرشحات لمنع التلوث من المياه. مانع أن المياه في الحمام والحمام نفسه ليست عقيمة.
5. ختم قبعات مع parafilm قبل الإدراج في حمام مائي.
<لى> إصلاح قوارير الثقافة مختومة في موقف المقدمة.
6. إدراج قارورة ثابتة في حمام مائي. الحرص على أن منتصف القارورة ثقافة الخلية هو على نفس الارتفاع كمركز للغشاء صدمة موجة قضيب لل. خط على جانب حمام يرشدك.

3. تحديد العلاج معلمات

1. تحديد المسافة بين مصدر موجة الصدمة والعينة. تحديد المعلمات العلاج المثالي من خلال إجراء التجربة الرائدة لتقصي معلمة كما هو موضح في الشكل (6).
2. اختيار العلاج المناسب المعلمات (كثافة تدفق الطاقة، والتردد) على الجهاز موجة الصدمة. مرة أخرى، راجع الشكل 6.

4. تطبيق صدمة الموجة

1. وضع الكثير من المبالغ المتاحة تجاريا هلام الموجات فوق الصوتية على انتقال الصدمة موجة قضيب وكذلك على الغشاء من حمام الماء. هذا هو لضمان اقتران. ينبغي أن يكون هناك هواء أو فقاعات الهواء بين قضيب والغشاء كماانها تمتص موجات الصدمة.
2. ربط قضيب لغشاء والاحتفاظ بها مستقرة في وسط الغشاء. الحرص على أن يتم محاذاة أفقيا.
3. تأكد من أن الوضع الرأسي الصحيح من التحقيق داخل حمام ماء يتماشى مع وضع علامات وأشار في جانب من الحمام.
4. عقد المراكز من قضيب ومستقرة قارورة في خط أفقي.
5. تنشيط الجهاز موجة الصدمة وتطبيق نبضات مع الحفاظ على قارورة الثقافة فضلا عن قضيب في وضع مستقر خلال الإجراء بأكمله.

5. بعد العلاج

1. أخذ قارورة الثقافة للخروج من حمام الماء.
2. جففه مع المناشف الورقية المشتركة.
3. مسح القارورة بدقة مع وكلاء تطهير.
4. إزالة Parafilm ختم وغطاء.
5. ماصة متوسطة داخل القوارير في أنابيب الطرد المركزي.
6. أجهزة الطرد المركزي بشكل مناسب. المعلمات الطرد المركزي تعتمد على نوع من الخلايا المستخدمة، على سبيل المثال. لHUVECs، استخدم 290 غرام عند درجة حرارة الغرفة.
7. إضافة 5ml من خلية ثقافة المتوسط ​​إلى القارورة. resuspend الكرية خلية طرد مع 2 مل من مستنبت الخلية. ماصة تعليق في القارورة. وبالتالي، شظايا الخلية أو الخلايا التي قد تكون منفصلة أثناء العلاج لا تضيع.

المزالق

1. ينبغي أن يتم التحضير وكذلك العلاج تحت ظروف معقمة داخل تدفق الصفحي لتجنب التلوث من ثقافة الخلية.
2. ينصح جيدة ممارسة زراعة الخلايا لتجنب التلوث من تحقيقات. على وجه الخصوص فمن المستحسن تعقيم خارج القوارير بشدة قبل وضعها مرة أخرى إلى الحاضنة. الحمام المائي، وكذلك داخل المياه، ليست عقيمة!
3. لا تقم بتوصيل سخان لإمدادات الطاقة ما لم يتم تعبئة حمام ماء مع الماء لتجنب الأضرار التي لحقت زجاجي بني الحمام.
4. استخدام كميات سخية من هلام الموجات فوق الصوتية على تطبيق ورقة موجة الصدمةicator لضمان اقتران السليم وانتشار الموجات في الحمام. فقاعات الهواء الجوي، وحتى الصغيرة تفعل استيعاب موجات الصدمة!
5. التحقق من موقف من تحقيقات داخل حمام ماء فيما يتعلق قضيب لضمان معاملة منطقة النمو بأكملها.
6. لا دونك تحقيقات عميقة جدا في الماء لتجنب التلوث.

النتائج

باستخدام الطريقة الموصوفة طبقنا موجات الصدمة إلى الخلايا البطانية الوريد السري الإنسان (HUVECs) أننا المذكورة معزولة من الحبل السري. تم الحصول على الحبل السري من العمليات القيصرية الاختيارية.

وعولج HUVECs في التقاء 90٪ في ثقافة خلية قا...

Discussion

أهمية النموذج المقترح لفي المختبر صدمة الموجة العلاج هو حقيقة أن موجات يمكن نشر بعد اجتياز ثقافة الخلية على النقيض من النماذج الحالية. وبالتالي، والآثار المادية المزعجة مثل القوات الشد يمكن تجنبها. نموذج أكثر شبها في ظروف الجسم الحي من ذلك من قبل الآخ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Orthogold shock wave device	Tissue Regeneration Technologies, Woodstock, GA – manufactured by MTS-Europe GmbH, Konstanz, Germany
IVSWT Water Bath V2.0	Johann Hohenegger - Technical Products
EBM-2 Basal Medium 500 m +EGM-2 SingleQuot Suppl. & Growth Factors	Lonza	CC-3156 & CC-4176	This medium was used for the shown experiments with HUVECs to fill the cell culture flask. For other cell types, use the recommended medium.
Pechiney Parafilm M PM996	Pechiney Plastic Packaging	PH-LF-PM996-EA at labplanet.com	for sealing flasks
Falcon Serological pipettes 25 ml	Becton Dickinson Labware	357525
CellMate II Serological Pipette	Matrix Technologies
Skintact Ultrasonic Gel	Skintact	UL-01 250 ml
T25 Cell culture flasks	COSTAR	3056
Mikrozid disinfectant	Schülke
3.5 L Degassed water
Paper towels