Shock Wave אפליקציות לסלולריים תרבויות

Summary

גלי הלם כיום ידועים אפקטי ההתחדשות שלהם. לכן בניסויים במבחנה הם עניין הולך וגובר. לפיכך, אנו פיתחנו מודל לניסויים במבחנה הלם גל (IVSWT) המאפשר לנו לחקות בתנאי vivo ובכך להימנע השפעות פיזיות מסיחות את הדעת.

Abstract

גלי הלם כיום ידועים אפקטי ההתחדשות שלהם. ממצאי מחקר בסיסיים הראו שגלי הלם שגורמים לגירוי ביולוגי למקד תאים או רקמות ללא כל נזק שלאחר מכן. לכן, בניסויים במבחנה הם עניין הולך וגובר. שיטות שונות של יישום גלי הלם על תרביות תאים כבר תיארו. באופן כללי, כל הדגמים הקיימים להתמקד איך ליישם הטוב ביותר גלי הלם על גבי תאים.

עם זאת, שאלה זו נותרה פתוחה: מה קורה לגלים לאחר שעבר את תרבית התאים? ההבדל של העכבה אקוסטית של מדיום תרבית התאים ואוויר הסביבה הוא כל כך גבוה, כי יותר מ 99% מגלי הלם מקבלים לידי ביטוי! לפיכך, אנו פיתחנו מודל המורכב בעיקר מיכל פרספקס בנוי המאפשר הגלים כדי להפיץ במים לאחר שעברו את תרבית התאים. זה ימנע תופעות cavitation, כמו גם השתקפות של הגלים שאחרת להפריע הקרובים אלה. Wiה מודל זה אנו מסוגלים לחקות in vivo תנאים וכך לקבל עוד ועוד ידע על איך הגירוי הפיזי של גלי הלם מקבל מתורגם לאותות ביולוגיים תא ("mechanotransduction").

Introduction

גלי הלם הם גלי לחץ קול הנובעים משחרור פתאומי של אנרגיה, למשל. כמו רעם כאשר ברקים. ברפואת גלי הלם היו בשימוש במשך 30 שנים בLithotripsy להתפוררות של אבנים בכליות. מאז הממצא הנלווה של עיבוי עצם הכסל בחולי Lithotripsy בתחילת 1980s, מחקרים ראשונים שנערכו על מנת להעריך את ההשפעה של טיפול גל הלם (SWT) על עצם ריפוי ^1. תוצאות מרשימות של ריפוי משופר של nonunions ארוך עצם יכולה להיבחן ^2. בהמשך לכך, הורחבו אינדיקציות לפצעים ברקמות רכים ^3. ממצאי מחקר בסיסיים הראו שגלי הלם שגורמים לגירוי ביולוגי לרקמות היעד ללא כל נזק שלאחר מכן. שחרורו של גורמי גדילת angiogenic (למשל VEGF, PlGF, FGF) ואחריו אנגיוגנזה המשמעותית. זה הוביל להרחבה נוספת של אינדיקציות לכיוון פתולוגיות איסכמי. הקבוצה ואחרים שלנו הראו EFF החיוביect של SWT על מחלת לב איסכמית במודלים של בעלי חיים, כמו גם בניסויים קליניים ^4-6.

עם זאת, המנגנון של איך הגירוי הפיזי של SWT מתורגם לאותות ביולוגיים (mechanotransduction) המדויק נשאר במידה רבה לא ידוע. כעניין בSWT ממספר תחומים של רפואת עליות ברציפות, את החיפוש אחר המכניזם הוא מקבל יותר ויותר אינטנסיבי. לכן, בניסויים במבחנה גל הלם צוברים חשיבות. חוץ מצמצום ניסויים בבעלי החיים ועלות משתלמת, היתרון הגדול ביותר של במבחנה טיפול בהלם גל (IVSWT) עשוי להיות האפשרות ללמוד את ההתנהגות הספציפית של סוג תא מסוים. בהתחדשות רקמות בתיווך גל הלם סביר להניח שכל התאים של הרקמה שטופלה מעורבים, גם תופעות מערכתיות הם דנו. עם זאת, כל סוג תא ממלא תפקיד מסוים ויש לו תפקיד המהותי משלה. IVSWT מאפשר לנו לזהות פונקציה מסוימת זהnd ובכך נותן לנו הבנה טובה יותר של התהליכים הבסיסיים המורכבים.

הידע של היום על ההשפעות של גל הלם בתרביות תאים כולל גידול של שגשוג, שינוי של קולטני קרום תא, עלייה והאצת התמיינות תאים, שחרור של גורמי גדילה והכימותרפיה משיכה, כמו גם נדידת תאים מוגברת ^7-9.

השפעות פיזיות מסיחות את הדעת ברוב במודלים חוץ גופית שיטות שונות של יישום גלי הלם על תרביות תאים כבר תיארו. עובדה זו מובילה לבעיה שקשה מאוד להשוות את התוצאות, כתנאים פיזיים של גירוי תאים שונים לגמרי בין דגמים אלה. באופן כללי, כל הדגמים הקיימים להתמקד איך ליישם הטוב ביותר גלי הלם על גבי תאים.

עם זאת, שאלה זו נותרה פתוחה: מה קורה לגלים לאחר שעבר את תרבית התאים? הבעיה העיקרית היא שההבדל של אקוסטיתעכבה של מדיום תרבית תאים ואוויר הסביבה היא כל כך גבוהה, כי יותר מ 99% מגלי הלם מקבלים ביטוי איור 1.

בשל ההבדל בהתנגדות האקוסטית של שתי מדיה הגלים משתקפים לא רק, אלא שלב משמרת של 180 ° מתרחשת כתוצאה מכך כוחות מתיחה חזקים לתאי איור 2.

עכבה אקוסטית מוגדרת כתוצר של הצפיפות של חומר וZ מהירות קול שלה = ρ x ג. למים העכבה אקוסטית היא ZWater = 1,440,000 Ns / ³ מ ', לאוויר זה רק 420 Ns / m ^3. ההבדל הגדול בין שני ערכים אלה גורם לשינוי השתקפות ושלב של גלי הלם. פאזה הופכת דופק לחץ חיובי לגל מתיחה.

גם אם כוח מתיחה זו אינו מזיק לתאים, והוא משבש את הרעיון של חיקוי בהשפעות גל הלם vivo במבחנה. בvivo אלהכוחות המתיחה כמעט ולא מתרחשים, בגלל מבנה גוף גדול.

יתר על כן, בחלק האחורי פועל גלים יכול אפילו להפריע הנכנסים אלה. זה עלול לגרום להפרעות. שני סוגים של הפרעה ידועים. התאבכות בונה אומרת ששני הגלים נוספים ובכך וכתוצאה מכך הוכפל המשרעת איור 3. התערבות הרסנית מתרחשת אם גלים לפגוש מנוגדים. זה גורם לביטול של גלים (איור 3). לכן, IVSWT צריך מודל המאפשר לגלי הלם להפיץ לאחר שעבר את תרבית התאים.

אמבט מים IVSWT

שיקולים הבאים החששות שהוזכרו לעיל יובילו אותנו לעיצוב אמבט מים למניעת הבעיות שתוארו איור 4. בעיקרון, זה מורכב מפרספקס בנוי מיכל עם קרום להתחבר לכל סוג של המוליך גל הלם. לצימוד בין הקרום הזה והולכת אולטרסאונד המוליך gel יש להשתמש. אמבט המים מלא במי degassed להימנע cavitation שיתרחש אם הגז היה soluted בתוך המים. דוד בתחתית עם חיישן טמפרטורה המחובר ליחידת בקרה מאפשר לווסת את הטמפרטורה לחיקוי של in vivo תנאים ולהימנע מתרביות תאים להתקרר במהלך ההליך. טמפרטורה יכולה להיות מוחזקת יציבה ב37 מעלות צלזיוס כפי שזה נעשה בחממה. בעל לדגימות התאים מאפשר לטבילה כל סוג של בקבוק תרבות או צינור. ובכך, כלי המדגם צריך להיות מלא לחלוטין עם מדיום התרבות, כמו בועות אוויר יחסמו את גלי הלם! בולם בצורת טריז בקיר האחורי של האמבטיה destructs גלים על מנת שלא לקבל לידי ביטוי ולרוץ בחזרה, כדי למנוע הפרעה.

יתרון נוסף לדגמי IVSWT אחרים הוא האפשרות של שינוי המרחק בין המוליך וצלוחיות התרבות. ממצאים של הקבוצה שלנו ואחרים שמשתמשים במודל זה באופן ברור זהאיך שכל סוג תא מגיב באופן ספציפי מאוד לפרמטרי טיפול שונים. יתר על כן, המגדיר את המרחק בין המקור של הגלים והמדגם הוא קריטי שכן הוא מאפשר לנו לשלוט על התאים להיות במיקום מסוים ביחס למוקד של המוליך גל הלם.

Protocol

אישור אתי

לאחר קבלת כתב הסכמה מדעת של חולים, חבלי טבור התקבלו מניתוח קיסרי במחלקה לגינקולוגיה לבידוד של תאים אנושיים טבור אנדותל הווריד (HUVECs). הרשאה ניתנה מוועדת האתיקה של האוניברסיטה הרפואית אינסברוק (מס 'UN4435).

1. הכן את אמבט IVSWT המים

1. הכן 3.5 L של מים ברז במכל מתאים. מים צריך להיות מחוממים ל37 מעלות צלזיוס (ראה פרוטוקול 6).
2. למלא את המים לתוך אמבט המים עד למפלס המים הוא כ 3 ס"מ מתחת לקצה. אכפת לי לכסות את הקרום במים לחלוטין. זה ידרוש כ 3.5 L. מוכן
3. חבר את חיישן הטמפרטורה לאספקת החשמל.
4. שים את החיישן למדידה נועדה על הקיר האחורי של אמבט המים.
5. חבר חימום לאספקת חשמל של חיישן הטמפרטורה. אל תעשה את זה בלימים באמבט כדוד הייתי להמס את הפלסטיק.
6. חכה עד שהמים מגיעים לטמפרטורה יציבה של 37 ° C. מערבבים את המים באופן קבוע עם איזה מקל כדי להבטיח טמפרטורה קבועה לאורך כל אמבט המים.

2. הכן את התאים וצלוחיות תרבות

1. תאי זרע על פני הלילה בצפיפות רצויה בתרבות צלוחיות T25 או תרבות התאים בצלוחיות ישירות עד שהם הגיעו לנקודת המפגש הרצויה.
2. לפני הניסוי, ליישר את צלוחיות בצורה אנכית.
3. למלא את צלוחיות התרבות עם התרבות בינונית עד ממש מתחת לצווארם. אל תמלאו יותר מדי בינוני לתוך צלוחיות כבינוניות בקשר לצוואר או כובע הסגירה היית מקבל מזוהמת.
4. הברג את צלוחיות עם כובעים מוצקים ללא מסננים על מנת למנוע זיהום ממים. אכפת שהמים באמבטיה והאמבטיה עצמה הן לא סטרילי.
5. חותם את כובעים עם Parafilm לפני הכניסה לתוך אמבט המים.
6. תקן תרבות צלוחיות חתומות בדוכן שסופק.
7. הכנס בקבוק קבוע לתוך אמבט המים. תשמור על עצמך שאמצע בקבוק תרבית תאים הוא באותו הגובה כמרכז של הקרום של המוליך גל ההלם. בתור בצד של האמבטיה מנחה אותך.

3. הגדרת טיפול פרמטרים

1. הגדרת מרחק בין מקור גל ההלם ומדגם. זהה את הפרמטרים טיפול מושלמים על ידי ביצוע ניסוי פיילוט ממצא פרמטר כמתואר באיור 6.
2. בחר את הפרמטרים הנכונים לטיפול (צפיפות שטף אנרגיה, תדירות) על מכשיר גל הלם. שוב, עיין באיור 6.

4. Shock Wave יישום

1. שים כמויות שפע של ג'ל שידור אולטרסאונד זמין מסחרי במוליך גל ההלם, כמו גם על הממברנה של אמבט המים. הדבר נעשה כדי להבטיח צימוד. אין בועות אוויר או אוויר צריכה להיות בין המוליך והקרום כמוזה יהיה לקלוט גלי הלם.
2. חבר המוליך לממברנה ולהחזיק אותו יציב במרכז של הממברנה. תשמור על עצמך שיהיה מיושר אופקי.
3. ודא שהמצב האנכי הנכון של החללית בתוך אמבט המים בקנה אחד עם סימון מצויינים בצד השני של האמבטיה.
4. מחזיק מרכזים של המוליך ויציב הבקבוק בקו אופקי.
5. הפעל את מכשיר גל הלם וליישם את הדחפים, תוך שמירה על בקבוק התרבות, כמו גם את המוליך במצב יציב במהלך ההליך כולו.

5. לאחר טיפול

1. קח בקבוק התרבות מחוץ לאמבט המים.
2. לייבש אותו במגבות נייר משותפות.
3. נגב את הבקבוק בצורה מדויקת עם סוכני חיטוי.
4. הסר איטום Parafilm וכובע.
5. פיפטה בינונית בתוך צלוחיות לתוך צינורות הצנטריפוגלי.
6. צנטריפוגה כראוי. פרמטרים צנטריפוגה תלויים בסוג התא בשימוש, למשל. לHUVECs, השתמש 290 גרם בטמפרטורת חדר.
7. להוסיף 5 מ"ל של מדיום תרבות תא לבקבוק. Resuspend התא גלולה centrifuged עם 2 מיליליטר של מדיום תרבות תא. פיפטה ההשעיה לתוך הבקבוק. לפיכך, שברי תא או תאים שעלולים הופרדו במהלך טיפול לא הולכים לאיבוד.

החסרונות

1. הכנה, כמו גם טיפול צריכה להתבצע בתנאים סטריליים בתוך הזרימה למינרית כדי למנוע זיהום של תרבית התאים.
2. בפועל תרבית תאים טובות מומלץ כדי למנוע זיהום של הבדיקות. בפרט חיטוי של החלק החיצוני של צלוחיות מומלץ מאוד לפני שמכניס חזרה לחממה אותם. אמבט המים, כמו גם בתוך המים, לא סטרילי!
3. אל תחבר את התנור לאספקת החשמל, אלא אם כן אמבט מים מלא במים כדי למנוע נזק לפרספקס נבנה אמבטיה.
4. השתמש בכמויות נדיבות של ג'ל אולטרסאונד על Appl גל ההלםicator להבטיח צימוד נכון והתפשטות גלים לאמבטיה. בועות אוויר אוויר ואפילו קטנים לעשות לספוג גלי הלם!
5. בדוק את העמדה של הבדיקות בתוך אמבט המים ביחס למוליך כדי להבטיח טיפול באזור הגידול כולו.
6. אל dunk בדיקות עמוקים מדי לתוך המים, כדי למנוע זיהום.

תוצאות

שימוש בשיטה המתוארת אנחנו מוחלים גלי הלם לתאי אנדותל וריד טבור אנושיים (HUVECs) שצוינו מבודדת מחבלי טבור. חבלי טבור התקבלו מסעיפים קיסריים אלקטיבי.

טופלו HUVECs במפגש של 90% בבקבוק תרבית תאי T25 עם מערכת טיפול גל הלם אלקטרו. פרמטרים טיפול ?...

Discussion

המשמעות של המודל המוצע לטיפול במבחנה גל הלם היא העובדה שגלים יכולים להפיץ לאחר שעברו את תרבית התאים בניגוד לדגמים קיימים. ובכך, ניתן להימנע מתופעות מטרידות פיזיות כגון כוחות מתיחים. המודל דומה יותר בתנאי vivo מזה על ידי אחרים יישום גלים לצלוחיות תרבית תאים של...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Orthogold shock wave device	Tissue Regeneration Technologies, Woodstock, GA – manufactured by MTS-Europe GmbH, Konstanz, Germany
IVSWT Water Bath V2.0	Johann Hohenegger - Technical Products	-
EBM-2 Basal Medium 500 m +EGM-2 SingleQuot Suppl.&Growth Factors	Lonza	CC-3156 & CC-4176	This medium was used for the shown experiments with HUVECs to fill the cell culture flask. For other cell types, use the recommended medium.
Pechiney Parafilm M PM996	Pechiney Plastic Packaging	PH-LF-PM996-EA at labplanet.com	for sealing flasks
Falcon Serological pipets 25ml	Becton Dickinson Labware	357525
CellMate II Serological Pipette	Matrix Technologies	-
Skintact Ultrasonic Gel	Skintact	UL-01 250 ml
T25 cell culture flasks	COSTAR	3056
mikrozid disinfectant	Schülke	-
3,5l degassed water
paper towels