Ударно-волновой Применение к клеточных культур

Резюме

Ударные волны в настоящее время хорошо известны за их регенеративных эффектов. Поэтому эксперименты в пробирке из растущего интереса. Поэтому мы разработали модель для в пробирке ударных волн исследований (IVSWT), что позволяет нам имитировать в условиях естественных условиях, благодаря чему исключаются отвлекающие физические эффекты.

Аннотация

Ударные волны в настоящее время хорошо известны за их регенеративных эффектов. Основные результаты исследований показали, что ударные волны вызывают биологический стимул к клеткам-мишеням или тканей без последующего ущерба. Таким образом, эксперименты в пробирке из растущего интереса. Различные методы нанесения ударные волны на культурах клеток были описаны. В общем, все существующие модели сосредоточиться на том, как лучше применять ударные волны на клетках.

Тем не менее, этот вопрос остается: Что происходит с волнами после прохождения через клеточную культуру? Разность акустического импеданса среды культуры клеток и окружающим воздухом, что высока, что более 99% ударных волн будут отражаться! Поэтому мы разработали модель, которая в основном состоит из оргстекла построен контейнер, который позволяет волны распространяться в воде после прохождения через клеточную культуру. Это позволяет избежать кавитационных эффекты, а также отражение волн, которые могли бы нарушить предстоящих них. Wiй этой модели мы можем имитировать Vivo условия в и таким образом получить больше и больше знаний о том, как физический стимул ударных волн будет преобразован в сигнал биологической клетки ("механотрансдукции").

Введение

Ударные волны являются звуковые волны давления, возникающие в результате внезапного высвобождения энергии, например. как гром, когда молния. В медицине ударные волны были использованы на протяжении более 30 лет в литотрипсии для распада камней в почках. С побочной нахождения подвздошной кости утолщение в литотрипсии пациентов в начале 1980-х, первые исследования были проведены, чтобы оценить эффект лечения ударно-волновой (SWT) на кости исцеления ^1. Впечатляющие результаты улучшения заживления длинных костей несращения можно было наблюдать ^2. Впоследствии, показания были расширены на раны мягких тканей ^3. Основные результаты исследований показали, что ударные волны вызывают стимул биологической ткани-мишени без последующего повреждения. Выпуск ангиогенных факторов роста (например, VEGF, PLGF, FGF) следует значительной ангиогенеза. Это привело к дальнейшему расширению показаний к ишемических патологий. Наша группа и другие показали положительную эффECT из УВТ по ишемической болезни сердца на животных моделях, а также в клинических испытаниях ^4-6.

Тем не менее, точный механизм, как физическое стимулом SWT переводится в биологической сигнала (механотрансдукции) остается неизвестной. Как интереса к SWT от нескольких областях медицины непрерывно увеличивается, стремление к механизму становится все более и более интенсивным. Таким образом, в пробирке ударных волн эксперименты приобретают все большее значение. Кроме сокращения экспериментах на животных и экономической эффективности, самое большое преимущество в пробирке лечения ударной волны (IVSWT) может быть рассмотрена возможность исследования специфическое поведение определенного типа клеток. В ударной волны опосредованного регенерации тканей, скорее всего, все клетки обрабатываемой ткани участвуют, обсуждаются даже системные эффекты. Тем не менее, каждый тип клеток играет особую роль и имеет свою собственную встроенную функцию. IVSWT позволяет обнаружить эту конкретную функцию ай, таким образом, дает нам лучшее понимание сложных основных процессов.

Сегодняшний знания о эффектов ударной волны по клеточных культур включает в себя увеличение пролиферации, изменение рецепторов клеточных мембран, увеличение и ускорение дифференцировки клеток, высвобождение факторов роста и химио-аттрактантов, а также повышенную миграцию клеток ^7-9.

Отвлекающие физические эффекты в самых в пробирке моделей различных методов применения ударных волн на клеточных культурах были описаны. Этот факт приводит к проблеме, что это очень трудно сравнивать результаты, как физические условия стимуляции клеток существенно отличаются между этими моделями. В общем, все существующие модели сосредоточиться на том, как лучше применять ударные волны на клетках.

Тем не менее, этот вопрос остается: Что происходит с волнами после прохождения через клеточную культуру? Основная проблема заключается в том, что разница в акустическихимпеданс клеточной культуральной среде и окружающим воздухом, что высока, что более 99% ударных волн будут отражаться Рисунок 1.

Из-за разницы в акустического импеданса двух сред волны не только отражение, но фазового сдвига на 180 ° происходит в результате сильных растягивающих сил на клетки Рисунок 2.

Акустическая сопротивление определяется как произведение плотности материала и его скорость звука Z = ρ х в. Для воды акустический импеданс является ZWater = 1440000 Ns / м ^3, для воздуха это только 420 Нс / м ^3. Большое различие этих двух величин приводит отражения и сдвига фаз ударных волн. Сдвиг фазы оказывается импульс положительным давлением в растяжение волны.

Даже если это усилие натяжения не является вредным для клеток, он мешает с идеей подражая в естественных условиях ударно-волновых эффектов в пробирке. В естественных условиях этирастягивающие усилия вряд ли произойти из-за больших структур тела.

Кроме того, задняя бегущих волн могут даже мешать входящие. Это может вызвать помехи. Два типа помех известны. Конструктивная интерференция означает, что обе волны добавляются в результате чего в два раза амплитуды рисунке 3. Деструктивная интерференция возникает, если волны встречаются диаметрально противоположны. Это вызывает отмену волн (рис. 3). Поэтому IVSWT нужна модель, которая позволяет ударные волны распространяться после прохождения через клеточную культуру.

Водяная баня IVSWT

Соображения следующие вышеупомянутых проблем приведет нас к разработке ванну воды для избежания описанные проблемы Рисунок 4. В принципе, он состоит из оргстекла построен контейнер с мембраной для подключения каждый вид ударной волны аппликатора. Для связи между этой мембраны и передачи аппликатор ультразвука гел должен быть использован. Водяная баня наполняется дегазированной воды, чтобы избежать кавитации, что произошло бы, если газ растворяется в воде. Нагреватель на дне с помощью датчика температуры, соединенного с блоком управления позволяет регулировать температуру для имитации условий в естественных условиях и, чтобы избежать клеточных культур остыть во время процедуры. Температура может быть привлечен к стабильным на уровне 37 градусов по Цельсию, как это делается в инкубаторе. Держатель для образцов клеток позволяет погружением любой культуральной колбы или трубки. Таким образом, образец сосуд должен быть полностью заполнен культуральной среде, как пузырьки воздуха будет блокировать ударные волны! Клиновидный поглотитель на задней стенке ванны разрушает волны для того, чтобы не отраженного и отбежать, чтобы избежать помех.

Еще одно преимущество для других моделей IVSWT является возможность изменения расстояния между аппликатором и культуральных колбах. Выводы нашей группы и другие лица, использующие эта модель явно ыкак, что каждый тип клеток реагирует очень специально для различных параметров обработки. Кроме того, определение расстояния между источником волн и образцом очень важно, поскольку оно позволяет управлять элементами, чтобы быть в определенном положении по отношению к фокусе ударной волны аппликатора.

протокол

Этические разрешение

После получения письменного информированного согласия пациентов, пуповины были получены из кесарева сечения на кафедре гинекологии для изоляции человека эндотелиальных клеток пупочной вены (HUVECs). Разрешение было дано от комитета по этике Инсбрук медицинского университета (№ UN4435).

1. Подготовьте IVSWT водяной бане

1. Подготовка 3,5 л водопроводной воды в соответствующем баке. Вода должна быть нагрета до 37 ° С (см. Протокол № 6).
2. Заполните воду в водяной бане, пока уровень воды не находится примерно в 3 см ниже края. Следите, чтобы полностью покрыть мембрану с водой. Это потребует примерно подготовленный 3,5 L.
3. Датчик температуры подключить к источнику питания.
4. Поместите датчик в фитинг, предназначенного на задней стенке водяной бане.
5. Подключите отопление к источнику питания датчика температуры. Не делайте этого, неводы в ванне, как нагревателя будет таять оргстекла.
6. Подождите, пока вода не достигла стабильного температуру 37 ° С Размешайте воду регулярно с какой-то палкой, чтобы гарантировать постоянную температуру на протяжении всего водяной бане.

2. Подготовка ячеек и колбы с культурой

1. Семенной клетки в течение ночи при требуемой плотности в T25 колбы с культурой или культурой клеток в колбах непосредственно, пока они не достигли желаемого слияния.
2. Перед экспериментом, совместите колб вертикально.
3. не Заполните культуры колбы с питательной среде до прямо под их шеях. Не заполняйте слишком много среды в колбах, как среды в контакте с шеи или закрытия крышки будет откладываться загрязнения.
4. Винт колбы с твердотельных конденсаторов без фильтров для предотвращения загрязнения из воды. Напоминаем, что вода в ванне, и сама ванна не являются стерильными.
5. Уплотнение крышки парафином до введения в водяной бане.
<литий> Fix запечатанные колбы с культурой в предоставленном стенде.
6. Вставка фиксированный колбу в водяную баню. Позаботьтесь, чтобы середина клеточной культуры колбу находится на той же высоте, центре мембраны ударной волны аппликатора. Линия на стороне ванны поможет вам.

3. Определить лечения по Параметры

1. Определить расстояние между источником ударной волны и образца. Определить идеальные параметры обработки путем проведения пилотного эксперимента ознакомительной параметр, как описано на фигуре 6.
2. Выберите правильные параметры лечения (плотность потока энергии, частоты) на ударной волны устройства. Опять же, см. Рисунок 6.

4. Ударной волны Применение

1. Поместите большим количество коммерчески доступного ультразвукового геля передачи от волнового аппликатора ударной а также на мембране водяной бане. Это должно гарантировать, муфту. Нет воздуха или воздуха должно быть между аппликатором и мембраны какбыло бы поглощать ударные волны.
2. Подключение аппликатор с мембраной и удерживать его стабильным в центре мембраны. Позаботьтесь, чтобы оно располагалось горизонтально.
3. Убедитесь в том, что правильное вертикальное положение зонда внутри водяной бане находится в соответствии с указанными маркировки на стороне ванны.
4. Держите центры аппликатором и колбы стабильной в виде горизонтальной линии.
5. Активируйте ударной волны устройства и применять импульсы, сохраняя при этом колбу культуры, а также аппликатор в устойчивом положении во время всей процедуры.

5. После обращения

1. Возьмем культуральной колбы из водяной бане.
2. Высушите его с общими бумажными полотенцами.
3. Протрите колбу точно с дезинфицирующих средств.
4. Удалить парафильмом уплотнение и крышку.
5. Внесите среды внутри колбы в центробежных труб.
6. Центрифуга соответствующим образом. Центрифугирования параметры зависят от используемого типа клеток, Например. для HUVECs, используйте 290 г при комнатной температуре.
7. Добавить 5 мл клеточной культуральной среды в колбу. Ресуспендируют осадок клеток центрифугируют с 2 мл клеточной культуральной среды. Внесите подвеску в колбу. Таким образом, фрагменты клеток или клеток, которые могут быть отдельные во время лечения не заблудиться.

Подводные камни

1. Подготовка, а также лечение должно проводиться в стерильных условиях внутри ламинарного потока, чтобы избежать загрязнения клеточной культуре.
2. Хорошая практика культивирования клеток рекомендуется, чтобы избежать загрязнения зондов. В частности дезинфекция снаружи колбы настоятельно рекомендуется, прежде чем положить их обратно в инкубатор. Водяная баня, а также вода внутри, не является стерильной!
3. Не подключайте обогреватель к источнику питания, если вода ванна не наполнится водой, чтобы избежать повреждения оргстекла построенных ванну.
4. Используйте щедрое количество ультразвукового геля на ударной волны заявлicator, чтобы гарантировать надлежащее сцепление и распространение волн в ванну. Воздушные и даже небольшие пузырьки воздуха делают поглощают ударные волны!
5. Проверить положение зондов внутри водяной бане по отношению к аппликатору, чтобы обеспечить обработку всей площади роста.
6. Не замочить зонды слишком глубоко в воду, чтобы избежать загрязнения.

Результаты

Использование описанного способа мы применяется ударные волны в эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVECs), что мы прежде изолированную от пуповины. Пуповины были получены из выборных кесарева сечения.

HUVECs лечили при впадении 90% в колбе T25 культуре клеток с элек?...

Обсуждение

Значимость предложенной модели для экстракорпорального лечения ударной волны является то, что волны могут распространяться после прохождения через клеточную культуру в отличие от существующих моделей. Таким образом, тревожные физические эффекты, такие как растягивающих сил мо?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Orthogold shock wave device	Tissue Regeneration Technologies, Woodstock, GA – manufactured by MTS-Europe GmbH, Konstanz, Germany
IVSWT Water Bath V2.0	Johann Hohenegger - Technical Products
EBM-2 Basal Medium 500 m +EGM-2 SingleQuot Suppl. & Growth Factors	Lonza	CC-3156 & CC-4176	This medium was used for the shown experiments with HUVECs to fill the cell culture flask. For other cell types, use the recommended medium.
Pechiney Parafilm M PM996	Pechiney Plastic Packaging	PH-LF-PM996-EA at labplanet.com	for sealing flasks
Falcon Serological pipettes 25 ml	Becton Dickinson Labware	357525
CellMate II Serological Pipette	Matrix Technologies
Skintact Ultrasonic Gel	Skintact	UL-01 250 ml
T25 Cell culture flasks	COSTAR	3056
Mikrozid disinfectant	Schülke
3.5 L Degassed water
Paper towels