Shock Wave Anwendung auf Zellkulturen

Zusammenfassung

Stoßwellen sind heute bekannt für ihre regenerierende Wirkung bekannt. Daher in vitro-Experimenten sind von zunehmendem Interesse. Wir haben daher ein Modell entwickelt, für die in vitro-Studien Schockwelle (IVSWT), die es uns ermöglicht, in vivo-Bedingungen dadurch vermeiden störende physikalische Effekte zu imitieren.

Zusammenfassung

Stoßwellen sind heute bekannt für ihre regenerierende Wirkung bekannt. Die Grundlagenforschung Ergebnisse zeigten, dass Stoßwellen nicht dazu führen, eine biologische Reiz auf Zellen oder Gewebe gezielt ohne Folgeschäden. Daher sind in vitro-Experimenten von zunehmendem Interesse. Verschiedene Methoden der Anwendung von Stoßwellen auf Zellkulturen beschrieben. In der Regel konzentrieren sich alle bestehenden Modelle für die Schockwellen auf Zellen besten anzuwenden.

Allerdings bleibt die Frage: Was passiert mit den Wellen nach dem Passieren der Zellkultur? Der Unterschied der akustischen Impedanz des Zellkulturmediums und der Umgebungsluft ist so hoch, dass mehr als 99% der Stoßwellen reflektiert zu werden! Wir haben daher ein Modell entwickelt, das im Wesentlichen aus einem Plexiglas-Behälter gebaut, die die Wellen im Wasser nach dem Passieren der Zellkultur ausbreiten kann. Dies vermeidet Kavitation Effekte sowie Reflexion der Wellen, die sonst stören würden kündigte. With diesem Modell sind wir in der Lage, in vivo-Bedingungen zu imitieren und dadurch gewinnen mehr und mehr Wissen darüber, wie die physikalischen Reiz von Stoßwellen wird in einer biologischen Zelle Signal ("mechanotransduction") übersetzt.

Einleitung

Stoßwellen sind Schalldruckwellen, die sich aus einer plötzlichen Freisetzung von Energie, zB. wie Donner, wenn der Blitz. In der Medizin Schockwellen sind seit über 30 Jahren in der Lithotripsie für die Behandlung von Nierensteinen eingesetzt. Da die Zufallsbefund Darmbein Verdickung in Lithotripsie Patienten in den frühen 1980er Jahren wurden erste Studien durchgeführt, um die Wirkung der Stoßwellenbehandlung (SWT) auf die Knochenheil ¹ auszuwerten. Beeindruckende Ergebnisse verbessert die Heilung von Röhrenknochen Pseudarthrosen konnte ² beobachtet werden. Anschließend wurden Hinweise auf Weichteilwunden ³ erweitert. Die Grundlagenforschung Ergebnisse zeigten, dass Stoßwellen nicht dazu führen, eine biologische Reiz auf das Zielgewebe ohne Folgeschäden. Freisetzung von angiogenetischen Wachstumsfaktoren (z. B. VEGF, PIGF, FGF) durch deutliche Angiogenese gefolgt. Dies führte zu einem weiteren Ausbau der Beschilderung in Richtung ischämischen Pathologien. Unsere Gruppe und andere zeigten die positive effect von SWT auf ischämische Herzerkrankung im Tiermodell als auch in klinischen Studien ^4-6.

Jedoch der genaue Mechanismus, wie die physikalischen Stimulus von SWT in ein biologisches Signal (mechanotransduction) übersetzt weitgehend unbekannt. Da das Interesse in SWT aus verschiedenen Bereichen der Medizin kontinuierlich zunimmt, ist die Suche nach dem Mechanismus immer mehr und intensiver. Daher werden in vitro Experimente Schockwelle an Bedeutung. Neben der Reduktion von Tierversuchen und Wirtschaftlichkeit kann der größte Vorteil von In-vitro-Stoßwellenbehandlung (IVSWT) die Möglichkeit, das Studium der spezifische Verhalten eines bestimmten Zelltyp sein. In Stoßwellen vermittelten Geweberegeneration wahrscheinlich alle Zellen des behandelten Gewebes beteiligt sind, auch systemische Effekte werden diskutiert. Dennoch spielt jeder Zelltyp eine spezifische Rolle und hat seine eigene innere Funktion. IVSWT ermöglicht es uns, diese spezielle Funktion ein Erfassungsnd gibt uns dadurch ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden komplexen Prozessen.

Das heutige Wissen über die Wirkung der Stoßwellen auf Zellkulturen umfasst die Zunahme der Verbreitung, Veränderung der Zellmembran-Rezeptoren, die Erhöhung und Beschleunigung der Zelldifferenzierung, die Freisetzung von Wachstumsfaktoren und chemo Lockstoffe sowie erhöhte Zellmigration ^7-9.

Störende physikalische Effekte in den meisten in-vitro-Modelle sind verschiedene Verfahren zur Anwendung von Stoßwellen auf Zellkulturen beschrieben. Diese Tatsache führt zu dem Problem, dass es sehr schwierig ist, Ergebnisse zu vergleichen, als physikalische Bedingungen des Zellstimulation sehr unterschiedlich zwischen diesen Modellen sind. In der Regel konzentrieren sich alle bestehenden Modelle für die Schockwellen auf Zellen besten anzuwenden.

Allerdings bleibt die Frage: Was passiert mit den Wellen nach dem Passieren der Zellkultur? Das Hauptproblem ist, dass die Differenz der akustischenImpedanz des Zellkulturmediums und der Umgebungsluft ist so hoch, dass mehr als 99% der Stoßwellen reflektiert zu werden 1.

Aufgrund der Differenz in der akustischen Impedanz der beiden Medien die Wellen nicht nur reflektiert, sondern eine Phasenverschiebung von 180 ° auf, was zu starken Zugkräfte auf die Zellen Fig. 2 beschrieben.

Akustische Impedanz als das Produkt aus der Dichte des Materials und seiner Schallgeschwindigkeit Z = ρ x C definiert. Wasser für die akustische Impedanz ZWater = 1.440.000 Ns / m ³ für Luft ist es nur 420 Ns / m ^3. Die große Differenz der beiden Werte ergibt sich Reflexion und die Phasenverschiebung von Stoßwellen. Die Phasenverschiebung stellt sich eine positive Druckimpuls in eine Zug-Welle.

Auch wenn diese Zugkraft ist nicht schädlich für die Zellen, stört es mit der Idee der Nachahmung in vivo Stoßwelleneffekte in vitro. In vivo dieseZugkräfte kaum durch große Körperstrukturen auftreten.

Darüber hinaus kann die Rücklaufwellen stören auch die ankommenden Einsen. Dies kann Störungen verursachen. Zwei Arten von Störungen sind bekannt. Konstruktive Interferenz bedeutet, dass beide Wellen aufgenommen wodurch sich verdoppelt Amplitude Abbildung 3. Destruktive Interferenz tritt auf, wenn Wellen treffen diametral entgegengesetzt. Es verursacht Abschaffung der Wellen (3). Daher muss IVSWT ein Modell, das Schockwellen ermöglicht, nach dem Passieren der Zellkultur vermehren.

IVSWT Wasserbad

Überlegungen im Anschluss an die oben genannten Bedenken führen uns zu einer Wasser-Bad-Design zur Vermeidung der beschriebenen Probleme Abbildung 4. Grundsätzlich besteht es aus einem Plexiglas-Behälter gebaut mit einer Membran, jede Art von Stoßwellenapplikator verbinden. Zur Kopplung zwischen dieser Membran und der Applikator Ultraschallübertragung gel zu verwenden. Das Wasserbad wird mit entgastem Wasser gefüllt ist, um Kavitation, die auftreten würde, wenn Gas in dem Wasser gelösten vermeiden. Eine Heizvorrichtung am Boden mit einem Temperatursensor mit einer Steuereinheit verbunden ermöglicht Temperatur Nachahmung in vivo-Bedingungen zu regulieren und Zellkulturen zu vermeiden, um sich während des Verfahrens zu kühlen. Die Temperatur kann bei 37 Grad Celsius stabil gehalten werden, wie es in einem Inkubator getan. Ein Halter für die Zellproben können zum Eintauchen jede Art von Kulturkolben oder Röhrchen. Dabei muss das Probengefäß vollständig mit Kulturmedium gefüllt werden, wie Luftblasen würde Schockwellen blockieren! Eine keilförmige Absorber an der Rückwand des Bades selbst zerstört Wellen um nicht reflektiert und laufen zurück um Störungen zu vermeiden bekommen.

Ein weiterer Vorteil gegenüber anderen IVSWT Modelle ist die Möglichkeit der Änderung des Abstandes zwischen dem Applikator und den Kulturflaschen. Die Ergebnisse unserer Gruppe und andere, die verwenden dieses Modell eindeutig swie, dass jeder Zelltyp reagiert sehr spezifisch auf verschiedene Behandlungsparameter. Außerdem ist entscheidend definiert den Abstand zwischen der Quelle der Wellen und der Probe ermöglicht es, die Zellen zu steuern, um an einer bestimmten Position in Bezug auf den Schwerpunkt der Stoßwellenapplikator sein.

Protokoll

Ethische Genehmigung

Nach Einholung schriftlicher Einwilligung der Patienten wurden aus Nabelschnüren Kaiserschnitt in der Abteilung für Frauenheilkunde für die Isolierung von menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) erhalten. Die Erlaubnis wurde von der Ethikkommission der Medizinischen Universität Innsbruck (Nr. UN4435) gegeben.

1. Vorbereiten des IVSWT Wasserbad

1. Planen 3,5 l Leitungswasser in einem geeigneten Behälter. Wasser muss auf 37 ° C erhitzt werden (siehe Protokoll Nr. 6).
2. Füllen Sie das Wasser in das Wasserbad, bis der Wasserstand ca. 3 cm unter den Rand. Wohlgemerkt, um die Membran vollständig mit Wasser zu bedecken. Dies wird etwa die vorbereitete 3,5 L. erfordern
3. Verbinden des Temperatursensors mit der Stromversorgung.
4. Setzen Sie den Sensor in die vorgesehene Anschluss an der Rückwand des Wasserbades.
5. Verbinden Erhitzen auf Stromversorgung des Temperatursensors. Tun Sie dies nicht tun, ohneWasser in der Badewanne, wie die Heizung würde das Plexiglas schmelzen.
6. Warten bis das Wasser eine stabile Temperatur von 37 ° C erreicht hat Rühren Sie das Wasser regelmäßig mit irgendeiner Art von Stick auf konstante Temperatur während des Wasserbades zu gewährleisten.

2. Bereiten Zellen und Kulturflaschen

1. Samenzellen über Nacht bei gewünschten Dichte in T25 Kulturflaschen oder Kultur werden die Zellen direkt in den Kolben, bis sie die gewünschte Konfluenz erreicht haben.
2. Vor dem Experiment, richten Sie die Flaschen senkrecht.
3. Füllen Sie die Kulturflaschen mit Kulturmedium, bis direkt unter den Hals. Nicht zu viel Medium in die Kolben als Medium in Kontakt, um den Hals oder der Verschlusskappe füllen würde nicht kontaminiert werden.
4. Schrauben Sie die Flaschen mit festen Kappen ohne Filter, um eine Kontamination von Wasser zu verhindern. Dagegen, dass das Wasser in dem Bad und das Bad selbst nicht steril sind.
5. Verschließen Sie die Kappen mit Parafilm vor dem Einsetzen in das Wasserbad.
6. Fix verschlossenen Kulturflaschen in der vorgesehenen Ständer.
7. Legen Sie fest Kolben in ein Wasserbad. Darauf achten, dass die Mitte der Zellkulturflasche ist auf der gleichen Höhe wie die Mitte der Stoßwellenapplikator Membran. Eine Linie, an der Seite des Bades führt Sie.

3. Behandlungsparameter definieren

1. Abstand zwischen Stoßwellenquelle und der Probe bestimmen. Identifizieren perfekte Behandlungsparameter, indem die Parameter Befund Pilotversuch, wie in Abbildung 6 beschrieben.
2. Wählen Sie die richtigen Behandlungsparameter (Energieflussdichte, Frequenz) auf dem Stoßwellengerät. Auch hier beziehen sich auf die 6.

4. Shock Wave Anwendungs

1. Setzen viele Mengen von im Handel erhältlichen Ultraschallübertragungs Gel auf der Stoßwellenapplikator als auch auf der Membran des Wasserbades. Dies ist, um die Kopplung zu sichern. Keine Luft oder Luftblasen zwischen dem Applikator und der Membran seines würde Schockwellen zu absorbieren.
2. Schließen Applikator an der Membran und halten Sie es in der Mitte der Membran stabil. Achten Sie darauf, dass sie horizontal ausgerichtet.
3. Sicherstellen, dass die korrekte vertikale Position der Sonde innerhalb des Wasserbades im Einklang mit der angegebenen Markierung an der Seite des Bades ist.
4. Halten Zentren des Applikators und des Kolbens stabil in einer horizontalen Linie.
5. Aktivierung der Stoßwellen-Vorrichtung und Anwendung der Impulse, während die Kulturflasche sowie den Applikator in einer stabilen Position während des gesamten Verfahrens.

5. Nach Behandlung

1. Nehmen Sie die Kulturkolben aus dem Wasserbad.
2. Trocknen Sie es mit gemeinsamen Papierhandtücher.
3. Wischen Sie die Flasche genau mit Desinfektionsmittel.
4. Parafilm entfernen Dicht und Mütze.
5. Pipettieren Sie die Medium in den Kolben in Zentrifugenröhrchen.
6. Zentrifugieren Sie entsprechend. Zentrifugieren Parameter sind abhängig von der verwendeten Zelltyp, ZB. für HUVECs, verwenden Sie 290 g bei Raumtemperatur.
7. Hinzufügen von 5 ml Zellkulturmedium in den Kolben. Resuspendieren des Zellpellets zentrifugiert, mit 2 ml Zellkulturmedium. Pipettieren Sie die Suspension in den Messkolben. So müssen Zellfragmente oder Zellen, die während der Behandlung abgenommen worden sind, können nicht verloren gehen.

Fallstricke

1. Herstellung, wie auch die Behandlung sollte unter sterilen Bedingungen in laminarer Strömung durchgeführt, um eine Kontamination der Zellkultur verhindern.
2. Gute Zellkultur Praxis wird empfohlen, um eine Kontamination der Proben zu vermeiden. Insbesondere Desinfektion von der Außenseite der Flaschen ist stark, bevor sie sie wieder in den Inkubator zu empfehlen. Das Wasserbad, als auch das Wasser im Inneren, ist nicht steril!
3. Sie den Ofen an die Stromversorgung anschließen, es sei denn das Wasserbad wird mit Wasser gefüllt, um eine Beschädigung der Plexiglas gebaut Bad zu vermeiden.
4. Verwenden Sie großzügige Mengen von Ultraschall-Gel auf die Schockwelle appleige, um eine ordnungsgemäße Kupplung und Wellenausbreitung in das Bad zu garantieren. Air und auch kleine Luftblasen zu tun absorbieren Stoßwellen!
5. Lage der Sonden in dem Wasserbad in Bezug auf den Applikator auf die Behandlung des gesamten Wachstumsbereich zu gewährleisten.
6. Sonden zu tief in das Wasser tauchen Sie nicht, um eine Kontamination zu vermeiden.

Ergebnisse

Mit dem beschriebenen Verfahren angewendet wir Schockwellen der menschlichen Nabelschnur-Endothelzellen (HUVECs), die wir zuvor aus der Nabelschnur isoliert. Nabelschnüre wurden von elektiven Kaiserschnitte erhalten.

HUVECs wurden bei einem Zusammenfluss von 90% in einer T25-Zellkulturflasche mit einer elektrohydraulischen Stoßwellentherapiesystem behandelt. Behandlungsparameter waren eine Energieflussdichte von 0,1 mJ / mm ² und einer Frequenz von 5 Hz ist. 300 Impulse wurden a...

Diskussion

Die Bedeutung der vorgeschlagenen Modell zur in-vitro Stoßwellenbehandlung ist die Tatsache, dass die Wellen kann nach dem Passieren der Zellkultur im Gegensatz zu existierenden Modellen ausbreiten. Dadurch können störende physikalische Effekte wie Zugkräfte vermieden werden. Das Modell ähnelt mehr in vivo-Bedingungen als die von anderen Anwendung direkt Wellen, ihre Zellkulturflaschen.

Ein zusätzlicher Vorteil ist die Möglichkeit der Änderung des Abstandes zwischen...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Orthogold shock wave device	Tissue Regeneration Technologies, Woodstock, GA – manufactured by MTS-Europe GmbH, Konstanz, Germany
IVSWT Water Bath V2.0	Johann Hohenegger - Technical Products
EBM-2 Basal Medium 500 m +EGM-2 SingleQuot Suppl. & Growth Factors	Lonza	CC-3156 & CC-4176	This medium was used for the shown experiments with HUVECs to fill the cell culture flask. For other cell types, use the recommended medium.
Pechiney Parafilm M PM996	Pechiney Plastic Packaging	PH-LF-PM996-EA at labplanet.com	for sealing flasks
Falcon Serological pipettes 25 ml	Becton Dickinson Labware	357525
CellMate II Serological Pipette	Matrix Technologies
Skintact Ultrasonic Gel	Skintact	UL-01 250 ml
T25 Cell culture flasks	COSTAR	3056
Mikrozid disinfectant	Schülke
3.5 L Degassed water
Paper towels