Choque aplicação de ondas de culturas de células

Resumo

As ondas de choque nos dias de hoje são bem conhecidos por seus efeitos regenerativos. Portanto experimentos in vitro são de interesse crescente. Por isso, desenvolvemos um modelo in vitro para estudos de ondas de choque (IVSWT) que nos permite simular as condições in vivo, evitando assim efeitos físicos distracção.

Resumo

As ondas de choque nos dias de hoje são bem conhecidos por seus efeitos regenerativos. Resultados da investigação básica mostrou que as ondas de choque causam um estímulo biológico para atingir as células ou tecidos, sem qualquer dano subseqüente. Portanto, experimentos in vitro são de interesse crescente. Vários métodos de aplicação de ondas de choque em culturas de células têm sido descritos. Em geral, todos os modelos existentes se concentrar em como melhor aplicar ondas de choque em células.

No entanto, esta questão permanece: O que acontece com as ondas depois de passar a cultura de células? A diferença da impedância acústica do meio de cultura de células e o ar ambiente é tão elevada, que mais do que 99% de ondas de choque se reflete! Assim, desenvolvemos um modelo que consiste principalmente de um recipiente construído de Plexiglas que permite que as ondas se propagam para dentro da água, depois de passar a cultura de células. Isto evita o efeito de cavitação, bem como a reflexão das ondas que, de outra forma perturbam os próximos. Wiª este modelo somos capazes de imitar as condições in vivo e, assim, ganhar mais e mais conhecimento sobre como o estímulo físico de ondas de choque é traduzido em um sinal célula biológica ("mechanotransduction").

Introdução

As ondas de choque são ondas de pressão sonora decorrentes de uma liberação repentina de energia, por exemplo. como o trovão quando um raio. Na medicina ondas de choque têm sido utilizados por mais de 30 anos de Litotripsia para a desintegração de pedras nos rins. Uma vez que o achado incidental de ilíaca espessamento óssea em pacientes Litotripsia no início de 1980, os primeiros estudos foram realizados para avaliar o efeito do tratamento por ondas de choque (SWT) no osso cura ^1. Resultados impressionantes de melhoria da cura de pseudartroses de ossos longos pode ser observada ^2. Subsequentemente, as indicações foram expandidos para feridas de tecidos moles ^3. Resultados básicos de pesquisa mostrou que as ondas de choque que causam um estímulo biológico para o tecido-alvo, sem qualquer dano subsequente. A libertação de factores de crescimento angiogénicos (por exemplo, VEGF, PlGF, FGF) é seguido por angiogénese significativa. Isto levou a uma maior expansão de indicações para patologias isquêmicos. Nosso grupo e outros mostraram o eff positivoect de SWT na doença isquêmica do coração em modelos animais, bem como em ensaios clínicos ^4-6.

No entanto, o mecanismo exato de como o estímulo físico do SWT é traduzido em um sinal biológico (mechanotransduction) permanece em grande parte desconhecido. Como o interesse em SWT a partir de vários campos da medicina aumenta continuamente, a busca para o mecanismo está ficando mais e mais intensa. Portanto, experimentos in vitro onda de choque estão ganhando importância. Além da redução de experimentos com animais e relação custo-eficácia, a maior vantagem do tratamento in vitro por ondas de choque (IVSWT) pode ser a possibilidade de estudar o comportamento específico de um determinado tipo de célula. Em ondas de choque regeneração de tecidos mediada provavelmente todas as células do tecido tratado está envolvida, mesmo os efeitos sistémicos são discutidos. No entanto, cada tipo de célula tem um papel específico e tem a sua própria função intrínseca. IVSWT nos permite detectar esta função especial, umand assim nos dá uma melhor compreensão dos processos subjacentes complexas.

Conhecimentos actuais sobre os efeitos da onda de choque em culturas de células inclui o aumento da proliferação, transformação de receptores da membrana celular, aumento e aceleração da diferenciação das células, a libertação de factores de crescimento e quimio-atractivos, bem como o aumento da migração de células de ^7-9.

Efeitos físicos de distracção em mais em modelos in vitro de vários métodos de aplicação de ondas de choque em culturas de células têm sido descritos. Este facto leva ao problema de que é muito difícil de comparar os resultados, como as condições físicas da estimulação de células são muito diferentes entre estes modelos. Em geral, todos os modelos existentes se concentrar em como melhor aplicar ondas de choque em células.

No entanto, esta questão permanece: O que acontece com as ondas depois de passar a cultura de células? O principal problema é que a diferença de o acústicoimpedância do meio de cultura de células e o ar ambiente é tão elevada, que mais do que 99% de ondas de choque se Figura 1 reflectida.

Devido à diferença de impedância acústica dos dois meios as ondas são reflectidas mas não só um deslocamento de fase de 180 ° ocorre resultando em fortes forças de tracção para as células a Figura 2.

Impedância acústica é definido como o produto da densidade de um material e a sua velocidade do som Z = ρ x c. Para a água a impedância acústica é ZWater = 1440000 Ns / m ^3, para o ar é apenas 420 Ns / m ^3. A grande diferença desses dois valores resulta em reflexão e mudança de fase de ondas de choque. O deslocamento de fase transforma um impulso de pressão positiva para uma onda de tracção.

Mesmo que essa força de tração não é prejudicial para as células, que interfere com a idéia de imitar em efeitos in vivo de ondas de choque, in vitro. In vivo estesas forças de tracção dificilmente ocorrem devido a grandes estruturas do corpo.

Além disso, a parte de trás correndo ondas pode até incomodar os que chegam. Isso pode causar interferência. Dois tipos de interferência são conhecidos. Interferência construtiva significa que ambas as ondas são adicionadas, assim, resultando em dobro amplitude Figura 3. Interferência destrutiva ocorre se ondas se encontram diametralmente opostas. Ela provoca abolição de ondas (Figura 3). Portanto, IVSWT precisa de um modelo que permite que as ondas de choque que se propagam após a passagem da cultura de células.

Banho de água IVSWT

Considerações seguintes as preocupações mencionadas acima nos levam a projetar um banho de água para evitar os problemas descritos Figura 4. Basicamente, ele consiste em um recipiente de acrílico construído com uma membrana para conectar todo tipo de aplicador de onda de choque. Para o acoplamento entre essa membrana e a transmissão aplicador de ultra-som gel tem de ser usado. O banho de água é cheio com água desgaseificada, para evitar a cavitação que poderia ocorrer se o gás se dissolva na água. Um aquecedor na parte inferior com um sensor de temperatura ligado a uma unidade de controlo permite regular a temperatura para a imitação de condições in vivo e culturas de células, para evitar a arrefecer durante o procedimento. A temperatura pode ser mantida estável a 37 graus centígrados, como é feito em uma incubadora. Um suporte para as amostras de células permite a imersão de qualquer tipo de frasco de cultura ou do tubo. Desse modo, o recipiente da amostra tem de ser completamente cheio com o meio de cultura, como bolhas de ar iria bloquear ondas de choque! Um absorvedor em forma de cunha para a parede traseira da banheira destructs ondas, a fim de não se correr e reflectida de volta, para evitar a interferência.

Uma vantagem adicional para outros modelos IVSWT é a possibilidade de variar a distância entre o aplicador e dos frascos de cultura. Apreciação do nosso grupo e outros que usam este modelo é claramentecomo que cada tipo de célula reage muito especificamente a diferentes parâmetros de tratamento. Além disso, a definição da distância entre a fonte de ondas e a amostra é crucial, uma vez que permite controlar as células a ser numa posição específica em relação ao foco do aplicador de ondas de choque.

Protocolo

Permissão de Ética

Após a obtenção do consentimento livre e esclarecido dos pacientes, cordões umbilicais foram obtidos a partir de cesariana no Departamento de Ginecologia para o isolamento de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC). A permissão foi dada a partir do comitê de ética da Universidade de Medicina de Innsbruck (no. UN4435).

1. Prepare o IVSWT Água Bath

1. Prepare 3,5 L de água da torneira em um tanque apropriado. A água deve ser aquecida a 37 ° C (ver o Protocolo 6).
2. Encher a água para o banho de água até que o nível da água é de aproximadamente 3 cm abaixo da borda. Mente para cobrir completamente a membrana com água. Isto vai exigir a aproximadamente 3,5 L. preparado
3. Ligue o sensor de temperatura para a fonte de alimentação.
4. Colocar o sensor dentro da instalação destinada à parede traseira da água do banho.
5. Ligue o aquecimento a fonte de alimentação do sensor de temperatura. Não faça isso semágua no banho como o aquecedor poderia fundir o Plexiglas.
6. Espere até que a água tenha atingido uma temperatura estável de 37 ° C. Agita-se a água regularmente com algum tipo de vara para garantir uma temperatura constante em todo o banho de água.

2. Prepare Células e frascos de cultura

1. Células de sementes durante a noite com densidade desejada em frascos de cultura T25 ou cultura as células em frascos diretamente até que tenham atingido a confluência desejada.
2. Antes do experimento, alinhe os frascos na vertical.
3. Encha os frascos de cultura com meio de cultura até logo abaixo do pescoço. Não encha demais médio em balões como meio de contato para o pescoço ou a tampa de fechamento iria ficar contaminada.
4. Aperte os frascos com capacitores sólidos sem filtros para evitar a contaminação da água. Mente que a água no banho e o banho em si não são estéreis.
5. Selar as tampas com Parafilm antes da inserção no banho-maria.
6. Fix frascos de cultura fechados no suporte fornecido.
7. Insira frasco fixo na água do banho. Ter cuidado para que o meio do frasco de cultura de células é na mesma altura que o centro da membrana da onda de choque do aplicador. A fila do lado da banheira o orienta.

3. Definir Tratamento Parâmetros

1. Defina a distância entre a fonte de ondas de choque e amostra. Identificar os parâmetros de tratamento perfeitos através da realização da experiência piloto parâmetro achado como descrito na Figura 6.
2. Escolha os parâmetros de tratamento de certas (densidade de fluxo de energia, frequência) no dispositivo de onda de choque. Mais uma vez, consulte a Figura 6.

4. Choque aplicação de ondas

1. Coloque quantidades abundância de gel disponível no mercado de transmissão de ultra-som sobre a onda de choque do aplicador, bem como sobre a membrana do banho-maria. Isto é para assegurar o acoplamento. Não há bolhas de ar ou de ar deve estar entre o aplicador e a membrana quantoseria absorver as ondas de choque.
2. Ligue aplicador para a membrana e segurá-lo estável no centro da membrana. Tome cuidado para que ela esteja alinhada horizontalmente.
3. Certifique-se de que a posição vertical correcta da sonda no interior do banho de água é, de acordo com o indicado na marcação do lado da casa de banho.
4. Segurar centros do aplicador e o balão estável numa linha horizontal.
5. Activar o aparelho de ondas de choque e aplicar os impulsos, mantendo o frasco de cultura, bem como o aplicador numa posição estável durante todo o procedimento.

5. Depois do Tratamento

1. Pegue a garrafa de cultura do banho de água.
2. Seque-o com toalhas de papel comuns.
3. Limpe o frasco de forma precisa com os agentes de desinfecção.
4. Remover Parafilm vedação e tampa.
5. Pipetar a média dentro dos frascos em tubos centrífugos.
6. Centrifugar adequadamente. Parâmetros centrifugação dependerá do tipo de célula utilizada, Por ex. para HUVECs, utilizar 290 g à temperatura ambiente.
7. Adicionar 5 ml de meio de cultura de células para o balão. Ressuspender o sedimento de células centrifugadas com 2 ml de meio de cultura celular. Pipetar a suspensão para dentro do frasco. Assim, fragmentos de células ou células que podem ter sido isoladas durante o tratamento não se percam.

Armadilhas

1. Preparação, bem como o tratamento deve ser realizado sob condições estéreis para dentro de fluxo laminar, para evitar a contaminação da cultura de células.
2. Boas práticas de cultura de células é recomendada para evitar a contaminação das sondas. Em particular, a desinfecção da parte exterior dos frascos é fortemente recomendado antes de colocá-los para trás para a incubadora. O banho de água, bem como o interior da água, não é estéril!
3. Não ligar o aquecedor para o fornecimento de energia a não ser que o banho de água é enchido com água a fim de evitar danos para as Plexiglas construídos banho.
4. Use uma quantidade generosa de gel de ultra-som no appl onda de choqueicator para garantir acoplamento adequado e de propagação da onda no banho. Ar e até mesmo pequenas bolhas de ar absorvem as ondas de choque!
5. Verificar a posição das sondas no interior do banho de água em relação ao aplicador de garantir um tratamento de toda a área de crescimento.
6. Não mergulhe sondas muito profundo dentro da água para evitar a contaminação.

Resultados

Usando o método descrito foi aplicado ondas de choque às células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) que dantes isolado a partir de cordão umbilical. Cordões umbilicais foram obtidos a partir de cesarianas eletivas.

HUVECs foram tratados em uma confluência de 90% em um frasco de cultura de células T25 com um sistema de terapia de ondas de choque eletro-hidráulico. Parâmetros de tratamento eram uma densidade de fluxo de energia de 0,1 mJ / mm ² e uma freqüência ...

Discussão

A significância do modelo proposto para tratamento in vitro da onda de choque é o facto de que as ondas possam propagar depois de passar a cultura de células em contraste com os modelos actuais. Desse modo, os efeitos físicos perturbadoras tais como as forças de tracção pode ser evitada. O modelo se assemelha mais de perto as condições in vivo do que por outros aplicando ondas para os seus frascos de cultura de célula diretamente.

Uma vantagem adicional é a possi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Orthogold shock wave device	Tissue Regeneration Technologies, Woodstock, GA – manufactured by MTS-Europe GmbH, Konstanz, Germany
IVSWT Water Bath V2.0	Johann Hohenegger - Technical Products
EBM-2 Basal Medium 500 m +EGM-2 SingleQuot Suppl. & Growth Factors	Lonza	CC-3156 & CC-4176	This medium was used for the shown experiments with HUVECs to fill the cell culture flask. For other cell types, use the recommended medium.
Pechiney Parafilm M PM996	Pechiney Plastic Packaging	PH-LF-PM996-EA at labplanet.com	for sealing flasks
Falcon Serological pipettes 25 ml	Becton Dickinson Labware	357525
CellMate II Serological Pipette	Matrix Technologies
Skintact Ultrasonic Gel	Skintact	UL-01 250 ml
T25 Cell culture flasks	COSTAR	3056
Mikrozid disinfectant	Schülke
3.5 L Degassed water
Paper towels