冲击波应用细胞培养

摘要

冲击波现在是众所周知的再生效果。因此， 在体外实验中面临着越来越大的兴趣。因此，我们开发了一个模型体外冲击波试验（IVSWT），使我们能够在体内条件，从而避免分散注意力的物理效应模拟。

摘要

冲击波现在是众所周知的再生效果。基础研究的成果表明，冲击波也引起生物刺激靶细胞或组织没有任何后续的损害。因此， 在体外实验中面临着越来越大的兴趣。施加冲击波到细胞培养物中的各种方法进行了描述。一般来说，所有现有车型集中在如何最好地运用冲击波到细胞。

但是，这个问题仍然是:通过细胞培养后发生了什么浪？细胞培养基中的声阻抗与空气的区别在于高，即99％以上的冲击波被反射！因此，我们开发了一个模型，主要由树脂玻璃建造的集装箱，使波通过细胞培养后，在水中传播的。这就避免了空化效应，以及，否则将扰乱即将到来的那些波的反射。无线日这个模型，我们能够模拟体内条件，从而获得关于如何冲击波的物理刺激被转换为生物细胞信号（"机械传导"）越来越多的知识。

引言

冲击波是从能源， 如突然释放所产生的声压波。如打雷时，闪电。在医学上的冲击波已经使用了30多年的碎石治疗肾结石的解体。由于骨骼增厚偶然发现在碎石患者在20世纪80年代初，第一次进行了研究，以评估骨愈合¹冲击波治疗（SWT）的效果。长骨骨不连愈合改善令人印象深刻的结果可以观察到^2。随后，适应症扩大到软组织伤口^3。基础研究的成果表明，冲击波也引起生物刺激靶组织没有任何后续的损害。的血管生长因子（VEGF 例如 ，的PlGF，FGF）发行其次是显著的血管生成。这导致适应症对缺血性病变进一步扩大。本集团与其他人表现的积极EFF抽搐SWT对缺血性心脏疾病的动物模型中以及在临床试验^4-6。

然而，如何SWT的物理刺激被翻译成的生物信号（机械传导）的确切机制仍然知之甚少。从医学不断增加几个字段在SWT的利益，追求的机制越来越激烈。因此， 体外冲击波实验是越来越重要。除了 ​​减少的动物实验和成本效益， 体外冲击波治疗（IVSWT）的最大优势可能是学习某一细胞类型的特定行为的可能性。在冲击波介导的组织再生最有可能被治疗组织的所有细胞都参与其中，甚至全身作用进行了讨论。然而，不同的细胞类型中起着特殊的作用，有其自身固有的功能。 IVSWT使我们能够检测到这种特殊功能的ND从而使我们更好地理解复杂的基本流程。

今天的关于细胞培养冲击波的影响的认识，包括增加增殖，改变细胞膜受体，增加和细胞分化的加速，生长因子和化学引诱剂释放以及增加细胞迁移^7-9。

在体外模型施加冲击波到细胞培养物中的各种方法中最令人分心的物理效应进行了描述。这一事实导致了它是非常难以比较的结果，如细胞刺激身体条件这些模型之间完全不同的问题。一般来说，所有现有车型集中在如何最好地运用冲击波到细胞。

但是，这个问题仍然是:通过细胞培养后发生了什么浪？主要的问题在于，所述声的差细胞培养基和环境空气的阻抗是高的，即99％以上的冲击波被反射图1。

由于在两种介质的声阻抗的差异波不仅反映但相移为180°时产生强的拉力向细胞图2。

声阻抗被定义为材料的密度和它的产品声速Z =ρX C。对于水的声阻抗是ZWater = 1440000 Ns个/ m ³时，对空气，只有420纳秒/米^3。这两个值的巨大差异导致了冲击波的反射和相移。相移变成正压脉冲成拉伸波。

即使这样的拉伸力是不会伤害到细胞内，它干扰了模仿在体外体内冲击波影响的想法。 体内这些拉力很难由于大身体结构发生。

此外，行波后面甚至可以打扰传入的。这可能会引起干扰。两种类型的干扰是已知的。建设性的干扰是指两个波被添加，从而导致了一倍振幅图3。如果波相遇截然相反的发生破坏性干扰。它会导致波的取消（ 图3）。因此，IVSWT需要一个模型，使冲击波通过细胞培养后进行传播。

IVSWT水浴

按照上面提到的顾虑考虑导致我们设计的水浴中，以避免所描述的问题的图4。基本上，它包括一个有机玻璃的内置容器用膜来连接各种冲击波施加器。对于这种膜和涂敷超声传输格之间的耦合升已被使用。水浴填充脱气的水，以避免气蚀，如果气体中的水固溶会发生的。加热器在底部有温度传感器连接到控制单元使得能够调节温度为模仿体内条件和避免细胞培养的过程中，以进行冷却。温度可维持在37℃以下，因为它是在培养箱中进行。为细胞样品持有人允许任何浸入一种文化烧瓶或试管的。由此，试样容器需要被完全装满培养基，因为气泡会阻止冲击波！甲楔形吸收体在沐浴的后壁解构，为了不被反射并运行回，以避免干扰波。

进一步的优点与其他IVSWT模型是不同的涂抹器和培养瓶之间的距离的可能性。谁使用这种模式显然是我们小组的研究结果和其他怎么每个细胞类型的反应非常明确不同的治疗参数。此外，限定了波的源和样品之间的距离是至关重要的，因为它使我们能够控制细胞是在相对于冲击波施加器的焦点的特定位置。

研究方案

道德许可

取得患者的书面知情同意书后，脐带从在妇产科学系剖腹产的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中分离获得。权限是从因斯布鲁克医科大学（编号:UN4435）伦理委员会给出。

1，准备IVSWT水浴

1. 制备3.5升的自来水在适当的容器。水需要被加热到37°C（见协议6）。
2. 水填充入水浴，直到水位大约为3厘米以下的优势。心灵完全覆盖水的膜。这将需要大约准备3.5 L。
3. 将温度传感器连接到电源。
4. 把传感器放到预期的拟合置水浴上的后墙。
5. 连接加热至温度传感器的电源。没有不要这样做水在浴中的加热器将熔融树脂玻璃。
6. 等到水温达到37°C的温度稳定与某种棍定期搅水，以保证整个水浴恒温。

2，准备和细胞培养瓶

1. 种子细胞在晚上直接，直到他们达到所需的汇合在T25培养瓶或培养的细胞在培养瓶所需的密度。
2. 在实验前，垂直对齐的烧瓶中。
3. 填补了培养瓶用培养液，直到下方脖子。不要填写太多的介质进入接触到颈部或封闭盖的瓶为介质将受到污染。
4. 用螺丝固上限瓶无过滤器，以防止污染的水。记住，水在浴室和浴缸本身不是无菌的。
5. 插入水中洗澡前用封口膜密封的瓶盖。
<李>修复密封培养瓶在所提供的立场。
6. 将固定烧瓶放入水浴中。注意使细胞培养烧瓶的中间是在同一高度上的冲击波施加器的膜的中央。 A线在洗澡的侧面引导你。

3，定义处理参数

1. 定义冲击波源和样品之间的距离。通过进行该参数的发现导频实验如在图6中所述确定理想的治疗参数。
2. 选择冲击波设备上正确的治疗参数（能量密度，频率）。再次，参考图6。

4，冲击波的应用

1. 把市售的超声波传输胶量充足的冲击波敷贴以及置水浴上的膜。这是为了保证耦合。没有空气或气泡应该施加器和膜之间的它会吸收冲击波。
2. 连接敷贴到膜上，并保持稳定的膜的中央。请注意，这是水平对齐。
3. 确保水浴内探头的正确的垂直位置与所述指示标记在恒温槽的侧线。
4. 保持在一个水平行中的敷贴器，将烧瓶稳定的中心。
5. 激活冲击波装置和应用该脉冲，同时保持培养瓶中，以及在整个手术过程中稳定的位置的敷贴。

5，治疗后

1. 就拿培养瓶中出来的水洗澡。
2. 与普通纸巾擦干。
3. 准确地擦拭量瓶中，用消毒剂。
4. 除去封口膜密封帽。
5. 吸管中的烧瓶内到离心管中。
6. 离心机适当。离心参数取决于所用的细胞类型， 如。对脐静脉内皮细胞，用290克在室温下。
7. 加细胞培养基5ml的烧瓶中。重悬离心细胞沉淀用2ml细胞培养基。移液器的悬浮液加入到烧瓶中。因此，可能在治疗过程中已脱落细胞碎片或细胞不迷路。

陷阱

1. 制剂以及治疗应进行层流内的无菌条件下，以避免细胞培养物污染。
2. 良好的细胞培养实践建议，以避免探针的污染。特别是瓶外的消毒，强烈建议把他们带回孵化器之前。水浴，以及里面的水，是没有出息！
3. 不要将加热器连接到电源，除非水浴是装满了水，以免损坏内置浴有机玻璃。
4. 使用超声波凝胶的数额慷慨的冲击波APPLicator以保证正确的耦合和波的传播进入浴缸。空气，甚至小气泡做吸收冲击波！
5. 检查水浴相对于敷贴器内的探针的位置，以确保治疗的整个生长区域。
6. 不要扣篮探头插入过深的水，以避免污染。

结果

使用我们应用的冲击波，以人脐静脉内皮细胞所描述的方法（内皮细胞），我们前述隔离脐带。脐带从选修剖腹产获得。

脐静脉内皮细胞均在90％的汇合在一个T25细胞培养瓶中用液电冲击波治疗系统治疗。治疗参数为0.1毫焦耳/ ^平方毫米和5 Hz的频率的能量通量密度。 300冲动被应用从5厘米的冲击波源的距离的细胞层。

的Tie-2的基因表达（免疫球蛋?...

讨论

该模型用于体外冲击波治疗的意义是，波可以通过细胞培养而相比之下，现有的模型后传播。由此，能够避免干扰物质的影响，如拉力。该模型由他人直接涂布波到其细胞培养瓶更接近于体内条件比。

一个附加的优点是不同冲击波源和细胞之间的距离的可能性。这将是不可能的，如果直接处理的培养烧瓶中。然而， 体内存在的涂抹器与目标区域之间的某?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Orthogold shock wave device	Tissue Regeneration Technologies, Woodstock, GA – manufactured by MTS-Europe GmbH, Konstanz, Germany
IVSWT Water Bath V2.0	Johann Hohenegger - Technical Products	-
EBM-2 Basal Medium 500 m +EGM-2 SingleQuot Suppl.&Growth Factors	Lonza	CC-3156 & CC-4176	This medium was used for the shown experiments with HUVECs to fill the cell culture flask. For other cell types, use the recommended medium.
Pechiney Parafilm M PM996	Pechiney Plastic Packaging	PH-LF-PM996-EA at labplanet.com	for sealing flasks
Falcon Serological pipets 25ml	Becton Dickinson Labware	357525
CellMate II Serological Pipette	Matrix Technologies	-
Skintact Ultrasonic Gel	Skintact	UL-01 250 ml
T25 cell culture flasks	COSTAR	3056
mikrozid disinfectant	Schülke	-
3,5l degassed water
paper towels