문화를 셀에 충격파 응용 프로그램

요약

충격파는 요즘 그들의 재생 효과가 알려져있다. 따라서 생체 외 실험은 증가 관심입니다. 따라서 우리는 이에 산만 물리 효과를 방지 생체 내 조건에서 모방하기 위해 우리를있게 체외 충격파 시험 (IVSWT)에 대한 모델을 개발했다.

초록

충격파는 요즘 그들의 재생 효과가 알려져있다. 기초 연구 결과는 충격파가 후속 손상없이 세포 나 조직을 대상으로 생물학적 자극을 일으킬 않는 것으로 나타났다. 따라서, 생체 외 실험은 증가하는 관심입니다. 세포 배양에 충격파를 적용하는 다양한 방법이 설명되었다. 일반적으로, 기존의 모든 모델은 최고 세포에 충격파를 적용하는 방법에 초점을 맞 춥니 다.

그러나이 질문은 남아있다 :​​ 어떻게 세포 배양을 통과 한 후 파도는 어떻게됩니까? 세포 배양 배지의 음향 임피던스와 주위 공기의 차이점은 충격파의 99 % 이상을 반사 얻을 높은! 따라서 우리는 주로 파도 세포 배양 물을 통과 한 후, 물에 전파 할 수있는 플렉시 내장 용기로 구성 모델을 개발 하였다. 이것은 캐비테이션 효과뿐만 아니라, 그렇지 않으면 곧 사람을 방해 할 파도의 반사를 방지 할 수 있습니다. 무선이 모델 일을 우리는 생체 조건을 모방하여 충격파의 물리적 자극이 생물학적 세포 신호 ( "mechanotransduction의")로 번역되는 방법에 대한 더 많은 지식을 얻을 수 있습니다.

서문

충격파 에너지, 예를 들어 갑자기 릴리스에서 발생하는 음압 파도입니다. 천둥 번개와 같은 경우. 의학에서는 충격파는 신장 결석의 붕괴에 쇄석술에서 30 년 이상 사용되어왔다. 1980 년대 초 쇄석술 환자 장골 비후 부수적 발견 이후, 첫번째 연구 ^{일 치유} 뼈에 충격파 치료 (SWT)의 효과를 평가하기 위해 실시 하였다. 긴 뼈의 불유합의 개선 치유의 인상적인 결과 ^2를 관찰 할 수있다. 그 후, 표시는 부드러운 조직 상처 ^3으로 확장되었다. 기초 연구 결과는 충격파가 후속 손상없이 표적 조직에 대한 생물학적 자극을 일으킬 않는 것으로 나타났다. 혈관 성장 인자 (예를 들어, VEGF, PlGF, FGF)의 출시는 중요한 혈관옵니다. 이 허혈성 병변으로 표시의 추가 확장되었다. 우리 그룹과 다른 긍정적 인 EFF을 보여 주었다요법 동물 모델에서 허혈성 심장 질환에 SWT뿐만 아니라 임상 시험 ^4-6.

그러나, SWT의 물리적 자극이 생물학적 신호 (mechanotransduction의)로 번역하는 방법의 정확한 메커니즘은 크게 알려지지 않은 남아있다. 지속적으로 약을 증가 여러 분야에서 SWT에 대한 관심으로, 메커니즘에 대한 탐구는 점점 더 강렬을 받고있다. 따라서, 체외 충격파 실험 중요성을 얻고있다. 동물 실험 및 비용 효율성의 감소 외에, 체외 충격파 치료 (IVSWT)의 가장 큰 장점은 특정 세포 유형의 특정 행동을 연구의 가능성 일 수있다. 충격파 매개 조직 재생에서 대부분 처리 된 조직의 모든 세포가 관여하고, 심지어는 조직의 효과에 대해 설명합니다. 그럼에도 불구하고, 각각의 세포 유형은 특정한 역할을하며 자체적 본질적인 기능을 갖는다. IVSWT이 특정 기능을 감지하는 우리를있게ND하여 우리에게 복잡한 내부 프로세스의 더 나은 이해를 제공합니다.

세포 배양에 충격파의 효과에 대한 오늘날의 지식 확산의 증가, 세포막 수용체의 변경, 증가 및 세포 분화 촉진, 성장 인자와 화학 - 유인의 방출 증가뿐만 아니라 세포의 이동 ^7-9를 포함한다.

체외 모델 세포 배양에 충격파를 적용하는 다양한 방법에있는 대부분의주의를 분산시키는 물리적 인 효과를 설명 하였다. 이 사실은 세포 자극의 물리적 조건이 모델 사이에 상당히 다릅니다대로, 결과를 비교하기 위해 매우 어려운 문제로 연결됩니다. 일반적으로, 기존의 모든 모델은 최고 세포에 충격파를 적용하는 방법에 초점을 맞 춥니 다.

그러나이 질문은 남아있다 :​​ 어떻게 세포 배양을 통과 한 후 파도는 어떻게됩니까? 주요 문제는 탄성의 차이세포 배양 배지 및 외기의 임피던스는 충격파의 99 % 이상은도 1을 반영 얻을 그 높다.

때문에 두 매체의 음향 임피던스의 차이에 파도가 반영됩니다 뿐만이 아니라 세포가 그림 2에 180 °의 위상 변화는 강한 인장력의 결과로 발생합니다.

음향 임피던스는 재료의 밀도의 제품 및 음속 Z가 X = ρ C로서 정의된다. 물 음향 임피던스는 공기에만 420 ns의 / m ^3이고, ZWater = 1,440,000 ns의 / m ^3입니다. 이 두 값의 큰 차이는 충격파의 반사와 위상 변화가 발생합니다. 위상 시프트는 인장 파에 정압 펄스를 점등.

이 인장력은 세포에 유해하지 않은 경우에도, 그것은 생체 체외 충격파 효과를 흉내의 아이디어를 방해한다. 생체 이러한인장력이 거의 인해 큰 몸 구조에 발생하지 않습니다.

또한, 파도를 실행하는 다시도 들어오는 사람을 방해 할 수 있습니다. 이 간섭을 일으킬 수 있습니다. 간섭의 두 가지 종류가 알려져있다. 보강 간섭은 모두 파도가되어 두 배 진폭 그림 3의 결과로 추가 된 것을 의미한다. 파도는 정반대을 충족하는 경우 파괴적인 간섭이 발생합니다. 그것은 파도의 폐지 (그림 3)이 발생합니다. 따라서 IVSWT는 세포 배양 물을 통과 한 후 전파하는 충격파를 가능하게하는 모델을 필요로한다.

IVSWT 물 목욕

위에서 언급 한 문제 다음과 같은 고려 사항은 기술 문제는 기본적으로,이 충격파 주걱의 모든 종류를 연결하는 막 용기를 내장 플렉시 글라스로 구성되어 있습니다. 그림 4 피하기위한 물 목욕을 설계하는 우리를 이끌. 이 멤브레인과 어플리케이터 초음파 송신 GE 간의 커플 링내가 사용할 수 있습니다. 수욕은 가스가 물 내 soluted 경우 발생할 것이다 캐비테이션을 피하기 위해 탈기 만수. 제어 유닛에 연결된 온도 센서와 아래쪽 히터 생체 조건 본뜬 대한 온도를 조절하도록하고 절차 중에 식혀 세포 배양을 피할 수있다. 이 인큐베이터에서 수행 될 때 온도는 섭씨 37도에서 안정적으로 유지 될 수있다. 세포 샘플 홀더 문화 플라스크 또는 튜브의 종류를 가라 앉히기 수 있습니다. 이것에 의해, 시료 용기는 기포가 충격파를 차단하는 것처럼 완전 배양 배지로 충전 될 필요! 목욕의 후면 벽에 쐐기 모양의 흡수를 위해 반사 및 간섭을 방지하기 위해 다시 실행 얻을 수없는 파도를 자멸.

다른 IVSWT 모델과 다른 이점은 애플리케이터 및 배양 플라스크 사이의 거리를 변화의 가능성이다. 이 모델은 명확하게들 사용하는 우리 그룹의 연구 결과와 다른모든 세포 유형은 서로 다른 처리 매개 변수를 매우 구체적으로 어떻게 반응하는지있다. 이 충격파 어플리케이터의 포커스 관련된 특정 위치로 셀을 제어하는​​ 우리를있게 더욱이, 파도의 소스와 샘플 사이의 거리를 정의하는 것이 중요하다.

프로토콜

윤리 허가

환자의 서면 동의서를받은 후, 탯줄 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC를)의 분리를위한 산부인과의 부에서 제왕 절개에서 얻을 수 있었다. 권한은 인스 브루 크 의과 대학 (제 UN4435)의 윤리위원회에서 주어졌다.

1. IVSWT 물 목욕에게 준비

1. 적절한 탱크에 수돗물의 3.5 L를 준비합니다. 물 (프로토콜 6 참조) 37 ° C로 가열 할 필요가있다.
2. 수위가 약 3cm 가장자리 아래까지 수조에 물을 채운다. 물에 완전하게 막을 커버하는 마음. 이 약 제조 된 3.5 L.가 필요합니다
3. 전원에 온도 센서를 연결한다.
4. 수욕의 뒷벽에 끼워 맞춤 의도로 센서를 탑재.
5. 온도 센서의 전원 공급 장치에 가열을 연결한다. 하지 않고이 작업을 수행하지 마십시오히터와 목욕 물은 플렉시 유리를 녹여 것이다.
6. 물은 37 ℃의 안정된 온도에 도달 할 때까지 기다립니다 물을 욕조에 걸쳐 일정한 온도를 보장하기 위해 지팡이의 일종으로 정기적으로 물을 저어.

2. 세포와 배양 플라스크를 준비

1. 그들이 원하는 합류에 도달 할 때까지 직접 T25 문화 플라스크 또는 문화 플라스크에 세포에서 원하는 농도에서 밤새 종자 세포.
2. 실험 전에 수직으로 플라스크를 맞 춥니 다.
3. 바로 자신의 목 아래까지 배양 배지와 배양 플라스크를 입력합니다. 오염 된 얻을 것이다 목 또는 폐쇄 캡에 접촉 매체로 플라스크에 너무 많은 매체를 기입하지 마십시오.
4. 물에서 오염을 방지하기 위해 필터없이 단단한 모자와 플라스크를 고정합니다. 욕조에 물 목욕 자체가 멸균 높지 않습니다.
5. 물을 욕조에 삽입하기 전에 파라 필름과 모자를 밀봉.
<리> 제공된 스탠드에 밀봉 배양 플라스크를 고정합니다.
6. 수조에 고정 된 플라스크를 삽입합니다. 세포 배양 플라스크의 중간 충격파 어플리케이터의 멤브레인의 중심과 같은 높이에 있음을 다룬다. 목욕의 측면 라인을 안내합니다.

3. 치료 매개 변수에게 정의

1. 충격파 소스와 샘플 사이의 거리를 정의합니다. 그림 6에 설명 된대로 매개 변수를 찾는 파일럿 실험을 실시하여 완벽한 처리 매개 변수를 확인합니다.
2. 충격파 장치에 적당한 처리 파라미터 (에너지 플럭스 밀도, 주파수)를 선택한다. 다시 말하지만, 그림 6을 참조하십시오.

4. 충격파 응용 프로그램

1. 충격파 어플리케이터에뿐만 아니라 수조의 멤브레인에 시판 초음파 송신 겔 충분한 양을 넣어. 이 커플 링을 보장하는 것입니다. 에 공기 거품은 주걱과 막 사이에 없어야합니다그것은 충격파를 흡수합니다.
2. 막에 도포를 연결하고 멤브레인의 중심에서 안정을 유지. 이 가로로 정렬되어 있는지주의하십시오.
3. 수조 내부의 프로브의 정확한 수직 위치가 표시된 목욕의 측면에 마킹 라인에 있는지 확인하십시오.
4. 수평 라인에서 도포하고 플라스크의 안정 센터를 누릅니다.
5. 충격파 단말기를 등록하고 전체 공정 중에 안정한 위치에서 배양 플라스크뿐만 아니라 어플리케이터를 유지하면서 자극을 적용한다.

5. 후 처리

1. 수조 밖으로 문화 플라스크를 가져 가라.
2. 일반적인 종이 타월로 건조.
3. 소독제와 정확하게 플라스크를 닦습니다.
4. 파라 필름 바다 표범 어업 및 캡을 제거합니다.
5. 원심 튜브에 플라스크 내부의 중간 피펫.
6. 적절하게 원심 분리기. 원심 분리 매개 변수가 사용되는 세포의 종류에 따라, 예. HUVEC를 위해 상온에서 290g을 사용합니다.
7. 플라스크에 세포 배양 배지 5 ㎖를 추가합니다. 세포 배양 배지 2 ㎖로 원심 분리 세포 펠렛을 재현 탁. 플라스크에 현탁액을 피펫. 따라서, 치료 기간 동안 분리되어있다 세포 조각이나 세포가 손실되지 않습니다.

주의 할 점

1. 제조뿐만 아니라 치료는 세포 배양의 오염을 피하기 위해 층류 내부의 멸균 조건 하에서 수행되어야한다.
2. 좋은 세포 배양 연습은 프로브의 오염을 방지하는 것이 좋습니다. 특히 플라스크의 외부의 소독 강하게 인큐베이터에 넣기 전에하는 것이 좋습니다. 수욕뿐만 아니라 물 내부는 멸균 아니다!
3. 수욕은 목욕을 내장 플렉시의 손상을 피하기 위하여 만수 않는 전원에 히터를 연결하지 않는다.
4. 충격파 APPL에 초음파 젤의 관대 한 금액을 사용icator는 욕조에 적절한 결합과 전파를 보장합니다. 공기와도 작은 기포는 충격파를 흡수한다!
5. 전체 성장 영역의 치료를 보장하는 어플리케이터 관련 수조 내부의 프로브의 위치를​​ 확인한다.
6. 오염을 방지하기 위해 너무 깊은 물에 프로브를 덩크하지 마십시오.

결과

탯줄로부터 우리는 상술 절연 우리가 인간 제대 정맥 내피 세포에 충격파를인가 한 방법 (HUVEC를) 사용. 탯줄은 선택 과목 제왕 섹션에서 얻을 수 있었다.

HUVEC를는 전자 유압식 충격파 치료 시스템과 T25 세포 배양 플라스크에 90 % 합류에 처리 하였다. 처리 파라미터는 0.1 엠제이 / mm ^2, 5 Hz의 주파수의 에너지 플럭스 밀도되었습니다. 300는 임펄스 충격파 소스로부터 5cm?...

토론

체외 충격파 치료를 위해 제안 된 모델의 중요성은 파도 기존 모델 대조 세포 배양을 통과하여 전파 할 수 있다는 사실이다. 이로써, 그러한 인장력 같은 물리적 교란 효과를 피할 수있다. 이 모델은 더 밀접하게 다른 사람들이 직접 자신의 세포 배양 플라스크에 파도를 적용하여보다 생체 내 조건에서 유사합니다.

추가적인 장점은 충격 파 소스와 셀 사이의 거?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Orthogold shock wave device	Tissue Regeneration Technologies, Woodstock, GA – manufactured by MTS-Europe GmbH, Konstanz, Germany
IVSWT Water Bath V2.0	Johann Hohenegger - Technical Products	-
EBM-2 Basal Medium 500 m +EGM-2 SingleQuot Suppl.&Growth Factors	Lonza	CC-3156 & CC-4176	This medium was used for the shown experiments with HUVECs to fill the cell culture flask. For other cell types, use the recommended medium.
Pechiney Parafilm M PM996	Pechiney Plastic Packaging	PH-LF-PM996-EA at labplanet.com	for sealing flasks
Falcon Serological pipets 25ml	Becton Dickinson Labware	357525
CellMate II Serological Pipette	Matrix Technologies	-
Skintact Ultrasonic Gel	Skintact	UL-01 250 ml
T25 cell culture flasks	COSTAR	3056
mikrozid disinfectant	Schülke	-
3,5l degassed water
paper towels