JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويهدف النهج وصفها النسبية، كمية البروتين في الحصول على نظرة ثاقبة لتكوين المجمعات multiprotein في ظل ظروف مختلفة، ويتجلى من خلال مقارنة سلالات مختلفة وراثيا. للتحليل الكمي يتم خلط كميات متساوية من كسور مختلفة من التدرج كثافة السكروز وتحليلها بواسطة مطياف الكتلة.

Abstract

يوفر بروتوكول أدخلت أداة لتحليل المجمعات multiprotein في الغشاء الثايلاكويد، من خلال الكشف عن نظرة ثاقبة تكوين معقدة في ظل ظروف مختلفة. في هذا البروتوكول ويتجلى هذا النهج من خلال مقارنة تكوين البروتين المسؤول معقدة للدوري تدفق الإلكترونات (CEF) في كلاميدوموناس reinhardtii، معزولة عن سلالات مختلفة وراثيا. ويتألف الإجراء عزل الأغشية الثايلاكويد، تليها انفصالهما في المجمعات multiprotein بواسطة السكروز الطرد المركزي التدرج الكثافة، SDS-PAGE، مناعي والمقارنة، قياس الطيف الكتلي الكمي (MS) على أساس وضع العلامات الأيضية التفاضلية (14 N / 15 N) من سلالات تحليلها. يتم تحميل الأغشية الثايلاكويد solubilized المنظفات على التدرجات كثافة السكروز في تركيز الكلوروفيل متساوية. بعد تنبيذ فائق، يتم فصل التدرجات إلى كسور، التي يتم تحليلها بواسطة الشامل spectrometراي يعتمد على حجم مساو. هذا النهج يتيح التحقيق في تكوين داخل الكسور التدرج وعلاوة على ذلك لتحليل سلوك الهجرة من البروتينات المختلفة، مع التركيز خصوصا على ANR1، CAS، وPGRL1. علاوة على ذلك، ويتجلى هذا الأسلوب من خلال التأكد من نتائج مع immunoblotting وبالإضافة إلى ذلك بدعم النتائج من الدراسات السابقة (تحديد والهجرة تعتمد على المبادرة من البروتينات التي تم وصفها سابقا لتكون جزءا من CEF-supercomplex مثل PGRL1، FNR، و CYT و). والجدير بالذكر أن هذا النهج ينطبق على معالجة مجموعة واسعة من الأسئلة التي هذا البروتوكول يمكن اعتمادها وعلى سبيل المثال تستخدم لتحليلات مقارنة للتكوين معقدة multiprotein معزولة عن الظروف البيئية المتميزة.

Introduction

ويمكن لعمليات التمثيل الضوئي في الأغشية الثايلاكويد من النباتات والطحالب تعمل في وضع الخطية ودوري. خلال الخطية تدفق الإلكترونات (LEF) الضوئي الأول (PSI)، الضوئي الثاني (PSII) والسيتوكروم ب 6 / و في نهاية المطاف نقل الالكترونات من الماء إلى NADP + 1، مما يؤدي إلى توليد NADPH و ATP 2. في المقابل، دوري تدفق الإلكترونات (CEF)، والذي يعرف ليكون ذلك حافزا تحت ظروف بيئية متنوعة مثل الدولة 2 3 4 شروط واللاهوائية، والنتائج في إعادة الحد من PSI أكسدة عن طريق حقن الإلكترونات مرة أخرى إلى سلسلة نقل الإلكترون. هذه العملية يمكن أن تتم إما في الجانب اللحمية من السيتوكروم ب 6/1 و المعقدة أو في بركة كينون صانعي 5 ويولد ATP، ولكن لا NADPH 2.

الهدف من البروتوكول هو عرض ليبرهن على وجود الطيف الكتلي (MS) على أساس مethod للمقارنة، والتحليل الكمي من المجمعات multiprotein في الأغشية الثايلاكويد من كلاميدوموناس reinhardtii إلى التبصر في تكوين هذه المجمعات في ظل ظروف مختلفة (يتضح من المقارنة بين سلالات مختلفة وراثيا). تم تطبيق هذا النهج في منشور من قبل Terashima وآخرون في عام 2012 مما يدل على كا 2 + التي تعتمد على التنظيم من مركز دراسات الحدود في C. reinhardtii بوساطة مجمع multiprotein بما في ذلك البروتينات CAS، ANR1، وPGRL1 6. وسيتم شرح الإجراء من خلال تحليل مقارن لتكوين CEF-supercomplex في اثنين من سلالات مختلفة وراثيا، وبالتالي الاستفادة من وضع العلامات واحدة من سلالتين مع النيتروجين الثقيلة (15 N). لفترة وجيزة، ويتضمن بروتوكول إعداد الأغشية الثايلاكويد، تليها الانحلالية المنظفات وتجزئة المجمعات الضوئي في التدرج كثافة السكروز. بعد تجزئة التدرج، اختار فاركستعقد من سلالتين مختلطة على أساس حجم مساو، مفصولة SDS-PAGE تليها الهضم في جل واللاحقة تحليل MS الكمي.

كما ذكر أعلاه، هو فعل CEF تحت ظروف بيئية مختلفة ونشر اعتبارا من عام 2010 يدل على عزلة وظيفية CEF-supercomplex من الدولة 2 الخلايا المؤمنة من C. reinhardtii 7، التي كان يؤديها عن طريق فصل الأغشية الثايلاكويد solubilized على التدرج كثافة السكروز خلال تنبيذ فائق. مختلفة من إيواي وآخرون. 7، يصف بروتوكول المعروضة عزلة CEF-supercomplex من اللاهوائية نمت C. الثقافات reinhardtii باتباع إجراء بديل. هذا وتضم التغييرات في بروتوكول العزلة الثايلاكويد فضلا عن الاختلافات بشأن الخطوة الانحلالية وفصل المجمعات البروتين بواسطة تنبيذ فائق. في هذا البروتوكول، والأغشية الثايلاكويديتم عزل بتطبيق الإجراء الذي نشرته تشوا وBennoun 8، في حين أن مخازن تستخدم لإعداد الثايلاكويد بواسطة إيواي وآخرون. تضم 25 ملي مس، 0.33 M السكروز، 5 ملي MgCl 2، 1.5 ملي مول كلوريد الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 6.5) كما هو موضح 9. تم إجراء الانحلالية مع المنظفات 0.7-0.8٪ (ن tridecyl-β-D-مالتوزيد) لمدة 30 دقيقة على الجليد في حالة إيواي وزملاء العمل، في حين أن طريقة الإذابة وصفها هنا تعتمد على استخدام المنظفات بنسبة 0.9٪ (ن دوديسيل-β-D-مالتوزيد (β-DM)) ويتم تنفيذ سوى 20 دقيقة على الجليد. تستخدم كلتا المجموعتين 0.8 ملغ من الكلوروفيل لكل مل لإذابة المنظفات مع كل منها. لفصل المجمعات الضوئي من الأغشية الثايلاكويد solubilized إيواي وآخرون. تطبيق تركيزات السكروز بين 0،1-1،3 م، في حين أن واضعي هذا البروتوكول يستخدم بتركيزات تتراوح 0،4-1،3 م الفرق الأخير هو سرعة الطرد المركزي، والذي هو أقل مقارنة إلى عصامنشر rlier.

تم تطبيقه بالفعل الانحلالية الأغشية الثايلاكويد مع المنظفات غير أيوني تليها كثافة السكروز التدرج التجزئة في العديد من الدراسات تتراوح من 1980s وحتى اليوم 7، 9-14، وكذلك تطبيق وضع العلامات الأيضية للبروتينات هو الأسلوب على نطاق واسع في مجال تحليل البروتينات. النهج وصف ينطبق على وضع العلامات 15 N الأيض واحد من اثنين من سلالات مقارنة عن طريق زرع في وجود النيتروجين الثقيل كمصدر للنتروجين وحيد في شكل 15 N NH 4 CL، التي يتم تضمينها في جميع الأحماض الأمينية التي تؤدي الى كتلة التحول تبعا لتسلسل الأحماض الأمينية من الببتيد. عند تحليل خليط من 14 N و 15 N ضمن واحدة MS تشغيل، ويمكن استخدام هذا التحول الشامل إلى تحديد منشأ العينة لكل الببتيد ببتيد والنسبية يمكن حساب الكميات المتوفرة تمثل فرة نسبية لتتوافقالبروتين 15 جي.

العديد من الدراسات الكمية على تحليل البروتينات C. هي reinhardtii المتاحة، التي تقارن كمية محددة من البروتين لتحليل التغيرات في بروتيوم بين الظروف التجريبية (مثل التغيرات في بروتيوم بسبب المغذيات 16-19 أو ضوء التوتر 20،21). مقارنة مع تلك الدراسات، في نهج مطروحة حاليا يتم الجمع بين أحجام متساوية من العينات وتحليلها. هذا الإعداد يسمح لدراسة سلوك الهجرة من البروتينات داخل التدرج وعلاوة على ذلك لتحليل تكوين مجمعات مختلفة فيما يتعلق سلالات التحقيق.

وسيتم شرح هذه الطريقة من خلال التركيز بشكل رئيسي على ثلاثة بروتينات: المرشح الأول هو البروتين استشعار الكالسيوم CAS-المترجمة بلاستيدات الخضراء، والتي تبين أن تشارك في الصور التأقلم في C. reinhardtii 22 يعتبر الكالسيوم لتكون إشارة مهمةايون جي للمسارات التي يتم تفعيلها نظرا لمختلف الضغوط الحيوية وغير الحيوية الرائدة في النهاية إلى تغيرات في التعبير الجيني والخلايا الفسيولوجيا 23 واقترح أن البلاستيدات الخضراء يمكن أن تسهم في الخلوية كا 2 + إشارات عبر البروتينات CAS 22،24،25. البروتين الثاني هو ANR1 (استجابة اللاهوائية 1 6)، وهو البروتين الذي تبين أن يسببها نقص الأكسجين تحت ظروف النمو في C. reinhardtii 26. ولا سيما، CAS وكذلك ANR1 تم تحديدها باعتبارها مفارز من CEF-supercomplex وعلاوة على ذلك، باستخدام النهج الوراثية العكسية، وقد تبين أن كلا من البروتينات تسهم ظيفيا لمركز دراسات الحدود في الجسم الحي 6، ودعم دورها في مفارز وظيفية من هذا المجمع البروتين. البروتين الثالث هو الثايلاكويد البروتين PGR5 على غرار 1 (PGRL1)، والذي يظهر أن تشارك في CEF في كلاميدوموناس 4،27 وكذلك في نبات الأرابيدوبسيس 5،28 وكان أيضا معرفentified في عمل إيواي وآخرون. 7

وسيقدم هذا النهج من خلال إظهار نتائج تجربتين مختلفتين: wildtype (WT) مقابل (مقابل) سلالة ΔPSI 29، واظهار حذف الجين psab، والترميز لالضوئي ضروري أنا الوحيدات، والتي هي أيضا جزء من CEF-supercomplex وWT مقابل لpgrl1 خروج المغلوب سلالة 4. لكل من هذه التجارب تكوين كمية من CEF-supercomplex بين 15 و N وقد تم مقارنة سلالة N 14 المسمى.

Protocol

1. زراعة من كلاميدوموناس

  1. وC. التالية واستخدمت reinhardtii سلالات في هذه الدراسة: WT cc124، WT-cw15 arg7 (جدار الخلية ناقصة وأرجينين عوني التغذي)، وهو ΔPSI سلالة متحولة 29 وpgrl1 خروج المغلوب سلالة 4.
  2. وقد نمت جميع سلالات في تريس، خلات فوسفات (وات) المتوسطة 30، عند 25 درجة مئوية مع شدة الضوء المستمر من 20-50 μE / م 2 ثانية واهتزاز في 120 دورة في الدقيقة. ينبغي أن تكون ملفوفة ثقافة ΔPSI مع بعض المناديل الورقية لالتعرض للضوء من <5 μE / م 2 ثانية.
  3. ثقافات السلالات المسمى (ΔPSI وWT cc124، على التوالي) الوارد 7.5 ملي 15 N NH 4 CL، في حين أن الثقافات لسلالات nonlabeled (WT-cw15 arg7 وpgrl1، على التوالي) الوارد 7.5 ملي 14 N NH 4 CL. الخلايا أن تنمو لمدة أربعة على الأقل generatيجب أن تبقى الأيونات لتحقيق وضع العلامات الكاملة وفي مرحلة النمو الأسي.
  4. في اليوم قبل بدء العد التجربة وتمييع الخلايا إلى كثافة من 1 × 10 6 خلية / مل في حجم 750 مل على الأقل / السلالة.

يرجى ملاحظة أن نوعين من الكثافة متقطع التدرجات السكروز موصوفة في بروتوكول التالي. التدرجات كثافة الضوئي السكروز وفقا لتاكاهاشي وآخرون. 9 تستخدم للفصل بين مختلف المجمعات البروتين الضوئي من thylakoids معزولة وsolubilized خلال الإفراط في الليل الطرد المركزي، ويجب أن يكون مستعدا في اليوم السابق (انظر بروتوكول 2) والثايلاكويد التدرجات كثافة السكروز يتم تطبيق 8 في إجراء العزل الثايلاكويد (انظر البروتوكول 3).

2. إعداد الضوئي السكروز التدرجات الكثافة

  1. للصب التدرجات وهناك حاجة إلى ثلاثة حلول الأوراق المالية:
    1. 2 M السكروز
    2. 10٪ β-DM في H 2 O
    3. 0.5 M Tricine، ودرجة الحموضة 8.0 (هيدروكسيد الصوديوم)
  2. باستخدام هذه الأسهم، وإعداد الحلول التالية:
    التركيز: 1.3 M 1.0 M 0.85 M 0.7 M 0.65 M 0.4 M
    2 M السكروز 13 مل 10 مل 8.5 مل 7 مل 6.5 مل 4 مل
    10٪46؛-DM 100 ميكرولتر 100 ميكرولتر 100 ميكرولتر 100 ميكرولتر 100 ميكرولتر 100 ميكرولتر
    0.5 M Tricine 200 ميكرولتر 200 ميكرولتر 200 ميكرولتر 200 ميكرولتر 200 ميكرولتر 200 ميكرولتر
    H 2 O 6.7 مل 9.7 مل 11.2 مل 12.7 مل 13.2 مل 15.7 مل
  3. استخدام أنابيب 14 ملم X 89 ملم الطرد المركزي وتصب التدرجات ببطء شديد، بدءا من أعلى كثافة حل السكروز إلى انخفاض كثافة حل.
  4. صب 1 مل فقط لكل من 1.3 و 1.0 M حلول و 2 مل لبقية الحلول.
  5. ترك بين عشية وضحاها التدرجات في غرفة باردة.

3. اللاهوائية التعريفي وعزل الثايلاكويد الأغشية 8

  1. قبل البدء مع العزلة الأغشية الثايلاكويد، لحث الظروف اللاهوائية التي كتبها محتدما مع الأرجون لمدة 4 ساعة. لا يمكن أن يؤديها محتدما من خلال ماصة الزجاج في زراعة قوارير مع الخلط المستمر للثقافة مع شريط مغناطيسي.
  2. تبدأ مع العزلة الأغشية الثايلاكويد بواسطة التكوير الخلايا لمدة 5 دقائق عند 2،500 x ج، resuspend في H1 العازلة (0.3 M السكروز، 25 ملي HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.5)، 5 ملي MgCl 2).
    (يرجى ملاحظة أنه عند بدءا من عزل عينات الثايلاكويد الأغشية SHأولد أن تبقى على الجليد لتجنب تدهور البروتين، وتتم جميع الخطوات الطرد المركزي بها في 4 درجات مئوية، والعمل مع قفازات ينصح بشدة لتجنب التلوث الكيراتين.)
  3. خلايا بيليه لمدة 5 دقائق عند 2،500 x ج، resuspend في المخزن المؤقت H1.
  4. كسر الخلايا مع ممرين من خلال البخاخات مع ضغط النيتروجين من 1،500 HPA (لسلالات دون جدار الخلية القيام مرور واحد فقط).
  5. تدور باستمرار خلايا لمدة 7 دقائق في ز × 2،500.
    (بعد هذه الخطوة يجب أن يكون طاف الضوء الأخضر، وإذا لم يكن كذلك، كان الكسر الخليوي غير ناجحة.)
  6. خلايا resuspend في H2 العازلة (0.3 M السكروز، 5 ملي HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.5)، 10 ملي EDTA (8.0 درجة الحموضة)) وخلايا بيليه لمدة 10 دقيقة في 32،800 ز س.
  7. Resuspend الخلايا في المخزن H3 (1.8 M السكروز، 5 ملي HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.5)، 10 ملي EDTA (8.0 درجة الحموضة)) والتجانس مع بيليه بوتر (لا ينبغي أن تظل جسيمات الأخضر في نهاية هذه الخطوة العمل).
  8. إعداد الثايلاكويد التدرجات كثافة السكروز في الحوضوفاق (25 ملم × 89 ملم) من خلال البدء في الجزء السفلي بطبقة من 12 مل H3 العازلة مع الخلايا، صب طبقة وسطى من 12 مل H4 العازلة (1.3 M السكروز، 5 ملي HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.5)، 10 ملي EDTA ( ودرجة الحموضة 8.0)) وعلى رأس 12 مل H5 العازلة (0.5 M السكروز، 5 ملي HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.5)، 10 ملي EDTA (8.0 درجة الحموضة)). كن حذرا عند صب التدرجات وتجنب خلط من ثلاث طبقات.
  9. تحقيق التوازن مع H5 العازلة وأجهزة الطرد المركزي الثايلاكويد التدرجات كثافة السكروز لمدة 1 ساعة في 70700 ز س.
  10. إزالة العصابات الثايلاكويد من الثايلاكويد التدرجات كثافة السكروز وتمييع لهم وجود مخزن مؤقت حجم H6 المناسب (5 ملي HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.5) 10 ملي EDTA (8.0 درجة الحموضة)).
  11. تدور باستمرار خلايا في 37،900 x ج لمدة 20 دقيقة. إذا كان بيليه ليست ضيقة، ويحتاج إلى المزيد من العازلة H6 لهذه الخطوة الطرد المركزي.
  12. في resuspend thylakoids في منطقة عازلة H6 حجم صغير والمضي قدما بعزم تركيز الكلوروفيل.

4. تحديد تركيز الكلوروفيل 31

  1. يتم تنفيذ تحديد كمية الكلوروفيل مع 80٪ الأسيتون.
  2. مزيج 995 ميكرولتر 80٪ الأسيتون و 5 ميكرولتر من thylakoids في المخزن H6 (التخفيف 1:200).
  3. دوامة لمدة عدة ثوان حتى لا تظل جسيمات الخضراء ثم تدور إلى أسفل في 14.1 x ج لمدة 5 دقائق.
  4. اتخاذ طاف وقياس الانقراض في 663.6 نانومتر و646.6 و 750 نانومتر، على التوالي.
  5. حساب كمية الكلوروفيل باستخدام الصيغ التالية:
    1. C كلوروفيل أ [مغ / مل] = (0.01225 * E 663،6-0،00255 * E 646،6) * عامل التخفيف
    2. C كلوروفيل ب [مغ / مل] = (0.02031 * E 646،6-0،00491 * E 663.6) * عامل التخفيف
    3. C كلوروفيل [مغ / مل] = C + C كلوروفيل وكلوروفيل ب

5. تحميل الضوئي السكروز التدرجات الكثافة

  1. حساب كميات من thylakoids، β-DM وعازلة H6 أن هناك حاجةلكل التدرج:
    1. يجب أن يتم تحميل كل التدرج مع حجم مجموعه 700 ميكرولتر مع 0.8 ملغ / مل الكلوروفيل في 0.9٪ β-DM (حل β-DM في H 2 O)، وملء حجم المتبقية مع العازلة H6.
  2. لالانحلالية إعداد مأخوذة مختلفة مع thylakoids، β-DM وعازلة H6 لكل التدرج.
  3. ترك العينات لمدة 20 دقيقة على الجليد مع خلط بانتظام (قلب) كل بضع دقائق (الخطوة الانحلالية).
  4. أجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة (14،000 XG) لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    (بعد الطرد المركزي، ينبغي أن يكون بيليه صغيرة وبيضاء بينما طاف هو الخضراء الداكنة.)
  5. تحميل طاف على التدرجات.
  6. تحقيق التوازن مع H6 العازلة وتدور باستخدام نابذة فائقة السرعة في XG 134470 ليلة وضحاها (14 ساعة) في 4 درجات مئوية.
    (يرجى ملاحظة أن فصل ناجحة المجمعات الضوئي باستخدام التدرجات كثافة الضوئي السكروز كما وردت في هذا البروتوكول ويتحقق فقط عندما النقيبز طازجة معزولة thylakoids، لأن التنبؤ لإذابة وفصل معقدة من الصعب جعل عند العمل مع الأغشية الثايلاكويد التي تم تجميدها من قبل.)

6. من تجزئة الضوئي السكروز التدرجات الكثافة

  1. التقاط صور للالتدرجات.
  2. ثقب حفرة في الجزء السفلي من الأنبوب باستخدام إبرة والتدرجات يجزئ في 500 ميكرولتر أنابيب. بدلا من ذلك، يمكن أيضا أن يؤديها تجزئة باستخدام لوحة 96 جيدا (صفيحة ميكروسكوبية).
  3. عند استخدام صفيحة ميكروسكوبية، وتحديد الامتصاصية من كسور مختلفة في التدرج 675 نانومتر.
    (في هذه الخطوة يمكن تخزين العينات في -80 درجة مئوية لمدة بضعة أسابيع.)

7. SDS-PAGE ومناعي

(يرجى ملاحظة أن فقط للمقارنة WT مقابل ΔPSI تم إجراء تحليل لطخة غربية لتحديد الكسور لاحقة MS-التحليل. للتجربة WT مقابل pgrl1 الابوقد تم اختيار الأعمال التي تقوم بها وسائل الامتصاصية في كسور مختلفة.)

  1. منفصلة 30 ميكرولتر من كل جزء من WT وΔPSI التدرج على 13٪ SDS بولي أكريلاميد هلام 32.
  2. إجراء تحليل لطخة غربية باستخدام الأجسام المضادة 33 التالية: ANR1 (TEF7) 26، PGRL1 34، CAS 6، وPSAD PSI 32 الوحيدات وجوهر PSII الوحيدات D1. استخدام جميع الأجسام المضادة مع التخفيف من 1:1،000 (لتعزيز لمعان كيميائي تقنية الكشف)، باستثناء الأجسام المضادة D1، التي ينبغي استخدامها مع التخفيف من 1:10،000.
  3. استنادا إلى نتائج مناعي، واتخاذ الكسور ذروة ANR1، PGRL1 وPSAD لWT وΔPSI (هنا الكسور 6 و 13، على التوالي)، ومزيج 30 ميكرولتر من جزء 6 من WT وΔPSI وتفعل الشيء نفسه مع جزء من 13 كلا الاستعدادات وفصلها مرة أخرى على 13٪ هلام SDS بولي أكريلاميد.
  4. لمقارنة كمية من WT مقابل pgrl1 اتخاذ Cالكسور-EF supercomplex على النحو الذي يحدده قياس الامتصاصية في كسور مختلفة ومتدرجة مزيج 30 ميكرولتر من كل من العينات يليه فصل على 13٪ هلام SDS بولي أكريلاميد.
  5. وصمة عار على العصابات البروتين مع Coomassie حل (حمض الفوسفور 85٪، كبريتات الأمونيوم 757 ملم، 1.2٪ Coomassie الرائعة الأزرق، 20٪ الميثانول) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو أكثر من ليلة في 4 درجات مئوية.
  6. لإزالة تلطيخ غير محددة، ويغسل عدة مرات مع DDH 2 O.
  7. قطع الممرات في 1 ملم قطعة هلام والمضي قدما في عملية الهضم في هلام.
    (بدلا من ذلك، يمكن أن تجفف عينات قليلة في جهاز للطرد المركزي فراغ دقائق وتخزينها لبضعة أسابيع قبل متابعة عملية الهضم في جل.)

8. في جل الهضم (معدلة من شيفشينكو وآخرون 35)

يرجى ملاحظة أن يعد جميع مخازن والحلول قبل فترة وجيزة من استخدام واتخاذ قناني زجاجية للمخازن تحتوي على أسيتونتريل (ACN). <ر /> تنبيه! العمل مع ACN قد تكون ضارة، ويمكن تحميلها من على مزيد من المعلومات: http://www.sciencelab.com/msds.php؟msdsId=9927335 (2013).

  1. غسل قطعة هلام مع> 10 مجلدا من ده 2 O (~ 200 ميكرولتر) لمدة 30 ثانية.
  2. احتضان القطع هلام مع 300 ميكرولتر من 25 ملي NH 4 HCO 3 لمدة 15 دقيقة مع اهتزاز، وإزالة السائل.
  3. احتضان القطع هلام مع 300 ميكرولتر من 25 ملي NH 4 HCO 3 في 50٪ ACN (إعداد عن طريق خلط ACN و 50 ملي NH 4 HCO 3 في نسبة 1:1) لمدة 15 دقيقة مع اهتزاز، وإزالة السائل.
  4. إذا القطع هلام لا تزال زرقاء، كرر NH 4 HCO 3 و 4 NH HCO 3 / ACN يغسل حتى تتم إزالة معظم Coomassie.
    (على الرغم من أن الجزء الأكبر من تلطيخ Coomassie يجب إزالة، فإنه ليس من الضروري أن يزيل اللون القطع هلام تماما.)
  5. إضافة 100 ميكرولتر من ACN ليذوى القطع هلام لمدة 5 دقائق. يجب القطع هلام تقليصالثانية تبدو بيضاء تماما.
  6. إزالة أكبر قدر ممكن ACN والمضي قدما مع التربسين الهضم. بدلا من ذلك، يمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية لمدة بضعة أسابيع.
  7. إضافة 10-20 ميكرولتر في عصابة من 20 نانوغرام / ميكرولتر التربسين في ACN 10٪ / 25 ملي NH 4 HCO 3 (المخفف الطازج)، والحفاظ على العينات على الجليد.
  8. بعد 30 دقيقة، ومعرفة ما اذا كان تم استيعاب جميع الحل وإضافة المزيد من العازلة التربسين، إذا لزم الأمر. قطعة هلام ينبغي تغطيتها تماما مع العازلة التربسين. الاحتفاظ بعينات على الجليد.
  9. ترك قطعة هلام لمدة 90 دقيقة أخرى على الجليد لتشبع لهم التربسين.
    (الخطوة الحرجة: العائد من الببتيدات زيتية يزيد بشكل كبير مع زيادة مرات حضانة على الجليد، وربما بسبب انتشار بطيء للانزيم في مصفوفة بولكرلميد ومن الضروري أن يكون هناك زيادة صغيرة من محلول تغطي القطع هلام لتجنب أن القطع. تقع جافة خلال فترة الحضانة بين عشية وضحاها.)
  10. هضم عند 37 درجة مئوية لمدة 4-6 ساعة. للتجارب التي تتطلبانتعاش الببتيد القصوى، هضم ليلة وضحاها.
  11. بعد هضم تدور باستمرار عازلة الموجزة.
  12. أنابيب يصوتن لمدة 5 دقائق إلى أزل الببتيدات وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى.
  13. جمع طاف وتحويلها إلى أنبوب جديد.
  14. أداء استخراج الببتيد مع 80 ميكرولتر من 30٪ ACN / 1٪ حمض الفورميك (FA) في حمام الصوتية لمدة 15 دقيقة.
  15. أداء استخراج مع 80 ميكرولتر من 30٪ ACN / 1٪ FA في حمام الصوتية لمدة 15 دقيقة.
  16. أداء استخراج مع 80 ميكرولتر من 70٪ ACN / 1٪ FA في حمام الصوتية لمدة 15 دقيقة.
  17. الطرد المركزي مرة أخرى وتجمع طاف مع شطافة مسبق.
    (FA يعمل على تعطيل التربسين وزيادة الببتيد الذوبان.)
  18. الحل الببتيد جافة تماما في جهاز للطرد المركزي فراغ.
    (عند هذه النقطة يمكن تخزين العينات لبضعة أسابيع في -20 درجة مئوية قبل الشروع في MS-التحليل.)
  19. الببتيدات resuspend في 6 ميكرولتر MS العازلة (5٪ ACN، 0.1 ت / ت FA، والمياه) ويصوتن لمدة 2-5 دقيقة.
  20. أجهزة الطرد المركزي في عينات كحد اقصىسرعة م لمدة 5 دقائق لإزالة المواد الجسيمية.
  21. استخدام 4 ميكرولتر من طاف للتحليل الطيفي الشامل.

9. MS-تحليل البيانات مع "Proteomatic"

تم إجراء تحليل البيانات مع برمجيات المصدر المفتوح "Proteomatic" (التي يمكن تحميلها في http://www.proteomatic.org/)، وهي المنصة التي تسمح للتوليد واستكمال MS / MS أنابيب تقييم البيانات، وذلك باستخدام البرمجيات الحرة والتجارية 36. لفترة وجيزة، تم وصفها الإعدادات أدناه ويمكن الاطلاع على معلومات أكثر تفصيلا في 6،26.

  1. تحديد وتقدير حجم البيانات MS-
    تم القيام به تحديد وتقدير من البروتينات من التجارب WT مقابل ΔPSI مع OMSSA (الإصدار 2.1.4 37) وqTrace 26، على التوالي، كما هو موضح 6،26. لتحليل البيانات MS-من التجربة WT مقابل pgrl1 خط أنابيب المحدث التالية تم استخدامها:
    1. بالإضافة إلى OMSSA 37، تم تحديد البروتينات أيضا مع X! جنبا إلى جنب (الإصدار 2013/02/01 38). تم تطبيق الخوارزميات على حد سواء من خلال البحث مقابل قاعدة بيانات تم إنشاؤها من خلال الجمع بين JGI كلاميدوموناس قاعدة بيانات نموذج الجين الإصدار 4.3 مع إصدار قاعدة بيانات AUGUSTUS 10.2 وكذلك ضد قاعدة بيانات انضم للNCBI قواعد البيانات BK000554.2 وNC_001638.1.
    2. تم تنفيذ MS 2 تحديد الببتيدات باستخدام نهج المستهدفة شرك 39. تم إنشاء شرك لكل من البروتين عن طريق خلط عشوائيا الببتيدات زيتية مع الحفاظ على التكرار من الببتيدات nonproteotypic.
    3. تم إجراء التحقق من صحة الإحصائية من الببتيدات مع qvality البرمجيات (الإصدار 0.3.3 40) باستخدام احتمال الخطأ الخلفي (PEP) عتبة تم تصفيتها أقل من 0.01 والنتائج مع التسامح السلائف الشامل من 5 جزء في المليون.
    4. الببتيدات من OMSSA وX! وانضم أشواط جنبا إلى جنب مع وكميا qTrace 26 تطبيق الخطوات التصفية التالية: تتطلب MS 2 تحديد الهوية، وإضافة أسماء البروتين / المعلومات المجموعة وتتطلب كل من الببتيدات الشقيقة.

للتحقيق في ما إذا كانت نسب البروتين كانت مختلفة بشكل ملحوظ تجاه بعضهم البعض في الكسور-CEF supercomplex مختلطة من WT وpgrl1، تم إجراء التحليل الإحصائي SPSS تطبيق البرمجيات (الإصدار 21). تم اختبار مفارز السيتوكروم ب 6 / و معقدة ضد بعضها البعض، فضلا عن البروتينات FNR، FTSH2 وHCF136 ضد مفارز PSI. تم اختبار نسب الببتيد من كل تهمة مسح في البروتين من كل أربعة مكررات للتوزيع العادي مع اختبار شابيرو، يلكس. منذ لم توزع السكان عادة الببتيد (ع <0.001)، وقد أجريت الإحصاءات اللامعلمية. أولا، تم تطبيق اختبار كروسكال واليس تقييم اختلاف كبير بين المجموعتين. إلا إذا توقع هذا الاختبار فرق كبيرق بين المجموعات، تم إجراء مزيد من التحليل للتنبؤ فروق ذات دلالة إحصائية بين مجموعتين مستقلة مع اختبار مان ويتني U-.

النتائج

ويهدف النهج الكمي البروتيوميات قدم لوصف تكوين المجمعات multiprotein في الأغشية الثايلاكويد يتبين من تحليل مقارن لمكونات CEF-supercomplex في مختلف وراثيا C. reinhardtii السلالات. وقد تم بنجاح تطبيق الطريقة الموصوفة من قبل Terashima وآخرون. 6 وتضم عزلة الأغشية الثايلاكويد ...

Discussion

وقد نشرت دراسات البروتين الكمي المختلفة باستخدام الوسم النظائر مستقرة في السنوات الأخيرة. في هذه التجارب عادة ما تتم مقارنة اثنين من عينات مختلفة، منها هو المسمى عينة واحدة مع النظائر مستقرة. بعد ذلك يتم الجمع بين البروتينات أو الببتيدات من العينتين في نسبة متساوية ...

Disclosures

الكتاب تعلن أي مصلحة مالية المتنافسة.

Acknowledgements

يقر MH بدعم من "جمعية الألمانية للبحوث" (DFG). الكاتب المساهمات: تصميم MH البحوث؛ تنفيذ KT، JS وMT البحوث وتحليل البيانات؛ كتب KT وMH الورقة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
Acetic acidAppliChemA0662http://www.applichem.com/home/
AcetoneAppliChemA2300http://www.applichem.com/home/
Acetonitrile Optigrade für LC-MSDiagonal9340Harmful, work with gloves. See protocol text for further precautions.

https://www.diagonal.de/

Ammonium chloride 15NCambridge Isotope Laboratories39466-62-1http://www.isotope.com/cil/index.cfm
Ammonium chloride 14NAppliChemA0988http://www.applichem.com/home/
Ammonium hydrogen phosphate AppliChemA3583http://www.applichem.com/home/
Ammonium sulfate AppliChemA3598http://www.applichem.com/home/
Coomassie brilliant blue R-250Fisher Scientific10041653http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex
n-Dodecyl-β-D-maltosideAppliChemA0819http://www.applichem.com/home/
EDTAAppliChemA2937http://www.applichem.com/home/
Formic acid  AppliChemA3858http://www.applichem.com/home/
HEPESAppliChemA3724http://www.applichem.com/home/
Magnesium chlorideAppliChemA4425http://www.applichem.com/home/
MethanolAppliChemA2954http://www.applichem.com/home/
Phosphorous acidAppliChemA0989http://www.applichem.com/home/
Dipotassium hydrogen phosphate AppliChemA1042http://www.applichem.com/home/
Potassium dihydrogen phosphate AppliChemA1043http://www.applichem.com/home/
Sodium hydroxideAppliChemA1551http://www.applichem.com/home/
SucroseAppliChemA1125http://www.applichem.com/home/
TricineAppliChemA3954http://www.applichem.com/home/
TrisAppliChemA2264http://www.applichem.com/home/
Trypsin (sequencing grade modified) and Trypsin bufferPromegaV5111http://www.promega.de/
Equipment
Nebulizer (BioNeb cell disruptor)Glas-Colhttp://www.glascol.com/product/subproduct/id/75
Centrifuge tubes (14 mm x 89 mm) Beckman Coulter331372for preparation of Takahashi style gradients

http://www.beckmancoulter.de/

Centrifuge tubes 25 mm x 89 mm
Beckman Coulter344058for preparation of thylakoid isolation gradients.

http://www.beckmancoulter.de/

Coulter Avanti Centrifuge J-20 XPBeckman Coulterhttp://www.beckmancoulter.de/
Fuchs-Rosenthal cell couting chamberDiagonal449/72https://www.diagonal.de/
Homogenizer (Potter) 50 ml Fisherbrand10618242http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand
Pistil for homogenizerFisherbrand105252220http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand
Ultracentrifuge (Optima XPN-80 Ultracentrifuge)Beckman Coulterwebsite: http://www.beckmancoulter.de/
Other
Antibodies Agriserahttp://www.agrisera.com/en/index.html

References

  1. Joliot, P., Joliot, A. Cyclic electron flow in C3 plants. Biochim. Biophys. Acta. 1757 (5-6), 362-368 (2006).
  2. Shikanai, T. Cyclic electron transport around photosystem I: genetic approaches. Annu. Rev. Plant Biol. 58, 199-217 (2007).
  3. Finazzi, G., Furia, A., Barbagallo, R. P., Forti, G. State transitions, cyclic and linear electron transport and photophosphorylation in Chlamydomonas reinhardtii. Biochim. Biophys. Acta. 1413 (3), 117-129 (1999).
  4. Tolleter, D., et al. Control of hydrogen photoproduction by the proton gradient generated by cyclic electron flow in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 23 (7), 2619-2630 (2011).
  5. Hertle, A. P., et al. PGRL1 Is the Elusive Ferredoxin-Plastoquinone Reductase in Photosynthetic Cyclic Electron Flow. Mol. Cell. 49 (3), 511-523 (2013).
  6. Terashima, M., et al. Calcium-dependent regulation of cyclic photosynthetic electron transfer by a CAS, ANR1, and PGRL1 complex. PNAS. 109 (43), 17717-17722 (2012).
  7. Iwai, M., Takizawa, K., Tokutsu, R., Okamuro, A., Takahashi, Y., Minagawa, J. Isolation of the elusive supercomplex that drives cyclic electron flow in photosynthesis. Nature. 464 (7292), 1210-1213 (2010).
  8. Chua, N. H., Bennoun, P. Thylakoid Membrane Polypeptides of Chlamydomonas reinhardtii: Wild-Type and Mutant Strains Deficient in Photosystem II Reaction Center. PNAS. 72 (6), 2175-2179 (1975).
  9. Takahashi, H., Iwai, M., Takahashi, Y., Minagawa, J. Identification of the mobile light-harvesting complex II polypeptides for state transitions in Chlamydomonas reinhardtii. PNAS. 103 (2), 477-482 (2006).
  10. Ikeuchi, M., Plumley, F. G., Inoue, Y., Schmidt, G. W. Phosphorylation of Photosystem II Components, CP43 Apoprotein, D1, D2, and 10 to 11 Kilodalton Protein in Chloroplast Thylakoids of Higher Plants. Plant Physiol. 85 (3), 638-642 (1987).
  11. Ruban, A. V., Lee, P. J., Wentworth, M., Young, A. J., Horton, P. Determination of the Stoichiometry and Strength of Binding of Xanthophylls to the Photosystem II Light Harvesting Complexes. J. Biol. Chem. 274 (15), 10458-10465 (1999).
  12. Barera, S., Pagliano, C., Pape, T., Saracco, G., Barber, J. Characterization of PSII-LHCII supercomplexes isolated from pea thylakoid membrane by one-step treatment with α- and β-dodecyl-D-maltoside. Phil. Trans. R. Soc. B. 367 (1608), 3389-3399 (2012).
  13. Kantzilakis, K., et al. A comparative approach towards thylakoid membrane proteome analysis of unicellular green alga Scenedesmus obliquus. Biochim. Biophys. Acta. 1768 (9), 2271-2279 (2007).
  14. Takahashi, Y., Yasui, T., Stauber, E. J., Hippler, M. Comparison of the subunit compositions of the PSI-LHCI supercomplex and the LHCI in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Biochemistry. 43 (24), 7816-7823 (2004).
  15. Thelen, J. J., Peck, S. C. Quantitative proteomics in plants: choices in abundance. Plant Cell. 19 (11), 3339-3346 (2007).
  16. Hsieh, S., et al. The Proteome of Copper, Iron, Zinc, and Manganese Micronutrient Deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. Mol. Cell. Proteom. 12 (1), 65-86 (2013).
  17. Longworth, J., Noirel, J., Pandhal, J., Wright, P. C., Vaidyanathan, S. HILIC- and SCX-based quantitative proteomics of Chlamydomonas reinhardtii during nitrogen starvation induced lipid and carbohydrate accumulation. J. Proteome Res. 11 (12), 5959-5971 (2012).
  18. Malasarn, D., et al. Zinc deficiency impacts CO2 assimilation and disrupts copper homeostasis in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 288 (15), 10672-10683 (2013).
  19. Höhner, R., et al. The metabolic status drives acclimation of iron deficieny responses in Chlamydomonas reinhardtii as revealed by proteomics based hierarchical clustering and reverse genetics. Mol. Cell. , (2013).
  20. Mahong, B., Roytrakul, S., Phaonaklop, N., Wongratana, J., Yokthongwattana, K. Proteomic analysis of a model unicellular green alga, Chlamydomonas reinhardtii, during short-term exposure to irradiance stress reveals significant down regulation of several heat-shock proteins. Planta. 235 (3), 499-511 (2012).
  21. Förster, B., Mathesius, U., Pogson, B. J. Comparative proteomics of high light stress in the model alga Chlamydomonas reinhardtii. Proteomics. 6 (15), 4309-4320 (2006).
  22. Petroutsos, D., et al. The chloroplast calcium sensor CAS is required for photoacclimation in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 23 (8), 2950-2963 (2011).
  23. Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 593-620 (2010).
  24. Nomura, H., Komori, T., Kobori, M., Nakahira, Y., Shiina, T. Evidence for chloroplast control of external Ca2+-induced cytosolic Ca2+ transients and stomatal closure. Plant J. 53 (6), 988-998 (2008).
  25. Weinl, S., et al. A plastid protein crucial for Ca2+-regulated stomatal responses. New Phytol. 179 (3), 675-686 (2008).
  26. Terashima, M., Specht, M., Naumann, B., Hippler, M. Characterizing the anaerobic response of Chlamydomonas reinhardtii by quantitative proteomics. Mol. Cell. Proteomics. 9 (7), 1514-1532 (2010).
  27. Petroutsos, D., et al. PGRL1 participates in iron-induced remodeling of the photosynthetic apparatus and in energy metabolism in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 284 (47), 32770-32781 (2009).
  28. DalCorso, G., et al. A complex containing PGRL1 and PGR5 is involved in the switch between linear and cyclic electron flow in Arabidopsis. Cell. 132 (2), 273-285 (2008).
  29. Redding, K., et al. A systematic survey of conserved histidines in the core subunits of Photosystem I by site-directed mutagenesis reveals the likely axial ligands of P700. EMBO J. 17 (1), 50-60 (1998).
  30. Harris, E. H. . The Chlamydomonas Sourcebook. Introduction to Chlamydomonas and its laboratory use. , (2008).
  31. Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta. 975 (3), 384-394 (1989).
  32. Naumann, B., Stauber, E. J., Busch, A., Sommer, F., Hippler, M. N-terminal processing of Lhca3 Is a key step in remodeling of the photosystem I-light-harvesting complex under iron deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chem. 280 (21), 20431-20441 (2005).
  33. Hippler, M., Klein, J., Fink, a., Allinger, T., Hoerth, P. Towards functional proteomics of membrane protein complexes: analysis of thylakoid membranes from Chlamydomonas reinhardtii. Plant J. 28 (5), 595-606 (2001).
  34. Naumann, B., et al. Comparative quantitative proteomics to investigate the remodeling of bioenergetic pathways under iron deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. Proteomics. 7 (21), 3964-3979 (2007).
  35. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat. Prot. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  36. Specht, M., Kuhlgert, S., Fufezan, C., Hippler, M. Proteomics to go: Proteomatic enables the user-friendly creation of versatile MS/MS data evaluation workflows. Bioinformatics. 27 (8), 1183-1184 (2011).
  37. Geer, L. Y., et al. Open mass spectrometry search algorithm. J. Proteome Res. 3 (5), 958-964 (2004).
  38. Craig, R., Beavis, R. C. TANDEM: matching proteins with tandem mass spectra. Bioinformatics. 20 (9), 1466-1467 (2004).
  39. Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nat. Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
  40. Käll, L., Storey, J. D., Noble, W. S. QVALITY: non-parametric estimation of q-values and posterior error probabilities. Bioinformatics. 25 (7), 964-966 (2009).
  41. Wollman, F. A., Bennoun, P. A new chlorophyll-protein complex related to photosystem I in Chlamydomonas reinhardtii. Biochim. Biophys. Acta. 680, 352-360 (1982).
  42. Bailey, S., et al. A critical role for the Var2 FtsH homologue of Arabidopsis thaliana in the photosystem II repair cycle in vivo. J. Biol. Chem. 277 (3), 2006-2011 (2002).
  43. Kato, Y., Sakamoto, W. Protein quality control in chloroplasts: a current model of D1 protein degradation in the photosystem II repair cycle. J. Biochem. 146 (4), 463-469 (2009).
  44. Meurer, J., Plücken, H., Kowallik, K. V., Westhoff, P. A nuclear-encoded protein of prokaryotic origin is essential for the stability of photosystem II in Arabidopsis thaliana. EMBO J. 17 (18), 5286-5297 (1998).
  45. Kuras, R., Wollman, F. A. The assembly of cytochrome b6/f complexes: an approach using genetic transformation of the green alga Chlamydomonas reinhardtii. EMBO J. 13 (5), 1019-1027 (1994).
  46. de Vitry, C., Finazzi, G., Baymann, F., Kallas, T. Analysis of the nucleus-encoded and chloroplast-targeted rieske protein by classic and site-directed mutagenesis of Chlamydomonas. Plant Cell. 11 (10), 2031-2044 (1999).
  47. Hamel, P., Olive, J., Pierre, Y., Wollman, F. A., de Vitry, C. A new subunit of cytochrome b6f complex undergoes reversible phosphorylation upon state transition. J. Biol. Chem. 275 (22), 17072-17079 (2000).
  48. Stanislas, T., et al. Quantitative proteomics reveals a dynamic association of proteins to detergent-resistant membranes upon elicitor signaling in tobacco. Mol. Cell. Proteomics. 8 (9), 2186-2198 (2009).
  49. Atteia, A., et al. A proteomic survey of Chlamydomonas reinhardtii mitochondria sheds new light on the metabolic plasticity of the organelle and on the nature of the alpha-proteobacterial mitochondrial ancestor. Mol. Biol. Evol. 26 (7), 1533-1548 (2009).
  50. Pagliano, C., Barera, S., Chimirri, F., Saracco, G., Barber, J. Comparison of the α and β isomeric forms of the detergent n-dodecyl-D-maltoside for solubilizing photosynthetic complexes from pea thylakoid membranes. Biochim. Biophys. Acta. 1817 (8), 1506-1515 (2012).
  51. Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Methods. 6 (5), 3-7 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

85 multiprotein 15 N thylakoids

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved