Une nouvelle approche pour l&#39;analyse comparative des complexes multiprotéiques Basé sur<sup&gt; 15</sup&gt; N Marquage métabolique et spectrométrie de masse quantitative

Résumé

L'approche décrite comparative, protéomique quantitative vise à obtenir un aperçu de la composition de complexes multiprotéiques dans des conditions différentes et est démontrée en comparant différentes souches génétiquement. Pour l'analyse quantitative des volumes égaux de fractions différentes d'un gradient de densité de saccharose sont mélangés et analysés par spectrométrie de masse.

Résumé

Le protocole mis en place un outil pour l'analyse des complexes multiprotéiques dans la membrane des thylakoïdes, en révélant un aperçu de la composition complexe dans des conditions différentes. Dans ce protocole, l'approche est démontrée en comparant la composition de la protéine complexe responsable de flux d'électrons cyclique (CEF) dans Chlamydomonas reinhardtii, isolé à partir de différentes souches génétiquement. Le procédé comprend l'isolement de membranes thylacoïdes, suivi de leur séparation dans des complexes multiprotéiques par le saccharose centrifugation à gradient de densité, SDS-PAGE, immunodétection et comparative, la spectrométrie de masse quantitative (MS) sur la base de marquage métabolique différentiel ⁽¹⁴ N / ¹⁵ N) de l' souches analysées. Membranes thylacoïdes solubilisées détergents sont chargés sur des gradients de densité de saccharose à une concentration de chlorophylle égal. Après ultracentrifugation, les gradients sont séparées en fractions, qui sont analysés en masse-spectrometry basé sur le volume égal. Cette approche permet l'étude de la composition dans les fractions de gradient, les analyser le comportement de migration des protéines différentes, notamment en se concentrant sur ANR1, CAS, et PGRL1. De plus, cette méthode est démontrée en confirmant les résultats immuno et, en outre, en soutenant les conclusions des études précédentes (l'identification et la migration de PSI-dépendante des protéines qui ont été précédemment décrits comme faisant partie de la FEC-supercomplexe comme PGRL1, FNR, et cyt f). Notamment, cette approche est applicable à traiter un large éventail de questions pour lesquelles ce protocole peut être adopté et utilisé par exemple pour des analyses comparatives de composition complexe multiprotéique isolé des conditions environnementales distinctes.

Introduction

processus de photosynthèse dans les membranes des thylakoïdes de plantes et d'algues peuvent fonctionner en mode linéaire et cyclique. Au cours de l'écoulement linéaire d'électrons (LEF) de photosystème I (PSI), photosystème II (PSII) et le cytochrome b ₆ / f finalement transférer des électrons de l'eau à NADP + ^1, conduisant à la génération de NADPH et ATP ^2. En revanche, le flux d'électrons cyclique (CEC), qui est connu pour être induit dans des conditions d'environnement variées telles que des conditions d'état 2 ³ et anaérobies ^4, les résultats de la re-réduction de l'ISP oxydé par l'injection d'électrons dans la chaîne de transport d'électrons. Ce processus peut avoir lieu soit sur ​​le côté du stroma de la cytochrome b ₆ / f complexe ¹ ou à la piscine de plastoquinone ⁵ et génère de l'ATP, mais pas de la NADPH ^2.

L'objectif du protocole est de démontrer présenté une spectrométrie de masse (MS) sur la base de méthode pour l'analyse comparative, quantitative des complexes multiprotéiques dans les membranes des thylakoïdes de Chlamydomonas reinhardtii de mieux comprendre la composition de ces complexes dans des conditions différentes (illustrés en comparant différentes souches génétiquement). Cette approche a été appliquée dans une publication de Terashima et al., En 2012 montrant une Ca ^{2 +} régulation dépendant de CEF dans C. reinhardtii médiée par un complexe multiprotéique comprenant les protéines CAS, ANR1, et PGRL1 ^6. La procédure sera expliquée par analyse comparative de la composition de la CEC-supercomplexe dans deux souches génétiquement différentes, profitant ainsi de l'étiquetage une des deux souches avec de l'azote lourd ⁽¹⁵ N). Brièvement, le protocole comprend la préparation de membranes thylacoïdes, suivie d'une solubilisation du détergent et le fractionnement de complexes photosynthétiques dans un gradient de densité de saccharose. Après fractionnement du gradient, choisi fractions de deux souches sont mélangées à base de volume égal, séparées par SDS-PAGE suivie d'une digestion in-gel et l'analyse quantitative subséquente de la sclérose en plaques.

Comme mentionné ci-dessus, CEF est induite dans différentes conditions environnementales et une publication à partir de 2010 démontre l'isolement d'un CEF-supercomplexe fonctionnelle de l'état 2 cellules verrouillées de C. reinhardtii ^7, qui a été réalisée par des membranes de séparation thylacoïdiennes solubilisées sur un gradient de densité de sucrose pendant ultracentrifugation. Différent de Iwai et al. ^7, le protocole présenté décrit l'isolement de la CEC-supercomplexe cultivé en anaérobiose à partir de C. cultures reinhardtii en suivant une procédure alternative. Celui-ci comprend des changements dans le protocole d'isolement thylacoïdes ainsi que les différences concernant l'étape de solubilisation et la séparation des complexes protéiques par ultracentrifugation. Dans le présent protocole, les membranes des thylakoïdessont isolées en appliquant le mode opératoire publié par Chua et Bennoun ^8, tandis que les tampons utilisés pour la préparation des thylakoïdes par Iwai et al. contenue 25 Mes mM, 0,33 M de saccharose, 5 mM de _MgCl2, NaCl 1,5 mM (pH 6,5) comme décrit ^9. La solubilisation a été effectuée avec de 0,7 à 0,8% de détergent (n-tridécyl-β-D-maltoside) pendant 30 min sur de la glace dans le cas d'Iwai et collaborateurs, tandis que la méthode de solubilisation décrit ici repose sur l'utilisation de 0,9% de détergent (n -dodécyl-β-D-maltoside (β-DM)) et est effectuée pour seulement 20 min sur la glace. Les deux groupes ont utilisé 0,8 mg de chlorophylle par ml pour la solubilisation avec le détergent respectif. Pour la séparation de complexes à partir de membranes photosynthétiques des thylacoïdes solubilisées Iwai et al. Appliqué entre les concentrations de saccharose de 0,1 à 1,3 M, tandis que les auteurs de ce protocole utilise des concentrations allant de 0,4 à 1,3 M. La dernière différence est la vitesse de centrifugation, ce qui est faible par rapport à l'eapublication rlier.

Solubilisation des membranes thylacoïdes avec des détergents non ioniques suivie d'un fractionnement gradient de densité de saccharose a déjà été utilisée dans de nombreuses études, allant des années 1980 jusqu'à aujourd'hui, ^{7, 9 à 14} et également à l'application de marquage métabolique des protéines est un procédé très répandu dans le domaine de la protéomique. La méthode décrite s'applique à l'étiquetage ¹⁵ N métabolique pour l'une des deux souches comparées par la mise en culture en présence d'azote lourd comme seule source d'azote sous la forme de ¹⁵ N NH ₄ Cl, qui est incorporée dans tous les acides aminés conduisant à une masse décaler en fonction de la séquence d'acides aminés du peptide. Lors de l'analyse d'un mélange de ¹⁴ N et ¹⁵ N à l'intérieur une MS exécuté, ce changement de masse peut être utilisée pour déterminer l'origine de l'échantillon pour chaque peptide et le peptide parent abondances peuvent être calculées représentant les abondances relatives pour l'correspondentment ¹⁵ protéine.

De nombreuses études protéomiques quantitatives sur C. reinhardtii sont disponibles, qui permettent de comparer une quantité définie de protéines pour analyser les changements dans le protéome entre les conditions expérimentales (par exemple, les changements dans le protéome en raison de nutriments ^16-19 ou lumière le stress ^20,21). Par rapport à ces études, l'approche a présenté des volumes égaux d'échantillons sont combinés et analysés. Cette configuration permet d'étudier le comportement de migration des protéines dans le gradient et en outre à analyser la composition des différents complexes en ce qui concerne les souches étudiées.

Cette méthode sera expliquée en se concentrant principalement sur ​​trois protéines: Le premier candidat est la protéine de capteur calcium CAS chloroplastique-localisé, qui a été montré être impliqué dans le photo-acclimatation en C. reinhardtii ^22. Le calcium est considéré comme un signal importantment ion pour les voies qui sont activés en raison de différentes contraintes biotiques et abiotiques conduisant finalement à des changements dans l'expression des gènes et la physiologie des cellules ²³ et il a été proposé que les chloroplastes pourraient contribuer à Ca ^{2 +} cellulaire signalisation via la protéine CAS ^22,24,25. La seconde protéine est ANR1 (réponse anaérobie 1 ^6), une protéine qui a été montré être induite dans des conditions anoxiques dans la croissance de C. reinhardtii ^26. Notamment, CAS ainsi que ANR1 ont été identifiés comme sous-unités du CEF-supercomplexe et ailleurs, en utilisant des approches de génétique inverse, il a été démontré que les deux protéines contribuent fonctionnellement au CEF in vivo ^6, en soutenant leur rôle en tant que sous-unités fonctionnelles de ce complexe protéique. La troisième protéine est la protéine thylakoid PGR5-Like 1 (PGRL1), qui a été montré pour être impliqués dans le CECR dans Chlamydomonas ^4,27 ainsi que chez Arabidopsis ^5,28 et était aussi identified dans le travail de Iwai et al. ⁷

Cette approche sera présentée en montrant les résultats de deux expériences différentes: type sauvage (WT) versus (vs) une souche ΔPSI ^29, présentant une délétion du gène du CCSP, codant pour une sous-unité du photosystème essentiel je, qui fait également partie de la CEF-supercomplexe et WT vs un pgrl1 knock-out souche ^4. Pour chacune de ces expériences, la composition quantitative de la CEC-supercomplexe entre un ^N-15 et une souche ¹⁴ N-marqué a été comparé.

Protocole

Une. La culture de Chlamydomonas

1. Le C après reinhardtii souches ont été utilisées dans la présente étude: WT cc124, WT CW15-arg7 (paroi cellulaire auxotroph déficiente et l'arginine), une souche mutante ΔPSI ²⁹ et un pgrl1 knock-out souche ^4.
2. Toutes les souches ont été cultivées dans du Tris-Acétate-Phosphate (TAP)-support ^30, à 25 ° C avec une intensité de la lumière continue de 20 à 50 uE / m ² s et en agitant à 120 rpm. La culture de ΔPSI doit être enveloppé avec du papier de soie pour exposition à la lumière de <5 uE / m ² sec.
3. Les cultures de souches marquées (ΔPSI et WT cc124, respectivement) contenaient 7,5 mM ¹⁵ N NH ₄ Cl, alors que les cultures pour les souches non marquées (WT CW15-Arg7 et pgrl1, respectivement) contenaient 7,5 mM ¹⁴ N NH ₄ Cl. Les cellules ont à se développer pendant au moins quatre generations pour réaliser un étiquetage complet et doivent être conservés à la phase de croissance exponentielle.
4. Le jour avant le début de l'expérience et compte diluer les cellules à une densité de 1 x 10 ⁶ cellules / ml dans un volume d'au moins 750 ml / souche.

S'il vous plaît noter que les deux types de gradients discontinus de densité de sucrose sont décrites dans le protocole suivant. Les gradients de densité photosystème de saccharose selon Takahashi et al. ⁹ sont utilisés pour séparer les différents complexes de protéines de photosynthèse de thylakoïdes isolés et solubilisées pendant toute une nuit centrifugation et être préparé la veille (voir protocole n ° 2) et les thylacoïdes gradients de densité de sucrose ⁸ sont appliquées dans la procédure d'isolement thylakoid (voir protocole n ° 3).

2. Préparation du photosystème saccharose gradients de densité

1. Pour verser les gradients trois solutions mères sont nécessaires:
   1. 2 M de saccharose
   2. Β-DM 10% en H ₂ O
   3. Tricine 0,5 M, pH 8,0 (NaOH)
2. Grâce à ces actions, préparer les solutions suivantes:

   Concentration:	1,3 M	1,0 M	0,85 M	0,7 M	0,65 M	0,4 M
   2 M de saccharose	13 ml	10 ml	8,5 ml	7 ml	6,5 ml	4 ml
   10%46;-DM	100 pl	100 pl	100 pl	100 pl	100 pl	100 pl
   0,5 M Tricine	200 pl	200 pl	200 pl	200 pl	200 pl	200 pl
   H 2 O	6,7 ml	9,7 ml	11,2 ml	12,7 ml	13,2 ml	15,7 ml

3. Utiliser des tubes x 89 mm à centrifuger de 14 mm et verser les gradients très lentement, en commençant par la solution la plus élevée de la densité de saccharose de la solution de plus faible densité.
4. Verser seulement 1 ml chacun pour les solutions 1.3 et 1.0 M et 2 ml pour le reste des solutions.
5. Laisser gradients pendant une nuit en chambre froide.

3. Anaérobie induction et isolement de Thylakoid membranes ⁸

1. Avant de commencer l'isolation des membranes thylacoïdes, induire des conditions anaérobies en faisant barboter de l'argon pendant 4 heures. Le bullage peut être réalisé au moyen d'une pipette de verre dans la mise en culture des flacons sous agitation constante de la culture avec un barreau d'agitation magnétique.
2. Commencez par l'isolement des membranes thylakoïdes par granulation des cellules pendant 5 min à 2500 xg, remettre en suspension dans un tampon H1 (0,3 M de saccharose, 25 mM HEPES (pH 7,5), _MgCl2 5 mM).
   (S'il vous plaît noter que lors du démarrage de l'isolement des échantillons de membranes thylacoïdes should être conservé dans la glace pour éviter la dégradation des protéines, toutes les étapes de centrifugation sont effectuées à 4 ° C et de travailler avec des gants est fortement recommandé pour éviter la contamination de la kératine.)
3. Cellules à granules pendant 5 min à 2500 xg, remettre en suspension dans un tampon H1.
4. Rompre les cellules par deux passages à travers un nébuliseur avec une pression d'azote de 1500 hPa (pour les souches sans paroi cellulaire ne faire qu'un seul passage).
5. Isoler les cellules pour 7 min à 2500 x g.
   (Après cette étape, le surnageant doit être vert clair, sinon, la rupture des cellules n'a pas été couronnée de succès.)
6. Resuspendre les cellules dans un tampon H2 (0,3 M sucrose, 5 mM de HEPES (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0)) et un culot de cellules pendant 10 min à 32 800 x g.
7. Resuspendre les cellules dans un tampon H3 (1,8 M sucrose, 5 mM de HEPES (pH 7,5), 10 mM d'EDTA (pH 8,0)) et homogénéiser culot avec un potter (pas de particules vertes doivent rester à la fin de cette étape de travail).
8. Préparer thylacoïdiennes gradients de densité de saccharose dans la baignoirees (25 mm x 89 mm) en commençant par le bas avec une couche de 12 ml H3 tampon avec des cellules, verser une couche médiane de 12 ml de tampon de H4 (1,3 M sucrose, 5 mM de HEPES (pH 7,5), 10 mM d'EDTA ( pH 8,0)) et 12 ml de tampon en haut H5 (0,5 M sucrose, 5 mM de HEPES (pH 7,5), 10 mM d'EDTA (pH 8,0)). Soyez prudent lorsque l'on verse les gradients et d'éviter le mélange des trois couches.
9. Équilibre avec tampon H5 et centrifugeuses thylacoïdiennes gradients de densité de sucrose pendant 1 heure à 70 700 x g.
10. Retirer les bandes de thylacoïdes des thylacoïdes des gradients de densité de saccharose et les diluer avec un volume de tampon approprié H6 (HEPES 5 mM (pH 7,5), 10 mM d'EDTA (pH 8,0)).
11. Isoler les cellules à 37 900 g pendant 20 min. Si la pastille n'est pas étanche, de plus un tampon de H6 est nécessaire pour cette étape de centrifugation.
12. Remettre en suspension dans un tampon thylakoïdes H6 de petit volume et de procéder à la détermination de la concentration en chlorophylle.

4. Détermination de la chlorophylle Concentration ³¹

1. La détermination de la quantité de chlorophylle est effectuée avec 80% d'acétone.
2. Mélanger 995 pi 80% d'acétone et 5 pi de thylakoïdes dans un tampon H6 (dilution 1:200).
3. Vortex pendant quelques secondes jusqu'à ce que aucun des particules vertes restent puis ralentissent à 14,1 g pendant 5 min.
4. Prenez le surnageant et mesurer l'extinction à 663,6 et 646,6 nm et 750 nm, respectivement.
5. Calculer la quantité de chlorophylle selon les formules suivantes:
   1. C _{Chl a} [mg / ml] = (0,01225 * E _{663,6 à} 0,00255 * E _646,6) * facteur de dilution
   2. C _{Chl b} [mg / ml] = (0,02031 * E _{646,6 à} 0,00491 * E _663,6) * facteur de dilution
   3. C _Chl [mg / ml] = C _{Chl a} + C _{Chl b}

5. Chargement de photosystème saccharose gradients de densité

1. Calculer les montants des thylakoïdes, β-DM et tampon H6 qui sont nécessairespour chaque gradient:
   1. Chaque gradient doit être chargé avec un volume total de 700 ul de 0,8 mg / ml chlorophylle dans β-DM 0,9% (dissoudre β-DM à H ₂ O), remplir le volume restant avec du tampon H6.
2. Pour solubilisation préparer différents prélèvements avec thylakoïdes, β-DM et tampon H6 pour chaque gradient.
3. Laisser les échantillons pendant 20 minutes sur la glace avec le mélange régulièrement (inversion) toutes les quelques minutes (étape de solubilisation).
4. Centrifuger à vitesse maximale (14 000 xg) pendant 10 min à 4 ° C.
   (Après centrifugation, le culot doit être petit et blanchâtre tandis que le surnageant est vert foncé.)
5. Chargez surnageant sur les gradients.
6. Équilibre avec tampon H6 et tourner à l'aide d'ultracentrifugation à 134 470 xg pendant la nuit (14 h) à 4 ° C.
   (S'il vous plaît noter que la séparation réussie de complexes photosynthétiques utilisant des gradients de densité de saccharose photosystème tel que présenté dans ce protocole n'est atteint que si using thylakoïdes fraîchement isolées, car une prédiction pour la solubilisation et la séparation complexe est difficile à faire lorsque l'on travaille avec les membranes des thylakoïdes qui ont été congelés avant.)

6. Fractionnement de photosystème saccharose gradients de densité

1. Prenez des photos des gradients.
2. Percer un trou au fond du tube en utilisant une aiguille et fractionner les gradients dans les tubes 500 ul. En variante, le fractionnement peut également être effectuée en utilisant une plaque à 96 puits (microplaques).
3. Lors de l'utilisation d'une microplaque, déterminer l'absorbance des différentes fractions de gradient à 675 nm.
   (A ce stade des échantillons peuvent être stockés à -80 ° C pendant quelques semaines.)

7. SDS-PAGE et Immunodétection

(S'il vous plaît noter que seulement pour la comparaison des WT vs ΔPSI une analyse Western blot a été réalisée pour sélectionner les fractions pour MS-analyse ultérieure. Pour l'expérience WT vs pgrl1 fractions ont été choisis au moyen de l'absorbance dans les différentes fractions.)

1. Séparer 30 ul de chaque fraction de WT et ΔPSI gradient sur ​​un gel de polyacrylamide SDS 13% ^32.
2. Effectuer l'analyse western blot ³³ utilisant les anticorps suivants: ANR1 (TEF7) ^26, PGRL1 ^34, CAS ^6, la sous-unité d'psad PSI ³² et le noyau sous-unité D1 PSII. Utiliser tous les anticorps à une dilution de 1:1000 (pour une meilleure technique de détection par chimiluminescence), à ​​l'exception de l'anticorps D1, qui doit être utilisé avec une dilution de 1:10000.
3. Sur la base des résultats de l'immunodétection, prendre les fractions des pics de ANR1, PGRL1 et PSAD pour WT et ΔPSI (ici fractions 6 et 13, respectivement), mélanger 30 ul de la fraction 6 de WT et ΔPSI et faire la même chose avec la fraction 13 de les deux préparations et les séparent de nouveau sur un gel de polyacrylamide-SDS 13%.
4. Pour la comparaison quantitative de WT vs pgrl1 prendre la Cfractions EF-supercomplexe tel que déterminé par mesure de l'absorbance dans les différentes fractions du gradient et mélanger 30 ul de deux échantillons, suivie d'une séparation sur un gel SDS de polyacrylamide 13%.
5. Colorer les bandes de protéines avec une solution de Coomassie (acide phosphoreux à 85%, sulfate d'ammonium 757 mM, 1,2% de bleu brillant de Coomassie, 20% de methanol) pendant 2 h à la température ambiante ou pendant une nuit à 4 ° C.
6. Pour supprimer la coloration non spécifique, lavez-les plusieurs fois avec le trou DDH ₂ O.
7. Couper les voies en 1 mm morceaux de gel et de procéder à la digestion dans le gel.
   (En variante, des échantillons peuvent être séchés quelques minutes dans une centrifugeuse sous vide et conservés pendant quelques semaines avant de poursuivre la digestion in-gel).

8. Digestion dans le gel (modification de Shevchenko et al. ³⁵⁾

S'il vous plaît noter pour préparer tous les tampons et les solutions peu avant utilisation et de prendre des bouteilles en verre pour les tampons contenant de l'acétonitrile (ACN).
ATTENTION! Travailler avec ACN pourrait être nuisible; plus d'informations peut être téléchargé à partir de: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927335 (2013).

1. Laver les morceaux de gel avec> 10 volumes de trou DDH ₂ O (~ 200 ul) pendant 30 sec.
2. Incuber les morceaux de gel avec 300 ul de 25 mM de NH ₄ HCO ₃ pour 15 min avec agitation par secousses, éliminer le liquide.
3. Incuber les morceaux de gel avec 300 ul de 25 mM de NH ₄ HCO ₃ dans 50% d'ACN (préparer par mélange ACN et 50 mM de NH ₄ HCO ₃ dans un rapport de 1:1) pendant 15 min sous agitation, éliminer le liquide.
4. Si les morceaux de gel sont encore bleu, répéter le NH ₄ HCO ₃ et NH ₄ HCO ₃ / ACN lave jusqu'à ce que la majeure partie du Coomassie est enlevé.
   (Bien que la majeure partie de la coloration au bleu de Coomassie doit être retiré, il n'est pas nécessaire de décolorer les morceaux de gel complètement.)
5. Ajouter 100 pi d'ACN pour déshydrater les morceaux de gel pendant 5 min. Les morceaux de gel devraient réduire unee l'air complètement blanc.
6. Retirer autant que possible ACN et procéder à digestion par la trypsine. En variante, les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C pendant quelques semaines.
7. Ajouter 10-20 pi par groupe de 20 ng / ul de trypsine dans 10% ACN / 25 mM NH ₄ HCO ₃ (fraîchement diluée), garder les échantillons sur la glace.
8. Après 30 min, vérifier si tous solution a été absorbée et ajouter davantage de tampon de la trypsine, si nécessaire. Les morceaux de gel doivent être complètement recouvertes avec du tampon de trypsine. Conserver les échantillons sur la glace.
9. Ajouter des morceaux de gel pendant 90 min sur la glace pour les saturer avec de la trypsine.
   (Étape critique: le rendement en peptides tryptiques augmente considérablement avec l'augmentation des temps d'incubation sur de la glace, probablement en raison de la lente diffusion de l'enzyme dans la matrice de polyacrylamide Il est nécessaire d'avoir un léger excès de solution recouvrant les morceaux de gel pour éviter que les morceaux. tomber à sec pendant la nuit d'incubation.)
10. Digérer à 37 ° C pendant 4-6 heures. Pour les expériences nécessitantrécupération de peptide maximal, digérer pendant une nuit.
11. Après digestion spin down tampon condensée.
12. Tubes ultrasons pendant 5 min à éluer les peptides et centrifuger à nouveau.
13. Recueillir le surnageant et le transférer dans un nouveau tube.
14. Procéder à l'extraction de peptide avec 80 pl de / 30% d'acide ACN 1% formique (FA) dans un bain sonique pendant 15 min.
15. Procéder à l'extraction avec 80 ul de 30% ACN / 1% FA dans un bain sonique pendant 15 min.
16. Procéder à l'extraction avec 80 ul de 70% ACN / 1% FA dans un bain sonique pendant 15 min.
17. Centrifuger à nouveau et la piscine surnageant avec l'éluat avant.
    (FA sert pour inactiver la trypsine et d'augmenter la solubilité du peptide.)
18. Solution de peptide complètement à sec dans une centrifugeuse sous vide.
    (À ce stade échantillons peuvent être conservés pendant quelques semaines à -20 ° C avant de procéder à MS-analyse.)
19. Resuspendre les peptides à 6 ul de tampon SM (5% d'ACN, 0,1 v / v FA, de l'eau) et le produit de sonication pendant 2-5 min.
20. Centrifuger les échantillons à maximuvitesse de m pendant 5 minutes pour éliminer la matière particulaire.
21. Utilisation 4 ul de surnageant pour l'analyse par spectrométrie de masse.

9. MS-Analyse des données avec "Proteomatic"

L'analyse des données a été réalisée avec le logiciel open-source "Proteomatic" (qui peut être téléchargé à http://www.proteomatic.org/), une plate-forme qui permet la production et la réalisation de MS / MS pipelines d'évaluation des données, à l'aide libre et commerciale des logiciels ^36. En bref, les paramètres sont décrits ci-dessous et des informations plus détaillées peuvent être trouvées dans ^6,26.

1. Identification et la quantification de MS-données
   L'identification et la quantification de protéines à partir de l'expérimentation par rapport à WT ΔPSI ont été effectuées avec ASSMO (version 2.1.4 ³⁷⁾ et qTrace ^26, respectivement, comme décrit ^6,26. Pour l'analyse MS-données à partir de l'expérience WT vs pgrl1 la canalisation de mise à jour suivant a été utilisé:
   1. En plus de ASSMO ^37, les protéines ont été identifiées avec X! Tandem (version 1.2.2013 ^38). Les deux algorithmes ont été appliqués par la recherche contre une base de données généré par la combinaison de la version JGI Chlamydomonas de base de données de modèle de gène 4.3 avec la version de base de données AUGUSTE 10.2 ainsi que contre une base de données joint du NCBI bases de données BK000554.2 et NC_001638.1.
   2. MS ² identification de peptides a été effectuée en utilisant une approche cible leurre ^39. Un leurre pour chaque protéine a été créée en mélangeant au hasard peptides tryptiques, tout en conservant la redondance des peptides nonproteotypic.
   3. Validation statistique des peptides a été effectuée avec le qvality de logiciel (version 0.3.3 ⁴⁰⁾ en utilisant une probabilité d'erreur postérieur (PEP) de seuil inférieure à 0,01, et les résultats ont été filtrés avec un précurseur de la tolérance de masse de 5 ppm.
   4. Peptides de ASSMO et X! Tandem pistes ont été rejoints et quantifiés avec qTrace ^{26 appliquant les étapes de filtres suivants: MS 2 exigent l'identification, ajoutez les noms de protéines / informations de groupe et exigent deux peptides sœurs.}

Afin de déterminer si les rapports de protéines étaient significativement différents l'un vers l'autre dans les fractions de CEF-supercomplexe mixtes de WT et pgrl1, l'analyse statistique a été effectuée l'application de la SPSS de logiciel (version 21). Les sous-unités du complexe cytochrome b ₆ / f ont été testés contre l'autre ainsi que les protéines FNR, FTSH2 et HCF136 contre les sous-unités de l'ISP. Les rapports de chaque compte de balayage par la protéine de quatre répétitions de peptides ont été testés pour la distribution normale avec le test de Shapiro-Wilks. Comme les populations de peptides n'étaient pas normalement distribuées (p <0,001), les statistiques non paramétriques ont été effectuées. Tout d'abord, le test de Kruskal-Wallis a été appliqué l'évaluation d'une divergence significative entre les groupes. Seulement si ce test prédit différence significatives entre les groupes, une analyse a été effectuée pour prédire des différences significatives entre les deux groupes indépendants avec le Mann-Whitney U test.

Résultats

L'approche de protéomique quantitative introduit vise à caractériser la composition de complexes multiprotéiques dans les membranes des thylakoïdes démontré par l'analyse comparative des composants CEF-supercomplexe dans génétiquement différente C. reinhardtii souches. La méthode décrite a été appliquée avec succès par Terashima et al. ⁶ et comprend l'isolement des membranes thylacoïdes de anaérobies grandi cultures, suivis par solubilisation avec un détergent....

Discussion

Différentes études protéomiques quantitatives utilisant stable marquage isotopique ont été publiées dans les dernières années. Dans ces expériences, généralement de deux échantillons différents sont comparés, dont un échantillon est marqué avec un isotope stable. Par la suite, des protéines ou des peptides à partir des deux échantillons sont combinés dans un rapport égal, et en outre ⁴⁸ traitées ensemble. Ces études ont l'intention souvent comparer compartiments définis isolés cel...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Acetic acid	AppliChem	A0662	http://www.applichem.com/home/
Acetone	AppliChem	A2300	http://www.applichem.com/home/
Acetonitrile Optigrade für LC-MS	Diagonal	9340	Harmful, work with gloves. See protocol text for further precautions. https://www.diagonal.de/
Ammonium chloride 15N	Cambridge Isotope Laboratories	39466-62-1	http://www.isotope.com/cil/index.cfm
Ammonium chloride 14N	AppliChem	A0988	http://www.applichem.com/home/
Ammonium hydrogen phosphate	AppliChem	A3583	http://www.applichem.com/home/
Ammonium sulfate	AppliChem	A3598	http://www.applichem.com/home/
Coomassie brilliant blue R-250	Fisher Scientific	10041653	http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex
n-Dodecyl-β-D-maltoside	AppliChem	A0819	http://www.applichem.com/home/
EDTA	AppliChem	A2937	http://www.applichem.com/home/
Formic acid	AppliChem	A3858	http://www.applichem.com/home/
HEPES	AppliChem	A3724	http://www.applichem.com/home/
Magnesium chloride	AppliChem	A4425	http://www.applichem.com/home/
Methanol	AppliChem	A2954	http://www.applichem.com/home/
Phosphorous acid	AppliChem	A0989	http://www.applichem.com/home/
Dipotassium hydrogen phosphate	AppliChem	A1042	http://www.applichem.com/home/
Potassium dihydrogen phosphate	AppliChem	A1043	http://www.applichem.com/home/
Sodium hydroxide	AppliChem	A1551	http://www.applichem.com/home/
Sucrose	AppliChem	A1125	http://www.applichem.com/home/
Tricine	AppliChem	A3954	http://www.applichem.com/home/
Tris	AppliChem	A2264	http://www.applichem.com/home/
Trypsin (sequencing grade modified) and Trypsin buffer	Promega	V5111	http://www.promega.de/
Equipment
Nebulizer (BioNeb cell disruptor)	Glas-Col		http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75
Centrifuge tubes (14 mm x 89 mm)	Beckman Coulter	331372	for preparation of Takahashi style gradients http://www.beckmancoulter.de/
Centrifuge tubes 25 mm x 89 mm	Beckman Coulter	344058	for preparation of thylakoid isolation gradients. http://www.beckmancoulter.de/
Coulter Avanti Centrifuge J-20 XP	Beckman Coulter		http://www.beckmancoulter.de/
Fuchs-Rosenthal cell couting chamber	Diagonal	449/72	https://www.diagonal.de/
Homogenizer (Potter) 50 ml	Fisherbrand	10618242	http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand
Pistil for homogenizer	Fisherbrand	105252220	http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand
Ultracentrifuge (Optima XPN-80 Ultracentrifuge)	Beckman Coulter		website: http://www.beckmancoulter.de/
Other
Antibodies	Agrisera		http://www.agrisera.com/en/index.html