Ein neuer Ansatz für die vergleichende Analyse von Multiproteinkomplexen Basierend auf<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolische Markierung und quantitative Massenspektrometrie

Zusammenfassung

Die beschriebenen Vergleichs, quantitative Proteomik-Ansatz zielt auf die Erlangung Einblicke in die Zusammensetzung von Multiproteinkomplexen unter verschiedenen Bedingungen und wird durch den Vergleich genetisch verschiedenen Stämmen nachgewiesen. Für die quantitative Analyse gleichen Volumina verschiedener Fraktionen aus einem Saccharose-Dichtegradienten durch Massenspektrometrie vermischt und analysiert.

Zusammenfassung

Das eingeführte Protokoll bietet ein Tool für die Analyse von Multiproteinkomplexen in der Thylakoidmembran, durch aufschlussreiche Einblicke in die komplexe Zusammensetzung unter verschiedenen Bedingungen. In diesem Protokoll wird der Ansatz durch den Vergleich der Zusammensetzung des Proteins für den zyklischen Elektronenfluss (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isoliert aus genetisch unterschiedlichen Stämmen Komplex verantwortlich demonstriert. Das Verfahren umfasst die Isolierung von Thylakoidmembranen, gefolgt von der Trennung in die Multiproteinkomplexen durch Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation, SDS-PAGE, und Immunodetektion vergleichende quantitative Massenspektrometrie (MS) basierend auf Differenzial metabolische Markierung ⁽¹⁴ N / ¹⁵ N) des Stämme analysiert. Waschmittel solubilisierten Thylakoidmembranen auf Saccharose-Dichtegradienten in gleichen Chlorophyllkonzentration geladen. Nach Ultrazentrifugation werden die Gradienten in Fraktionen, die durch Massen spectromet analysiert werden getrenntry zu gleichen Volumen. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung der Zusammensetzung innerhalb der Gradientenfraktionen und darüber hinaus, um das Migrationsverhalten verschiedener Proteine ​​zu analysieren, vor allem die Konzentration auf ANR1, CAS und PGRL1. Außerdem ist dieses Verfahren durch die Bestätigung der Ergebnisse mit Immunoblotting und zusätzlich, indem sie die Ergebnisse aus früheren Studien (die Identifizierung und PSI-abhängigen Migration der Proteine, die zuvor beschrieben wurden, einen Teil der CEF-Superkomplex wie PGRL1 FNR sein und zeigte cyt f). Bemerkenswert ist, ist dieser Ansatz für eine breite Palette von Fragen, auf die dieses Protokoll verabschiedet werden kann und beispielsweise für vergleichende Analysen von Multi komplexe Zusammensetzung aus unterschiedlichen Umgebungsbedingungen eingesetzt isoliert anzugehen.

Einleitung

Photosyntheseprozesse Thylakoidmembran von Pflanzen und Algen in einer linearen und cyclischen Modus. Während der linearen Elektronenfluss (LEF) Photosystem I (PSI), Photosystem II (PSII) und Cytochrom b ₆ / f letztlich Elektronen übertragen von Wasser zu NADP + ^1, was zu der Erzeugung von NADPH und ATP ^2. Im Gegensatz dazu zyklischen Elektronenfluss (CEF), die bekannt ist, um unter verschiedenen Umgebungsbedingungen, wie der Zustand 2 ³ und ⁴ anaeroben Bedingungen, Ergebnisse in der Rückreduktion des oxidierten PSI durch Injizieren von Elektronen in die Elektronentransportkette induziert werden. Dieser Prozess kann entweder an der Stroma-Seite des Cytochrom b ₆ / f-Komplex ¹ oder am Pool Plastochinons ⁵ finden kann und erzeugt ATP, aber kein NADPH ^2.

Das Ziel der vorliegenden Protokolls ist es, eine Massenspektrometrie (MS) basierend m demonstrierenethode für die vergleichende quantitative Analyse von Multiproteinkomplexen in der Thylakoidmembran von Chlamydomonas reinhardtii, um Einblick in die Zusammensetzung dieser Komplexe unter verschiedenen Bedingungen (durch Vergleich der genetisch verschiedene Stämme beispielhaft) zu gewinnen. Dieser Ansatz wurde in einer Veröffentlichung von Terashima et al angewendet. Im Jahr 2012, die eine Ca ^{2 +-abhängige} Regulation der CEF in C. reinhardtii von einem Multiproteinkomplex einschließlich der Proteine ​​CAS, ANR1 und PGRL1 ⁶ vermittelt. Das Verfahren wird durch vergleichsweise Analyse der Zusammensetzung der CEF-Superkomplex in zwei genetisch verschiedene Stämme, wodurch der Vorteil der Markierung eines der beiden Stämme mit schweren Stickstoff (N ¹⁵⁾ erläutert. Kurz gesagt, enthält das Protokoll die Vorbereitung der Thylakoidmembran, gefolgt von Waschmittel Solubilisierung und Fraktionierung der Photosynthesekomplexe in einem Saccharose-Dichtegradienten. Nach Fraktionierung des Gradienten, ausgewählt fracgen der beiden Stämme gemischt, basierend auf dem gleichen Volumen von SDS-PAGE, gefolgt von In-Gel-Verdauung und anschließende quantitative MS-Analyse getrennt.

Wie oben erwähnt, wird CEF unter verschiedenen Umweltbedingungen induziert und eine Veröffentlichung aus dem Jahr 2010 zeigt die Isolierung eines funktionellen CEF-Superkomplex vom Zustand 2 verriegelt Zellen von C. reinhardtii ^7, die durch die Trennung solubilisierten Thylakoidmembranen auf einem Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation bei geführt wurde. Anders Iwai et al. ^7, das vorgestellte Protokoll beschreibt die Isolierung des CEF-Superkomplex aus der anaeroben gewachsen C. reinhardtii Kulturen, indem Sie ein alternatives Verfahren. Dies umfasst Veränderungen in der Thylakoidmembran Isolierungsprotokoll als auch Unterschiede in der Lösungsschritt und der Trennung der Proteinkomplexe durch Ultrazentrifugation. In dem vorliegenden Protokoll Thylakoidmembranendurch Anwendung der von Chua und Bennoun ⁸ veröffentlichten Verfahren, die Puffer für thylakoid Herstellung von Iwai et al verwendet isoliert. enthielt 25 mM MES, 0,33 M Saccharose, 5 mM MgCl _2, 1,5 mM NaCl (pH 6,5), wie beschrieben, ^9. Die Solubilisierung wurde mit 0,7-0,8% Detergens (n-Tridecyl-β-D-maltosid) für 30 min auf Eis im Fall von Iwai und Mitarbeitern durchgeführt, während das hier beschriebene Solubilisierung Verfahren beruht auf der Verwendung von 0,9% Detergenz (n -Dodecyl-β-D-maltosid (DM-β)) und nur für 20 Minuten auf Eis durchgeführt. Beide Gruppen verwendeten 0,8 mg Chlorophyll pro ml für die Solubilisierung mit dem jeweiligen Reinigungsmittel. Für die Trennung von Photosynthesekomplexen aus solubilisierten Thylakoidmembranen Iwai et al. Angewendet Saccharose-Konzentrationen zwischen 0,1 bis 1,3 M, während die Autoren dieses Protokoll Konzentrationen im Bereich von 0,4 bis 1,3 M. Der letzte Unterschied ist die Zentrifugation Geschwindigkeit, die geringer ist im Vergleich auf der earlier Veröffentlichung.

Solubilisierung von Thylakoidmembranen mit nichtionischen Detergenzien, gefolgt von Saccharose-Dichtegradienten-Fraktionierung wurde bereits in zahlreichen Studien, die von den 1980er Jahren bis heute ^{7, 9-14} und auch die Anwendung von metabolischer Markierung von Proteinen ist ein weit verbreitetes Verfahren in dem Gebiet der Proteomik angewendet. Die beschriebene Vorgehensweise gilt die ¹⁵ N metabolische Markierung für eine der beiden verglichenen Stämme durch Kultivieren in Gegenwart von Schwer Stickstoff als einzige Stickstoffquelle in Form von ¹⁵ N NH ₄ Cl, die in den Aminosäuren, die zu einer Masse eingeschlossen ist Verschiebung in Abhängigkeit von der Aminosäuresequenz des Peptids. Bei der Analyse einer Mischung von ¹⁴ N und ¹⁵ N in einem MS ausführen kann diese Massenverschiebung verwendet werden, um die Probe für jede Ursprungs-Peptid und Peptid relativen Häufigkeiten berechnet werden kann, die relative Häufigkeit der entsprechenden bestimmening Protein ^15.

Zahlreiche quantitative Proteomik-Studien an C. reinhardtii zur Verfügung, die eine definierte Menge an Protein zu vergleichen, um Veränderungen im Proteom zwischen experimentellen Bedingungen (zB Veränderungen im Proteom durch Nährstoff ^16-19 oder Lichtstress ^20,21) zu analysieren. Im Vergleich zu den Studien, in der aktuell vorgestellte Ansatz gleicher Volumina der Proben werden vereinigt und analysiert. Dieser Aufbau erlaubt es, das Migrationsverhalten der Proteine ​​innerhalb der Gradient untersuchen und darüber hinaus zur Analyse der Zusammensetzung der verschiedenen Komplexe in Bezug auf die untersuchten Stämme.

Diese Methode wird vor allem durch die Konzentration auf drei Proteine ​​erklärt werden: Der erste Kandidat ist der Chloroplasten lokalisierten Kalzium-Sensorprotein CAS, die gezeigt wurde, in Foto-Akklimatisierung in C beteiligt werden ²² reinhardtii. Calcium wird als ein wichtiges Signalten Ionen für Wege, die durch verschiedene biotische und abiotische Stressfaktoren aktiviert werden, schließlich zu Veränderungen in der Genexpression und Zellphysiologie ²³ führt, und es wurde vorgeschlagen, dass Chloroplasten könnte die zelluläre Ca ^{2 +} Signal beitragen über die CAS-Protein ^22,24,25. Das zweite Protein ANR1 (anaerobe Reaktion 1 ^6), ein Protein, das gezeigt wurde, unter anoxischen Bedingungen wachsen in C induziert werden, ²⁶ reinhardtii. Bemerkenswerterweise wurden CAS sowie ANR1 als Untereinheiten des CEF-Superkomplex und darüber hinaus durch Verwendung von Reverse genetische Ansätze, wurde gezeigt, dass beide Proteine ​​beitragen funktionell CEF in vivo ^6. Unterstützung ihrer Rolle als Funktionseinheiten dieses Proteinkomplexes identifiziert. Das dritte Protein ist die Thylakoidproteintrennung PGR5-Like 1 (PGRL1), die gezeigt wurde, in CEF in Chlamydomonas ^4,27 sowie ^5,28 in Arabidopsis beteiligt und war auch idin der Arbeit von Iwai et al entified. ⁷

Wildtyp (WT) gegen (vs) eine ΔPSI ^29-Stamm und weisen eine Deletion des Gens PSAB, für einen wesentlichen Photosystem I Untereinheit, die ebenfalls Teil der Kodierung dieser Ansatz durch die die Ergebnisse von zwei verschiedenen Experimenten vorgestellt CEF-Superkomplex und WT vs pgrl1 ein Knock-out-Stamm ^4. Für jeden dieser Versuche die quantitative Zusammensetzung der CEF-Superkomplex zwischen einem ¹⁵ N-und ¹⁴ N-markierten Stamm wurde verglichen.

Protokoll

1. Kultivierung von Chlamydomonas

1. Das folgende C reinhardtii Stämme wurden in der vorliegenden Studie verwendet: WT cc124, WT CW15-Arg7 (zellwand und Arginin Auxotroph), ein ΔPSI mutierten Stamm ²⁹ und ein pgrl1 Knock-out-Stamm ^4.
2. Alle Stämme wurden in Tris-Acetat-Phosphat-(TAP)-Medium ^30, bei 25 ° C mit einem kontinuierlichen Lichtstärke von 20-50 &mgr; E / m ² s und bei 120 Upm Schütteln gezüchtet. Die Kultur der ΔPSI sollten mit etwas Seidenpapier zur Belichtung von <5 uE / m ² sec gewickelt werden.
3. Die Kulturen der markierten Stämme (ΔPSI und WT cc124, respectively) enthielt 7,5 mM ¹⁵ N NH ₄ Cl, während die Kulturen für die unmarkierten Stämme (WT CW15-Arg7 und pgrl1, respectively) enthielt 7,5 mM ¹⁴ N NH ₄ Cl. Zellen für mindestens vier generiere wachsenIonen in voller Kennzeichnung und zu erreichen, müssen in der exponentiellen Wachstumsphase gehalten werden.
4. Am Tag vor Beginn des Experiments zu zählen und zu verdünnen Zellen auf eine Dichte von 1 x 10 ⁶ Zellen / ml in einem Volumen von mindestens 750 ml / Stamm.

Bitte beachten Sie, dass zwei Arten von diskontinuierlichen Saccharose-Dichtegradienten in dem folgenden Protokoll beschrieben. Die Photo Saccharose-Dichtegradienten nach Takahashi et al. ⁹ werden verwendet, um die verschiedenen photosynthetischen Proteinkomplexe aus isolierten und solubilisierten Thylakoide während über Nacht Zentrifugation trennen und haben den Tag vorbereitet werden, bevor (siehe Protokoll Nr. 2) und der thylakoid Saccharose-Dichtegradienten ⁸ sind in der thylakoid Isolierungsverfahren angewendet (siehe Protokoll Nr. 3).

2. Herstellung von Photo Sucrose Dichte Gradienten

1. Zum Ausgießen der Gradienten drei Stammlösungen benötigt:
   1. 2 M Saccharose
   2. 10% β-DM in H ₂ O
   3. 0,5 M Tricin, pH 8,0 (NaOH)
2. Mit diesen Aktien, bereiten Sie die folgenden Lösungen:

   Konzentration:	1,3 M	1,0 M	0,85 M	0,7 M	0,65 M	0,4 M
   2 M Saccharose	13 ml	10 ml	8,5 ml	7 ml	6,5 ml	4 ml
   10%46;-DM	100 ul	100 ul	100 ul	100 ul	100 ul	100 ul
   0,5 M Tricin	200 ul	200 ul	200 ul	200 ul	200 ul	200 ul
   H 2 O	6,7 ml	9,7 ml	11,2 ml	12,7 ml	13,2 ml	15,7 ml

3. Verwenden Sie 14 mm x 89 mm Zentrifugenröhrchen und gießen die Gradienten sehr langsam, beginnend mit der höchsten Dichte Saccharose-Lösung niedriger Dichte Lösung.
4. Pour nur jeweils 1 ml der 1,3 und 1,0 M Lösung und 2 ml für den Rest der Lösungen.
5. Lassen Gradienten über Nacht im Kühlraum.

3. Anaerobe Induktion und Isolierung von Thylakoidmembranen ⁸

1. Bevor mit der Isolierung von Thylakoidmembranen induzieren anaeroben Bedingungen unter Durchblasen von Argon 4 Stunden. Die Blasenbildung kann durch eine Glaspipette in die Kultivierung Kolben unter ständigem Mischen der Kultur mit einem Magnetrührer durchgeführt werden.
2. Beginnen mit der Isolierung von Thylakoidmembranen durch Pelletieren der Zellen 5 min bei 2500 × g, resuspendieren in H1-Puffer (0,3 M Saccharose, 25 mM HEPES (pH 7,5), 5 mM MgCl _2).
   (Bitte beachten Sie, dass beim Start mit der Isolierung von Thylakoidmembranen Proben should auf Eis gehalten werden, um den Proteinabbau zu vermeiden, werden alle Schritte der Zentrifugation bei 4 ° C durchgeführt und die Arbeit mit Handschuhen wird dringend empfohlen, Keratin-Kontamination zu vermeiden.)
3. Pellet-Zellen für 5 min bei 2.500 × g, Resuspendieren in Puffer H1.
4. Brechen Sie die Zellen mit zwei Durchgängen durch einen Zerstäuber mit einem Stickstoffdruck von 1500 hPa (für die Stämme ohne Zellwand nicht nur ein Durchgang).
5. Spin down Zellen für 7 min bei 2.500 x g.
   (Nach diesem Schritt der Überstand sollte hellgrün sein, wenn nicht, war die Zellbruch nicht erfolgreich.)
6. Die Zellen in H2-Puffer (0,3 M Saccharose, 5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0)) und Pellet-Zellen für 10 min bei 32.800 x g.
7. Die Zellen in H3-Puffer (1,8 M Saccharose, 5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0)) und homogenisieren Pellets mit einem Töpfer (keine grünen Partikel sollten am Ende dieser Arbeitsschritt bleiben).
8. Bereiten thylakoid Saccharose-Dichtegradienten in WanneES (25 mm x 89 mm) von unten beginnend mit einer Schicht aus 12 ml H3-Puffer mit Zellen, gießen eine mittlere Schicht aus 12 ml H &sub4;-Puffer (1,3 M Saccharose, 5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA ( pH 8,0)) und auf 12 ml H5-Puffer (0,5 M Saccharose, 5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0)). Seien Sie vorsichtig beim Gießen der Steigungen und vermeiden das Mischen der drei Schichten.
9. Waage mit H5-Puffer und Zentrifuge thylakoid Saccharose-Dichtegradienten für 1 Stunde bei 70.700 x g.
10. Entfernen thylakoid Bands aus den thylakoid Saccharose-Dichtegradienten und verdünnt sie mit einem geeigneten Volumen H6-Puffer (5 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0)).
11. Spin down Zellen bei 37.900 g für 20 min. Wenn das Pellet ist nicht fest, ist mehr H6 Puffer für diesen Zentrifugationsschritt erforderlich.
12. Resuspendieren Thylakoide in einem kleinen Volumen Puffer H6 und fahren mit der Bestimmung des Chlorophyllkonzentration.

4. Bestimmung des Chlorophyll-Konzentration ³¹

1. Die Bestimmung der Chlorophyllmenge wird mit 80% Aceton durchgeführt.
2. Mischen Sie 995 ul 80% Aceton und 5 ul der Thylakoide in H6-Puffer (Verdünnung 1:200).
3. Vortex für mehrere Sekunden, bis keine grüne Partikel verbleiben und dann drehen sich mit 14,1 xg unten für 5 min.
4. Nehmen Sie den Überstand und Messung der Extinktion bei 663,6 und 646,6 nm und 750 nm auf.
5. Berechnen Sie die Chlorophyllmenge mit den folgenden Formeln:
   1. C _{Chl a} [mg / ml] = (0,01225 * E _{663,6-0,00255} * E _646,6) * Verdünnungsfaktor
   2. C _{Chl b} [mg / ml] = (0,02031 * E _{646,6-0,00491} * E _663,6) * Verdünnungsfaktor
   3. C _Chl [mg / ml] = C _{Chl a} + C _{Chl b}

5. Laden von Photo Sucrose Dichte Gradienten

1. Berechnen Sie die Beträge der Thylakoide, β-DM und H6-Puffer, die benötigt werdenfür jeden Farbverlauf:
   1. Jede Steigung sollte mit einem Gesamtvolumen von 700 ul mit 0,8 mg / ml Chlorophyll in 0,9% β-DM (auflösen β-DM in H ₂ O) geladen werden, füllen Sie das Restvolumen mit H6-Puffer.
2. Für Solubilisierung bereiten verschiedene Teilmengen mit Thylakoide, β-DM und H6 Puffer für jede Steigung.
3. Lassen Proben für 20 min auf Eis mit regelmäßig Misch (Invertierung) alle paar Minuten (Solubilisierungsschritt).
4. Zentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit (14.000 × g) für 10 min bei 4 ° C.
   (Nach der Zentrifugation sollte das Pellet klein und weißlich sein, während der Überstand ist dunkelgrün.)
5. Legen Sie Überstand an den Steigungen.
6. Waage mit H6-Puffer und drehen mit Ultrazentrifuge bei 134.470 xg über Nacht (14 h) bei 4 ° C.
   (Bitte beachten Sie, dass die erfolgreiche Trennung der Photosynthesekomplexe mit Photo Saccharose-Dichtegradienten wie in diesem Protokoll präsentiert wird nur erreicht, wenn using frisch isolierte Thylakoide, da eine Vorhersage für die Solubilisierung und komplexe Trennung ist schwierig, wenn die Arbeit mit Thylakoidmembranen, die vor eingefroren worden sind, zu machen.)

6. Fraktionierung von Photo Sucrose Dichte Gradienten

1. Machen Sie Fotos von den Steigungen.
2. Punktion ein Loch an der Unterseite des Rohres mit einer Nadel und fraktionieren Gradienten in 500 ul Röhrchen. Alternativ kann die Fraktionierung auch unter Verwendung einer Platte mit 96 Vertiefungen (Mikrotiterplatte) durchgeführt werden.
3. Bei Verwendung einer Mikroplatte bestimmen Absorption der verschiedenen Fraktionen Gradienten bei 675 nm auf.
   (Bei diesem Schritt können die Proben bei -80 ° C für einige Wochen gelagert werden.)

7. SDS-PAGE und Immun

(Bitte beachten Sie, dass nur für den Vergleich von WT vs ΔPSI ein Western-Blot-Analyse durchgeführt wurde, um die Fraktionen für die anschließende MS-Analyse auswählen. Für das Experiment WT vs pgrl1 frMaßnahmen wurden mittels der Absorption in den verschiedenen Fraktionen ausgewählt.)

1. Separate 30 ul jeder Fraktion von WT und ΔPSI Steigung auf einem 13% ^{SDS-Polyacrylamid-Gel-32.}
2. Führen Western-Blot-Analyse ³³ mit den folgenden Antikörpern: ANR1 (TEF7) ^{26, 34} PGRL1, CAS ^6, die PSI-Untereinheit PSAD ³² und die D1 PSII Kernuntereinheit. Sämtliche Antikörper mit einer Verdünnung von 1:1000 (für verstärkte Chemilumineszenz-Nachweistechnik), außer für den D1-Antikörper, der mit einer Verdünnung von 1:10000 eingesetzt werden sollte.
3. Basierend auf den Ergebnissen der Immundetektion, nehmen Sie die Peak-Fraktionen von ANR1, PGRL1 und PSAD für WT und ΔPSI (hier den Fraktionen 6 und 13), mischen Sie 30 ul Fraktion 6 von WT und ΔPSI und tun das gleiche mit Fraktion 13 aus beide Präparate und trennen sie wieder auf einem 13% SDS-Polyacrylamid-Gel.
4. Für den quantitativen Vergleich von WT vs pgrl1 nehmen Sie die CEF-Superkomplex Fraktionen durch Messung der Absorption in den verschiedenen Gradienten-Fraktionen bestimmt und mischen 30 ul beider Proben gefolgt von der Trennung auf einem 13% SDS-Polyacrylamidgel.
5. Färben die Proteinbanden mit Coomassie-Lösung (85% phosphoriger Säure, 757 mM Ammoniumsulfat, 1,2% Coomassie Brilliant Blau, 20% Methanol) für 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C.
6. Um unspezifische Färbung zu entfernen, waschen, mehrmals mit ddH ₂ O.
7. Schneiden Sie die Bahnen in 1 mm Gelstücke und fahren mit der In-Gel-Verdauung.
   (Alternativ können die Proben ein paar Minuten in einer Vakuumzentrifuge getrocknet und für ein paar Wochen vor der weiteren in-Gel-Verdauung gespeichert.)

8. In-Gel-Verdauung (Geändert von Shevchenko et al. ³⁵⁾

Bitte beachten Sie, alle Puffer und Lösungen kurz vor der Verwendung vorzubereiten und Glasflaschen für Puffer Acetonitril (ACN) enthalten.
ACHTUNG! Arbeiten mit ACN schädlich sein könnten, mehr Informationen können heruntergeladen werden unter: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927335 (2013).

1. Für 30 Sekunden waschen Gel-Stücke mit> 10 Volumen _ddH2O (~ 200 ul).
2. Die Gelstücke mit 300 &mgr; l von 25 mM NH ₄ HCO ₃ für 15 min unter Schütteln inkubieren, Entfernen Flüssigkeit.
3. Die Gelstücke mit 300 &mgr; l von 25 mM NH ₄ HCO ₃ in 50% ACN inkubieren (Herstellung durch Mischen ACN und 50 mM NH ₄ HCO ₃ in einem Verhältnis von 1:1) für 15 min unter Schütteln entfernen Flüssigkeit.
4. Wenn die Gelstücke noch blau, wiederholen der NH ₄ HCO ₃ und NH ₄ HCO ₃ / ACN wäscht, bis die meisten der Coomassie entfernt.
   (Obwohl der Großteil der Coomassie-Färbung entfernt werden sollte, ist es nicht notwendig, die Gelstücke vollständig entfärben.)
5. 100 l ACN, um die Gel-Stücke für 5 min zu entwässern. Die Gel-Stücke sollten einen Schrumpfnd schauen ganz weiß.
6. Entfernen Sie so viel wie möglich ACN und fahren mit Trypsin Verdauung. Alternativ können die Proben bei -20 ° C für einige Wochen gelagert werden.
7. In 10-20 ul pro Band von 20 ng / ul Trypsin in 10% ACN / 25 mM NH ₄ HCO ₃ (frisch verdünnt), halten Sie Proben auf Eis.
8. Nach 30 Minuten prüfen, ob alle Lösung absorbiert wurde und noch mehr Trypsin-Puffer, falls erforderlich. Gel Stücke sollten vollständig mit Trypsin Puffer bedeckt sein. Halten Proben auf Eis.
9. Lassen Sie Gel-Stücke für weitere 90 min auf Eis, um sie mit Trypsin zu sättigen.
   (Critical Schritt: die Ausbeute an tryptischen Peptiden nimmt mit zunehmender Inkubationszeit auf Eis, wahrscheinlich aufgrund der langsamen Diffusion des Enzyms in der Polyacrylamid-Matrix ist es erforderlich, einen geringen Überschuß an Lösung zu haben für die Gelstücke zu vermeiden, dass die Stücke. fallen trocken während der Inkubation über Nacht.)
10. Digest bei 37 ° C für 4-6 Stunden. Für Experimente erfordernmaximale Peptidrückgewinnung, über Nacht zu verdauen.
11. Nach der Verdauung Spin-Down verkürzte Puffer.
12. Ultraschallbad Rohre für 5 min auf Peptide und Zentrifuge wieder eluieren.
13. Überstand sammeln und übertragen sie in ein neues Röhrchen.
14. Führen Peptid Extraktion mit 80 ul von 30% ACN / 1% Ameisensäure (FA) in einem Ultraschallbad für 15 min.
15. Führen Extraktion mit 80 ul von 30% ACN / 1% FA in einem Ultraschallbad für 15 min.
16. Führen Extraktion mit 80 ul von 70% ACN / 1% FA in einem Ultraschallbad für 15 min.
17. Zentrifuge wieder und Pool-Überstand mit dem Eluat vor.
    (FA dient Trypsin zu inaktivieren und erhöhen Peptidlöslichkeit.)
18. Chemische Peptid-Lösung vollständig in einer Vakuumzentrifuge.
    (An dieser Stelle Proben können für ein paar Wochen in -20 ° C, bevor mit MS-Analyse zu speichern.)
19. Resuspendieren Peptide in 6 ul MS-Puffer (5% ACN, 0,1 v / v FA, Wasser) und beschallen für 2-5 min.
20. Centrifuge Proben bei maximum Geschwindigkeit für 5 Minuten, um Partikelmaterial zu entfernen.
21. Verwenden von 4 ul Überstand für die massenspektrometrische Analyse.

9. MS-Datenanalyse mit "Proteomatic"

Die Datenanalyse wurde mit dem Open-Source-Software "Proteomatic" (die bei http://www.proteomatic.org/ heruntergeladen werden kann), eine Plattform, die die Erzeugung und Beendigung von MS / MS-Daten Auswertung Rohrleitungen, durch die Verwendung erlaubt geführt freie und kommerzielle ^Software-36. Kurz gesagt, werden die nachfolgend beschriebenen Einstellungen und mehr Informationen finden Sie in ^6,26 gefunden werden.

1. Identifizierung und Quantifizierung der MS-Daten
   Identifizierung und Quantifizierung von Proteinen aus der Experimente WT vs ΔPSI wurden mit OMSSA (Version 2.1.4 ³⁷⁾ und qTrace bzw. ²⁶ erfolgt, wie beschrieben, ^6,26. Für die MS-Datenanalyse aus dem Experiment WT vs pgrl1 die folgende aktualisierte Pipeline verwendet:
   1. Neben OMSSA ^37, wurden die Proteine ​​auch mit X identifiziert! Tandem (Version 2013.02.01 ^38). Beide Algorithmen wurden durch die Suche gegen einen durch die Kombination der JGI Chlamydomonas Gen Modell-Datenbank der Version 4.3 mit der AUGUSTUS Datenbank Version 10.2 sowie gegen eine beigetreten Datenbank der NCBI Datenbank angewendet erzeugt Datenbanken BK000554.2 und NC_001638.1.
   2. MS ² Identifizierung von Peptiden wurde unter Verwendung einer ziel Köder Ansatz ³⁹ durchgeführt. Ein Köder für jedes Protein wurde durch Mischen zufällig tryptischen Peptide unter Beibehaltung der Redundanz der nonproteotypic Peptiden geschaffen.
   3. Statistische Validierung der Peptide wurde mit der Software qvality (Version 0.3.3 ⁴⁰⁾ mit einem hinteren Fehlerwahrscheinlichkeit (PEP) Schwellenwert von weniger als 0,01 und die Ergebnisse wurden mit einer Vorläufermasse Toleranz von 5 ppm filtriert geführt.
   4. Peptide aus OMSSA und X! Tandem-Läufe wurden zusammengefügt und mit qTrace quantifiziert ^{26 Anwendung der folgenden Filterstufen: 2 Identifizierung erfordern MS, fügen Protein-Namen / Gruppeninformationen und erfordern sowohl Schwester Peptiden.}

Um zu untersuchen, ob Protein-Verhältnisse in den gemischten CEF-Superkomplex-Fraktionen von WT und pgrl1 signifikant unterschiedlich zueinander, wurde die statistische Analyse durchgeführt, die Anwendung der Software SPSS (Version 21). Die Untereinheiten des Cytochrom b ₆ / f-Komplex wurden gegeneinander als auch die Proteine ​​FNR FTSH2 HCF136 und gegen die PSI-Untereinheiten getestet. Die Peptid-Verhältnisse von jedem Scan Zahl pro Protein von allen vier Wiederholungen wurden auf Normalverteilung mit dem Shapiro-Wilks-Test geprüft. Da die Peptidpopulationen nicht normal verteilt (p <0,001) wurden nichtparametrische Statistik durchgeführt. Zunächst wurde der Kruskal-Wallis-Test angewendet Beurteilung einer erheblichen Unterschiede zwischen den Gruppen. Nur wenn dieser Test vorhergesagt signifikanten Unterschieds zwischen den Gruppen wurde eine weitere Analyse durchgeführt, um signifikante Unterschiede zwischen den beiden unabhängigen Gruppen mit dem Mann-Whitney-U-Test vorherzusagen.

Ergebnisse

Das eingeführte quantitative Proteomik Ansatz zielt darauf ab, die Zusammensetzung des Multiproteinkomplexen in Thylakoidmembranen durch die vergleichende Analyse der CEF-Superkomplex-Komponenten in genetisch verschiedenen C nachgewiesen charakterisieren reinhardtii Stämme. Das beschriebene Verfahren wurde erfolgreich von Terashima et al. ⁶ angelegt und umfasst die Isolierung der Thylakoidmembran von anaeroben Kulturen gezüchtet, gefolgt von Solubilisierung Waschmittel. Anschlie?...

Diskussion

Verschiedene quantitative Proteomik-Studien unter Verwendung von stabilen Isotopenmarkierung sind in den letzten Jahren veröffentlicht worden. In diesen Versuchen in der Regel zwei verschiedenen Proben verglichen werden, von denen eine Probe mit einem stabilen Isotop markiert. Danach Proteine ​​oder Peptide, die von den beiden Proben werden in einem gleichen Verhältnis vereinigt und gemeinsam weiter verarbeitet ^48. Solche Studien wollen oft definiert isoliert zellulären Kompartimenten (zB Chlo...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Acetic acid	AppliChem	A0662	http://www.applichem.com/home/
Acetone	AppliChem	A2300	http://www.applichem.com/home/
Acetonitrile Optigrade für LC-MS	Diagonal	9340	Harmful, work with gloves. See protocol text for further precautions. https://www.diagonal.de/
Ammonium chloride 15N	Cambridge Isotope Laboratories	39466-62-1	http://www.isotope.com/cil/index.cfm
Ammonium chloride 14N	AppliChem	A0988	http://www.applichem.com/home/
Ammonium hydrogen phosphate	AppliChem	A3583	http://www.applichem.com/home/
Ammonium sulfate	AppliChem	A3598	http://www.applichem.com/home/
Coomassie brilliant blue R-250	Fisher Scientific	10041653	http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex
n-Dodecyl-β-D-maltoside	AppliChem	A0819	http://www.applichem.com/home/
EDTA	AppliChem	A2937	http://www.applichem.com/home/
Formic acid	AppliChem	A3858	http://www.applichem.com/home/
HEPES	AppliChem	A3724	http://www.applichem.com/home/
Magnesium chloride	AppliChem	A4425	http://www.applichem.com/home/
Methanol	AppliChem	A2954	http://www.applichem.com/home/
Phosphorous acid	AppliChem	A0989	http://www.applichem.com/home/
Dipotassium hydrogen phosphate	AppliChem	A1042	http://www.applichem.com/home/
Potassium dihydrogen phosphate	AppliChem	A1043	http://www.applichem.com/home/
Sodium hydroxide	AppliChem	A1551	http://www.applichem.com/home/
Sucrose	AppliChem	A1125	http://www.applichem.com/home/
Tricine	AppliChem	A3954	http://www.applichem.com/home/
Tris	AppliChem	A2264	http://www.applichem.com/home/
Trypsin (sequencing grade modified) and Trypsin buffer	Promega	V5111	http://www.promega.de/
Equipment
Nebulizer (BioNeb cell disruptor)	Glas-Col		http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75
Centrifuge tubes (14 mm x 89 mm)	Beckman Coulter	331372	for preparation of Takahashi style gradients http://www.beckmancoulter.de/
Centrifuge tubes 25 mm x 89 mm	Beckman Coulter	344058	for preparation of thylakoid isolation gradients. http://www.beckmancoulter.de/
Coulter Avanti Centrifuge J-20 XP	Beckman Coulter		http://www.beckmancoulter.de/
Fuchs-Rosenthal cell couting chamber	Diagonal	449/72	https://www.diagonal.de/
Homogenizer (Potter) 50 ml	Fisherbrand	10618242	http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand
Pistil for homogenizer	Fisherbrand	105252220	http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand
Ultracentrifuge (Optima XPN-80 Ultracentrifuge)	Beckman Coulter		website: http://www.beckmancoulter.de/
Other
Antibodies	Agrisera		http://www.agrisera.com/en/index.html