multiprotein의 단지의 비교 분석을위한 새로운 접근 방식을 기반으로<sup&gt; 15</sup&gt; N 대사 라벨링 및 정량 질량 분석

요약

기술 비교, 정량 프로테오믹스 방법은 서로 다른 조건에서 multiprotein의 단지의 조성에 대한 통찰력을 얻는 것을 목표로하고 유 전적으로 서로 다른 변종을 비교하여 보여줍니다. 정량 분석​​을 위해 자당 밀도 구배 상이한 분획 같은 부피는 질량 분석법에 의해 혼합되고 분석된다.

초록

도입 된 프로토콜은 서로 다른 조건에서 복잡한 구성에 대한 통찰력을 공개함으로써, 틸라코이드 막에서 multiprotein의 단지의 분석을위한 도구를 제공합니다. 이 프로토콜의 접근 방식은 유 전적으로 서로 다른 계통에서 분리 인 Chlamydomonas reinhardtii의 순환 전자 흐름 (CEF), 복잡한 책임 단백질의 구성을 비교하여 보여줍니다. 절차의 차동 대사 라벨링 ⁽¹⁴ N / ¹⁵ N)에 근거 자당 밀도 구배 원심 분리, SDS-PAGE, 면역 및 비교 정량적 질량 분석 (MS)에 의해 multiprotein의 착물에 자신 분액하여 틸라코이드 막 분리를 포함 분석 변종. 세제 용해 틸라코이드 막은 동일한 엽록소 농도에서 자당 밀도 구배에로드됩니다. 초 원심 분리 한 후, 그라데이션은 대량 spectromet으로 분석 분획으로 분리된다공예 같은 부피에 따라. 이 접근법은 또한 구배 분획 내의 조성물의 조사 및 특히 ANR1, CAS 및 PGRL1에 집중 다른 단백질의 마이그레이션 동작을 분석 할 수있다. 또한,이 방법은 (이전의 연구에서 이전에 같은 PGRL1, FNR과 CEF-supercomplex의 일부가 설명 된 단백질의 식별 및 PSI에 의존하는 이주 연구 결과를 지원에 의해 면역 블롯과 부가 적 결과를 확인하여 설명된다 CYT F). 특히,이 방법은이 프로토콜을 채용 할 수 있고, 예를 들면 별개의 환경 조건으로부터 격리 multiprotein의 복합 조성물의 비교 분석을 위해 사용되는 질문의 광범위한 주소에 적용 가능하다.

서문

식물과 조류의 틸라코이드 막에서 광합성 과정은 선형 및 순환 모드에서 작동 할 수 있습니다. 선형 전자 흐름 (LEF) 광계 I (PSI), 광계 II (PSII)와 시토크롬 B ₆ / F 동안 궁극적으로 NADPH와 ATP의 ² 세대로 이어지는 물에서 NADP + ^1에 전자를 전송할 수 있습니다. 반대로, 상태 ² 및 혐기성 조건 ⁰⁴ 위로 전자 수송 체인에 전자를 주입하여 산화 PSI의 재 환원의 결과와 같은 다양한 환경 조건에서 유발되는 것으로 알려져있다 환상 전자 흐름 (CEF). 이 과정은 시토크롬 B ₆ / F 복합체 ^1의 기질면에서 또는 플라 스토 퀴논 풀 ^5시에 하나 자리를 대신하고 ATP를 생성하지만 NADPH ² 수 있습니다.

제시된 프로토콜의 목적은 질량 분석계 (MS) 기반 m을 입증하는 것이다(유 전적으로 서로 다른 변종을 비교하여 예시) 다른 조건이 단지의 조성에 대한 통찰력을 얻을 수 인 Chlamydomonas reinhardtii의 틸라코이드 막에서 multiprotein의 단지의 비교, 정량 분석을위한 ethod. 이 방법은 테라지마 외 의해 출판물에 적용되었다. 2012 년 C.에 CEF의 칼슘 ^{2 +에} 의존 규제를 보여주는 단백질 CAS, ANR1 및 PGRL1 ^6를 포함하는 multiprotein의 복합에 의해 매개 reinhardtii. 절차는 비교적함으로써 라벨링 무거운 질소 (N ^15)와 두 균주 중 하나를 이용하고,이 유 전적으로 상이한 균주에서 CEF-supercomplex의 조성물을 분석하여 설명한다. 간략하게, 프로토콜은 세제 가용화 및 자당 밀도 구배에서 광합성 착체 분획 하였다 틸라코이드 막의 제조를 포함한다. 그라데이션의 분별 한 후, 골절을 선택두 균주의 tions 혼합, 같은 부피에 따라 인 - 젤 소화 이후 양적 MS 분석에 의해 다음 SDS-PAGE에 의해 분리된다.

위에서 언급 한 바와 같이, CEF는 다른 환경 조건에서 유도 된 2010 년에서 게시 상태에서 C. 2 잠긴 셀을 기능 CEF-supercomplex의 분리를 보여줍니다된다 초 원심 동안 자당 밀도 구배에 가용화 틸라코이드 막 분리에 의해 수행 된, ⁷ reinhardtii. 이와이 등. ⁷ 달리, 제시된 프로토콜은 혐기성 성장 C.에서 CEF-supercomplex의 분리를 설명 다른 절차에 따라 reinhardtii 문화. 이것은 틸라코이드 분리 프로토콜의 변화뿐만 아니라 가용화 단계에 관한 차이와 초 원심 분리에 의해 단백질 복합체의 분리를 포함한다. 본 프로토콜, 틸라코이드 막버퍼가 이와이 등으로 틸라코이드 제조에 사용하면서, Chua의 및 Bennoun ^(8)에 의해 발표 된 절차를 적용하여 격리하는 알. ⁹ 설명 된대로 25 mM의 메스, 0.33 M 수크로오스, 5 mM의 _MgCl2를 1.5 mM의 염화나트륨 (산도 6.5)이 포함되어 있습니다. 여기에 설명 된 가용화 방법은 0.9 %의 세제의 사용에 의존하면서 가용화는, 이와이와 동료의 경우 얼음 위에 30 분 동안 0.7 ~ 0.8 %의 세제 (N-데실-β-D-말토 사이드)를 수행 하였다 (N - 도데 실-β-D-말토 (β-DM)) 및 얼음에 20 분 동안 수행된다. 두 그룹은 각각의 세제로 가용화 ML 당 엽록소의 0.8 MG를 사용했습니다. 이 프로토콜의 저자의 농도 범위를 사용하는 반면 가용화 틸라코이드 막에서 광합성 복합체의 분리를위한 이와이 외., 0.1-1.3 M 사이 수크로오스 농도를 적용 0.4-1.3 M. 마지막 차이로부터 비해 낮다 원심 속도이며, 개에rlier 출판.

자당 밀도 구배 분획 하였다 비이 온성 세제 틸라코이드 막의 가용화 이미 1980 년대부터 또한 단백질의 대사 라벨링 애플리케이션 프로테오믹스 분야에서 널리 방법 오늘 ^{7, 9-14까지} 이르는 수많은 연구에 적용되어왔다. 기재된 접근 방법은 대량으로 이어지는 모든 아미노산에 도입되어 ¹⁵ N _NH4Cl 등의 형태로 단독 질소원으로서 무거운 질소의 존재를 배양하여이 비교 균주 중 하나에 대해 ¹⁵ N 대사 라벨링 적용 펩티드의 아미노산 서열에 따라 시프트. 한 MS는 실행 시간 이내 ¹⁴ N ¹⁵ N의 혼합물을 분석 할 때, 이러한 질량의 변화는 각 펩티드와 존재비는 대응 대해 상대적인 풍부함을 나타내는 계산 될 수 상대 펩타이드 샘플 원점을 결정하는데 사용될 수있다단백질 ^15을 보내고.

C.에 많은 정량 프로테오믹스 연구 reinhardtii는 실험 조건 ^(16-19으로 인해 영양소 나 가벼운 스트레스 ^{(20, 21)에} 대한 프로테옴의 예를 들어 변경) 사이의 프로테옴의 변화를 분석하는 단백질의 정량 비교하는, 사용할 수 있습니다. 그 연구에 비해, 현재 제시된 방법에 샘플 같은 부피가 결합되고 분석된다. 이 설정은 그라데이션 내에서 단백질의 이동 동작을 연구하고 또 연구 균주에 대한 다른 단지의 구성을 분석 할 수 있습니다.

이 방법은 주로 세 가지 단백질에 집중하여 설명한다 : 첫 번째 후보는 C.에 사진 순응에 관여하는 것으로 나타났다 엽록체 지역화 칼슘 센서 단백질 CAS입니다 reinhardtii ^22. 칼슘은 중요한 신호로 간주됩니다마지막으로 유전자 발현 및 세포 생리학 ^23의 변화에 선도적으로 인해 다른 생물과 비 생물 적 스트레스에 활성화되고,이 엽록체가 CAS 단백질 ^22,24,25를 통해 신호 ⁺ 세포의 ^칼슘에 기여할 수 있음을 제안 된 경로에 이온을 주입. 두 번째 단백질은 ANR1 (혐기성 반응 1 ^6), C.에서 무산소 성장 조건에서 유도 표시했다 단백질이다 reinhardtii ^26. 특히, CAS 등 ANR1은 CEF-supercomplex 더욱이, 역방향 유전자 접근법을 사용함으로써,이 두 단백질이 단백질 복합체의 기능적 서브 유니트로서의 역할을지지 생체 ⁶ CEF 기능적 올릴 것을 증명 하였다 소단위로 확인 하였다. 세 번째 단백질은 클라 미도 모나스 ^4,27뿐만 아니라 애기 장대 ^5,28에 CEF에 참여하는 것으로도 ID이었다 틸라코이드 단백질 PGR5 - 드 1 (PGRL1)입니다이와이 외 여러분의 작업에 entified. ⁷

, 야생형 (WT) (대) ΔPSI ²⁹ 균주 대 psab 유전자의 삭제를 나타내는도의 일부입니다 제가 소단위 필수 광계, 코딩 :이 방법은 두 가지 실험의 결과를 표시하여 표시됩니다 CEF-supercomplex 및 WT 대 pgrl1 노크 아웃 변형 ^4. 그 실험의 각 ¹⁵ N과 ¹⁴ N-라는 변형을 비교 한 사이의 CEF-supercomplex의 양적 구성.

프로토콜

1. 클라 미도 모나스의 배양

1. 다음 C. reinhardtii 균주는 본 연구에 사용되었다 : WT의 cc124, WT의 cw15-arg7 (세포 벽 결핍과 아르기닌 영양 요구 주), ΔPSI 변이주 ²⁹ pgrl1 노크 아웃 변형 ^4.
2. 모든 균주 연속 빛 20 ~ 50의 강도 μE / m ² 초, 120 rpm에서 진탕 트리스 - 아세테이트 - 인산염 (TAP) - 매체 ^(30), 25 ° C에서 성장했다. ΔPSI의 문화는 <5 μE / m ² 초 빛의 노출에 대한 몇 가지 조직 종이로 포장되어야한다.
3. nonlabeled 균주 (각각 WT cw15-arg7 및 pgrl1)의 문화가 7.5 밀리미터 ¹⁴ N NH ₄ 망할 CIA를 포함하는 반면 (각각 ΔPSI 및 WT의 cc124)라는 균주의 배양, 7.5 mM의 ¹⁵ N NH ₄ 망할 CIA가 포함되어 있습니다. 세포는 적어도 네 generat라는 성장이이전체 라벨과를 달성하기 위해 이온은 기하 급수적 인 성장 단계에서 보관해야합니다.
4. 실험 개수 및 적어도 750 ㎖ / 스트레인의 체적 1 × ¹⁰⁶ 세포 / ml의 밀도로 세포를 희석 시작 하루전.

불연속 자당 밀도 구배의 두 가지 유형은 다음과 같은 프로토콜에 설명되어 있음을 양해 바랍니다. 광계 자당 밀도 구배 타카하시 외. ^{9에있어서} 틸라코이드 자당 밀도 구배보기 (프로토콜 2 참조) 전에 오버 박 원심 동안 격리 및 가용화 틸라코이드에서 다른 광합성 단백질 복합체를 분리하고 일 대비해야하는 데 사용되며 ⁸ (프로토콜 3 참조) 틸라코이드 격리 절차에 적용됩니다.

2. 광계 자당 밀도 구배 준비

1. 그라디언트를 붓는 세 주식 솔루션이 필요합니다 :
   1. 2 M 자당
   2. H ₂ 10 % β-DM O
   3. 0.5 M 트리 신, pH가 8.0 (수산화 나트륨)
2. 이러한 주식을 사용하여, 다음과 같은 솔루션을 준비 :

   농도 :	1.3 M	1.0 M	0.85 M	0.7 M	0.65 M	0.4 M
   2 M 자당	13 ML	10 ㎖	8.5 ML	7 ML	6.5 ML	4 ML
   10 %46;-DM	100 μL	100 μL	100 μL	100 μL	100 μL	100 μL
   0.5 M 트리 신	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL	200 μL
   H 2 O	6.7 ML	9.7 ML	11.2 ML	12.7 ML	13.2 ML	15.7 ML

3. 14mm X 89mm의 원심 분리기 튜브를 사용하여 낮은 밀도 솔루션에 가장 높은 자당 밀도 솔루션을 시작, 아주 천천히 그라데이션을 붓는다.
4. 솔루션의 나머지 부분에 대한 1.3 및 1.0 M 솔루션 및 2 ㎖ 만 1 ㎖를 각각 붓는다.
5. 추운 방에서 하룻밤 그라데이션을 남겨주세요.

3. 혐기성 유도 및 틸라코이드 막 ^8의 분리

1. 틸라코이드 막의 분리 시작 전에 4 시간 동안 아르곤으로 버블 링시킴으로써 혐기성 조건을 유도한다. 버블 링은 자기 교반 막대로 배양 일정한 혼합하면서 플라스크 배양에서 유리 피펫을 통해 수행 될 수있다.
2. 2,500 XG에서 5 분 동안 세포를 펠렛으로 틸라코이드 막 분리 시작, H1 버퍼에 resuspend (0.3 M 자당, 25 mM의 HEPES (산도 7.5), 5 mM의 _MgCl2를).
   (주의하시기 바랍니다 틸라코이드 막 샘플 쉬의 분리로 시작하는 경우단백질 분해를 방지하기 위해 얼음에 보관해야 울드, 모든 원심 분리 단계는 4 ° C에서 수행되는 장갑 작업을 강력하게 각질 오염을 방지하는 것이 좋습니다.)
3. 2,500 XG, H1 버퍼에 resuspend에서 5 분 펠렛 세포.
4. 1500 고전력 증폭기의 질소 압력 분무기를 통해 두 구절 세포를 파괴 (세포 벽이없는 변종에 대해 하나의 통로를 수행).
5. 2,500 X g에서 12 분 동안 세포를 스핀 다운.
   (이 단계 후 상등액을하지 않을 경우, 세포의 파괴에 성공하지 못한, 밝은 녹색이어야합니다.)
6. H2 버퍼 (0.3 M 자당, 5 mM의 HEPES (산도 7.5), 10 mM의 EDTA (산도 8.0)) 및 32,800 X g에서 10 분 동안 펠렛 세포를 Resuspend 세포.
7. H3 버퍼를 Resuspend 세포 (1.8 M 자당, 5 mM의 HEPES (산도 7.5), 10 mM의 EDTA (산도 8.0))와 포터 (녹색이 입자가이 작업 단계의 마지막에 남아 있어야합니다)와 펠렛을 균질화.
8. 욕조에 틸라코이드 자당 밀도 구배를 준비12 ㎖의 H3의 층으로 맨 아래에 시작하여 에스는 (25mm X 89mm) 12 ㎖를 H4 버퍼의 중간 계층을 부어 세포와 버퍼 (1.3 M 자당, 5 mM의 HEPES (산도 7.5), 10 mM의 EDTA ( 산도 8.0))와 최고 12 ML H5 버퍼에 (0.5 M 자당, 5 mM의 HEPES (산도 7.5), 10 mM의 EDTA (산도 8.0)). 그라디언트를 주입 할 때주의하고, 3 개의 층으로 혼합하지 마십시오.
9. H5는 X g 70,700에서 1 시간 동안 버퍼와 원심 분리기 틸라코이드 자당 밀도 구배와 균형.
10. 틸라코이드 자당 밀도 구배에서 틸라코이드 밴드를 제거하고 적절한 볼륨 H6 버퍼 (5 mM의 HEPES (산도 7.5) 10 mM의 EDTA (산도 8.0))로 희석.
11. 20 분 동안 37,900 XG에서 세포를 스핀 다운. 펠릿 타이트하지 않으면 더 H6 버퍼는이 원심 분리 공정을 위해 요구된다.
12. 작은 볼륨 H6 버퍼에 틸라코이드를 재현 탁하고 엽록소 농도의 결정을 진행합니다.

4. 엽록소 농도 ^31의 결정

1. 클로로필 량의 결정은 80 % 아세톤으로 수행된다.
2. 995 μL에게 80 %의 아세톤과 H6 버퍼에 틸라코이드의 5 μL (희석 1:200)를 섞는다.
3. 몇 초 동안 소용돌이 녹색이​​ 입자가 남아 다음 5 분 동안 14.1 XG에 스핀 다운 할 때까지.
4. 상층 액을 각각 663.6 및 646.6 ㎚, 750 ㎚에서 흡광을 측정합니다.
5. 다음과 같은 수식을 사용하여 엽록소의 양을 계산합니다 :
   1. C _엽록소 [㎎ / ㎖] = (0.01225 * E _{663.6-0.00255} * E _646,6) * 희석 계수
   2. C _{엽록소 B} [㎎ / ㎖] = (0.02031 * E _{646.6-0.00491} * E _663.6) * 희석 계수
   3. C _엽록소 [㎎ / ㎖ = C _엽록소 + C _{엽록소의 B}

5. 광계 자당 밀도 구배로드

1. 필요한 틸라코이드, β-DM 및 H6 버퍼의 양을 계산각 그라데이션 :
   1. 각 그라데이션은 0.9 % β-DM (H ₂ O에서 β-DM을 용해) 0.8 ㎎ / ㎖ 엽록소와 700 μL의 총 부피로로드해야합니다, H6 버퍼와 나머지 볼륨을 작성하십시오.
2. 가용화 각 그라데이션 틸라코이드, β-DM 및 H6 버퍼와 다른 분취를 준비합니다.
3. 정기적으로 (반전) 몇 분 간격 (가용화 단계)를 혼합 얼음에 20 분 동안 샘플을 둡니다.
4. 4 ℃에서 10 분 동안 최대 속도 (14,000 XG)에서 원심 분리기
   (상층 액은 진한 녹색 동안 원심 분리 한 후, 펠릿은 작고 흰해야합니다.)
5. 그라디언트에 뜨는을로드합니다.
6. H6 버퍼와 4 ℃에서 (14 시간) 밤새 134,470 XG에서 초 원심 분리기를 사용하여 회전과 균형
   (저기서 때이 프로토콜에 제시된 광계 자당 밀도 구배를 이용하여 광합성 단지의 성공적인 분리 만 달성된다는 점에 유의하시기 바랍니다가용화하고 복잡한 분리에 대한 예측이 전에 냉동 된 틸라코이드 막 작업을 할 때 만드는 어렵 기 때문에 g 갓 틸라코이드을입니다.)

6. 광계 자당 밀도 구배 분류

1. 그라디언트의 사진을 촬영합니다.
2. 500 μL를 튜브에 바늘과 분별 그라디언트를 사용하여 튜브의 바닥에 구멍을 천공. 대안 적으로, 분별 증류는 96 - 웰 플레이트 (마이크로)를 사용하여 수행 될 수있다.
3. 마이크로 플레이트를 사용하는 경우, 675 nm에서 다른 그라데이션 분획의 흡광도를 결정한다.
   (이 단계 샘플에서 몇 주 동안 -80 ° C에 저장할 수 있습니다.)

7. SDS-PAGE 및 면역 검출

(만 ΔPSI 대 WT의 비교를 위해 웨스턴 블롯 분석은 이후 MS 분석의 분수를 선택하기 위해 수행 된 것을 양해 해 주시기 바랍니다. 실험 WT 대 pgrl1 FR동작은 다른 분획의 흡광도에 의해 선택되었다.)

1. 13 % SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 ³² WT 및 ΔPSI 그라데이션의 각 부분의 분리 30 μL.
2. ANR1 (TEF7) ²⁶ PGRL1 ^(34), CAS ^(6), PSI의 서브 유닛 PSAD ^(32)와 광계 핵심 서브 유닛 D1 : 다음과 같은 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석 ^(33)를 수행합니다. 1:10,000의 희석으로 표기 D1 항체를 제외하고 (강화 된 화학 발광 검출 기법을위한)의 1:1,000 희석액과 함께 모든 항체를 사용한다.
3. 면역의 결과를 바탕으로, WT 및 ΔPSI에 대한 ANR1, PGRL1 및 PSAD의 피크 분획 (각각 여기에 분수 6, 13,) 가지고 WT 및 ΔPSI에서 분수 6의 30 μl를 혼합 비율 13에서와 동일한 작업을 수행 모두 준비하고 13 % SDS 폴리 아크릴 아미드 겔에서 다시 분리.
4. WT 대 pgrl1의 정량적 인 비교를 위해 C 취다른 그라데이션 분획의 흡광도를 측정하여 결정하고 13 % SDS 폴리 아크릴 아미드 겔에서 분리 한 다음 두 샘플의 30 μL를 혼합으로 EF-supercomplex 분획.
5. 4 ℃에서 상온 이상 밤 2 시간 동안 쿠마 용액 (85 ​​% 인산, 757 MM의 황산 암모늄, 1.2 % 쿠마 화려한 파란색, 20 % 메탄올)와 단백질 밴드를 얼룩
6. 불특정 얼룩을 제거하려면, DDH ₂ O와 여러 번 세탁
7. 1mm 젤 조각으로 차선을 차단하고있는 젤 소화를 진행합니다.
   (다른 방법으로, 샘플은 진공 원심 분리기에 몇 분을 건조하고있는 젤 소화를 계속하기 전에 몇 주 동안 저장할 수 있습니다.)

8. 에서 젤 소화 (셰브첸코 등. ^35에서 수정 된)

곧 사용하기 전에 모든 버퍼 및 솔루션을 준비하고 아세토 니트릴 (ACN)를 포함하는 버퍼 유리 병을 위해주의하시기 바랍니다.
주의! ACN과 함께 작업하는 것은 해로울 수 있습니다, 자세한 내용은에서 다운로드 할 수 있습니다 http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927335 (2013).

1. 30 초 동안 DDH ₂ O (~ 200 μL)의> 10 권과 젤 조각을 씻으십시오.
2. 흔들어 15 분간 25 mM의 NH ₄ HCO _3의 300 μL와 젤 조각을 품어 액체를 제거합니다.
3. 흔들어 15 분 (1:1의 비율로 ACN 50 mM의 NH ₄ HCO _3을 혼합하여 준비) 액체를 제거 50 % ACN에서 25 mM의 NH ₄ HCO _3의 300 μL와 젤 조각을 품어.
4. 겔 조각은 아직 블루 경우에, 쿠마의 대부분이 제거 될 때까지 NH ₄ HCO ₃ 및 NH ₄ HCO ₃ / ACN가 흘려 반복한다.
   (쿠마시 염색의 벌크가 제거되어야하지만, 완전히 겔 조각 destain 할 필요는 없다.)
5. 5 분 동안 젤 조각을 탈수 ACN 100 μl를 추가합니다. 겔 조각을 축소해야ND 완전히 흰색 본다.
6. 가능한 한 많은 ACN을 제거하고 트립신 소화를 진행합니다. 또한, 샘플 몇 주 동안 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
7. 20 NG의 밴드 당 20 μl를 추가 / 10 % 트립신 μL ACN / 25 mM의 NH ₄ HCO ₃ (갓 희석), 얼음에 샘플을 유지합니다.
8. 30 분 후 모든 솔루션이 흡수 된 경우, 확인하고 필요한 경우, 더 트립신 버퍼를 추가합니다. 젤 조각이 완전히 트립신 버퍼로 덮여해야합니다. 얼음에 샘플을 보관하십시오.
9. 트립신을 포화 얼음에 또 다른 90 분 동안 젤 조각을 남겨주세요.
   (긴급 단계 : 트립신 펩티드의 수율은 탓 폴리 아크릴 아미드 매트릭스에 효소의 느린 확산, 얼음 위에서 배양 시간이 증가함에 따라 상당히 증가 그것은 피할 겔 조각을 피복 용액의 작은 과량을 가질 필요가 있다고 조각. 하룻밤 배양 동안 건조한 가을.)
10. 4 ~ 6 시​​간 동안 37 ° C에서 소화. 필요로하는 실험최대 펩타이드 복구, 밤새 소화.
11. 소화 후 응축 된 버퍼를 스핀 다운.
12. 5 분 동안 초음파 처리 관은 다시 펩티드와 원심 분리기를 용출한다.
13. 상층 액을 수집하고 새로운 튜브로 전송할 수 있습니다.
14. 15 분 동안 초음파 욕조에서 30 % ACN / 1 % 포름산 (FA)의 80 μL와 펩타이드 추출을 수행합니다.
15. 15 분 동안 초음파 욕조에서 30 % ACN / 1 % FA 80 μL로 추출을 수행합니다.
16. 15 분 동안 초음파 욕조에서 70 % ACN / 1 % FA 80 μL로 추출을 수행합니다.
17. 이전 용출액을 다시 수영장을 뜨는 원심 분리기.
    (FA는 트립신을 불 활성화 및 펩타이드의 용해도를 증가시키는 역할을한다.)
18. 완전 진공 원심 분리기 드라이 펩타이드 솔루션을 제공합니다.
    (이 시점에서 시료를 MS 분석을 진행하기 전에 -20 ° C에서 몇 주 동안 저장할 수 있습니다.)
19. 6 μL MS 버퍼 (5 % ACN, 0.1 V / V FA, 물)과 2-5 분 동안 초음파 처리에 재현 탁 펩티드.
20. maximu 원심 분리기 샘플m의 속도로 5 분 미립자 물질을 제거합니다.
21. 질량 분석 분석을 위해 뜨는 4 μl를 사용합니다.

9. "Proteomatic"와 MS-데이터 분석

데이터 분석은 오픈 소스 소프트웨어 (http://www.proteomatic.org/에 다운로드 될 수있다) "Proteomatic"생성 및 MS / MS 데이터 평가 파이프 라인의 완료 사용하여 허용 플랫폼 하였다 무료 및 상용 소프트웨어 ^36. 간단히, 설정은 다음과 같습니다 더 자세한 정보는 ^6,26에서 찾을 수 있습니다.

1. MS 데이터의 확인 및 정량화
   ΔPSI 대 실험 WT에서 확인 및 단백질의 정량은 ^6,26 바와 같이, OMSSA (버전 2.1.4 ^37)와 각각 qTrace ^{26 일에} 수행되었습니다. 다음 업데이트 파이프 pgrl1 실험 WT 대에서 MS 데이터 분석에 사용 하였다 :
   1. OMSSA ^37뿐만 아니라, 단백질은 X로 확인되었다! 탠덤 (버전 2013년 2월 1일 ^38). 두 알고리즘 모두가 NCBI의 합류 데이터베이스에 대해 오거스타 데이터베이스 버전 10.2 등으로 JGI 인 Chlamydomonas 유전자 모델 데이터베이스의 버전 4.3을 결합하여 생성 된 데이터베이스에 대해 검색하여 적용된 BK000554.2 및 NC_001638.1을 데이터베이스.
   2. 펩티드의 MS ² 식별은 타겟 디코이 접근법 ^39을 사용하여 수행 하였다. 각 단백질 미끼는 nonproteotypic 펩티드의 중복을 유지하면서 무작위로 트립신 펩티드를 걸어 갔다에 의해 만들어졌습니다.
   3. 펩티드의 통계적 검증은 0.01 미만 및 결과는 5 ppm으로 전구체 질량 허용 오차로 여과 하였다 후방 오류 확률 (PEP) 임계 값을 사용하여 소프트웨어 qvality (버전 0.3.3 ^40)를 수행 하였다.
   4. OMSSA 및 X에서 펩티드! 탠덤 실행은 qTrace과 결합 및 정량화 ^{다음 필터 단계를 적용 (26)는 : MS 2의 확인이 필요합니다 단백질 이름 / 그룹 정보를 추가하고 두 자매 펩티드를 필요로합니다.}

단백질 비율은 WT와 pgrl1에서 혼합 CEF-supercomplex 분획에서 서로를 향해 크게 달랐다 여부를 조사하기 위해, 통계 분석은 SPSS 소프트웨어 (버전 21)를 적용 하였다. 시토크롬 B ₆ / F 복합체의 서브 유니트는 서로뿐만 아니라 단백질 FNR, FTSH2 및 PSI 소단위 대하여 HCF136 대해 시험 하였다. 네 복제물의 단백질 당 각 스캔 횟수의 펩티드 비는 샤피로 - 윌크스 테스트와 정규 분포에 대한 검사를했다. 펩티드 집단이 정상적으로 (p <0.001) 분배되지 않았기 때문에, 비모수 통계를 수행 하였다. 첫째, 크루스 칼 - 월리스 시험은 그룹 간 유의 한 차이를 평가에 적용 하였다. 이 테스트는 상당한 차이를 예측하는 경우에만그룹 사이의는 추가 분석은 맨 - 휘트니 U-테스트와 함께 두 개의 독립적 인 군 사이에 유의 한 차이를 예측하기 위해 수행되었다.

결과

도입 정량 프로테오믹스 방법은 유 전적으로 다른 C.에서 CEF-supercomplex 성분의 비교 분석에 의해 입증 틸라코이드 막에 multiprotein의 복합체 조성물을 특성화하는 것을 목표 긴장을 reinhardtii. 설명 메서드가 성공적으로 테라지마 등. ⁶ 적용 및 세제 가용화 혐기성 성장 문화의 틸라코이드 막,의 분리를 포함하고있다. 이어서, 샘플은 동일한 엽록소 량에 기초 자당 밀도 구?...

토론

안정 동위 원소 표지를 사용하여 다른 정량 프로테오믹스 연구는 지난 몇 년에 출판되었다​​. 이 실험에서 일반적으로 두 개의 서로 다른 샘플을 하나의 샘플이 안정 동위 원소로 표지 된의, 비교됩니다. 그 후 두 샘플에서 단백질이나 펩티드는 동일한 비율로 결합되어 더욱 함께 ⁴⁸ 가공. 이러한 연구들은 조사를 위해 다른 스트레스 조건 ^26,34,49에 노출 된 정의 고립 된 세포 구?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Acetic acid	AppliChem	A0662	http://www.applichem.com/home/
Acetone	AppliChem	A2300	http://www.applichem.com/home/
Acetonitrile Optigrade für LC-MS	Diagonal	9340	Harmful, work with gloves. See protocol text for further precautions. https://www.diagonal.de/
Ammonium chloride 15N	Cambridge Isotope Laboratories	39466-62-1	http://www.isotope.com/cil/index.cfm
Ammonium chloride 14N	AppliChem	A0988	http://www.applichem.com/home/
Ammonium hydrogen phosphate	AppliChem	A3583	http://www.applichem.com/home/
Ammonium sulfate	AppliChem	A3598	http://www.applichem.com/home/
Coomassie brilliant blue R-250	Fisher Scientific	10041653	http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex
n-Dodecyl-β-D-maltoside	AppliChem	A0819	http://www.applichem.com/home/
EDTA	AppliChem	A2937	http://www.applichem.com/home/
Formic acid	AppliChem	A3858	http://www.applichem.com/home/
HEPES	AppliChem	A3724	http://www.applichem.com/home/
Magnesium chloride	AppliChem	A4425	http://www.applichem.com/home/
Methanol	AppliChem	A2954	http://www.applichem.com/home/
Phosphorous acid	AppliChem	A0989	http://www.applichem.com/home/
Dipotassium hydrogen phosphate	AppliChem	A1042	http://www.applichem.com/home/
Potassium dihydrogen phosphate	AppliChem	A1043	http://www.applichem.com/home/
Sodium hydroxide	AppliChem	A1551	http://www.applichem.com/home/
Sucrose	AppliChem	A1125	http://www.applichem.com/home/
Tricine	AppliChem	A3954	http://www.applichem.com/home/
Tris	AppliChem	A2264	http://www.applichem.com/home/
Trypsin (sequencing grade modified) and Trypsin buffer	Promega	V5111	http://www.promega.de/
Equipment
Nebulizer (BioNeb cell disruptor)	Glas-Col		http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75
Centrifuge tubes (14 mm x 89 mm)	Beckman Coulter	331372	for preparation of Takahashi style gradients http://www.beckmancoulter.de/
Centrifuge tubes 25 mm x 89 mm	Beckman Coulter	344058	for preparation of thylakoid isolation gradients. http://www.beckmancoulter.de/
Coulter Avanti Centrifuge J-20 XP	Beckman Coulter		http://www.beckmancoulter.de/
Fuchs-Rosenthal cell couting chamber	Diagonal	449/72	https://www.diagonal.de/
Homogenizer (Potter) 50 ml	Fisherbrand	10618242	http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand
Pistil for homogenizer	Fisherbrand	105252220	http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand
Ultracentrifuge (Optima XPN-80 Ultracentrifuge)	Beckman Coulter		website: http://www.beckmancoulter.de/
Other
Antibodies	Agrisera		http://www.agrisera.com/en/index.html