גישה חדשה לניתוח השוואתי של multiprotein מכלולים בהתבסס על<sup&gt; 15</sup&gt; N מטבולית תיוג וכמותי ספקטרומטריית המסה

Summary

הגישה המתוארת ההשוואתית, כמותית proteomic מטרתה קבלת תובנות לתוך הרכב של מתחמי multiprotein בתנאים שונים ומודגמת על ידי השוואת זנים שונים מבחינה גנטית. ניתוח כמותי כמויות שווה של שברים שונים מצפיפות סוכרוז שיפוע מעורבבות ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסה.

Abstract

הפרוטוקול הציג מספק כלי לניתוח של מתחמי multiprotein בקרום thylakoid, על ידי גילוי תובנות קומפוזיציה מורכבת בתנאים שונים. בפרוטוקול זה הגישה באה לידי ביטוי על ידי השוואת הרכב של החלבון האחראי מורכב עבור זרימה מחזורית אלקטרונים (CEF) בChlamydomonas reinhardtii, מבודדת מזנים שונים מבחינה גנטית. ההליך כולל בידוד של קרומי thylakoid, ואחרי הפרידה שלהם למתחמי multiprotein ידי צנטריפוגה סוכרוז שיפוע צפיפות, SDS-PAGE, immunodetection וספקטרומטריית השוואתית, כמותית מסה (MS) המבוססת על תיוג ההפרש מטבולים ⁽¹⁴ N / ¹⁵ N) של זנים נותחו. קרומי thylakoid solubilized דטרגנט נטענים על הדרגות צפיפות סוכרוז בריכוז כלורופיל שווה. לאחר ultracentrifugation, ההדרגות מופרדות לשברים, אשר נותחו על ידי המוני spectrometר"י מבוסס על נפח שווה. גישה זו מאפשרת החקירה של הרכב בתוך השברים השיפוע ויותר מכך כדי לנתח את התנהגות הנדידה של חלבונים שונים, המתמקדת בעיקר על ANR1, CAS, וPGRL1. יתר על כן, שיטה זו באה לידי ביטוי על ידי המאשר את התוצאות עם immunoblotting ובנוסף על ידי תמיכה בממצאים ממחקרים קודמים (זיהוי וההגירה PSI תלוי של חלבונים שתוארו בעבר להיות חלק מCEF-supercomplex כגון PGRL1, FNR, ו cyt ו). יש לציין, גישה זו היא ישימה לטיפול במגוון רחב של שאלות שלפרוטוקול זה יכול להיות מאומץ ודוגמה המשמשת לניתוחים השוואתיים של קומפוזיציה מורכבת multiprotein מבודד מהתנאים סביבתיים שונים.

Introduction

תהליכי פוטוסינתזה בקרומי thylakoid של צמחים ואצות יכולים לתפקד במצב ליניארי והמחזורי. במהלך זרימת אלקטרונים ליניארי photosystem (LEF) אני (PSI), photosystem השנייה (PSII) ו ₆ / ו ב ציטוכרום סופו של דבר להעביר אלקטרונים ממים לNADP ¹ +, מוביל את הדור של NADPH ו-ATP ^2. בניגוד לכך, זרימה מחזורית אלקטרונים (CEF), אשר ידועה להיות מושרה בתנאים סביבתיים מגוונים כמו תנאי מדינה 2 ³ ואנאירוביים ^4, תוצאות מחדש הירידה של PSI חמצון על ידי הזרקה של אלקטרונים בחזרה לשרשרת העברת האלקטרונים. תהליך זה יכול להתרחש גם בצד של סטרומה ב ציטוכרום המורכב ₆ / F ¹ או בבריכת plastoquinone ⁵ ומייצר ATP, אך לא NADPH ^2.

מטרת הפרוטוקול המובא היא להדגים ספקטרומטריית מסה מ '(MS) המבוססethod לניתוח ההשוואתי, כמותי של מתחמי multiprotein בקרומי thylakoid של Chlamydomonas reinhardtii לקבל תובנות לתוך הרכב של מתחמים אלה בתנאים שונים (שהודגם על ידי השוואת זנים שונים מבחינה גנטית). גישה זו יושמה בפרסום על ידי Terashima et al. ב -2012 מראה ² רגולציה ⁺ תלויה Ca של CEF ב C. reinhardtii מתווך על ידי מורכב multiprotein כוללים החלבונים CAS, ANR1, וPGRL1 ^6. ההליך יהיה להיות מוסבר על ידי ניתוח יחסית הרכב CEF-supercomplex בשני זנים שונים מבחינה גנטית, ובכך מנצל את תיוג אחד משני זנים עם חנקן כבד ⁽¹⁵ N). בקצרה, הפרוטוקול כולל בין שאר הכנת קרומי thylakoid, ואחריו solubilization חומרי ניקוי וחלוקה של מתחמי פוטוסינתזה בשיפוע צפיפות סוכרוז. לאחר חלוקה של השיפוע, נבחר fractions של שני זנים מעורבבים המבוסס על נפח שווה, מופרד על ידי-SDS ואחרי עיכול וניתוח MS כמותיים שלאחר מכן בג'ל.

כפי שהוזכר לעיל, CEF הוא מושרה בתנאים סביבתיים שונים ופרסום מהשינה 2010 מדגים את הבידוד של CEF-supercomplex פונקציונלי ממדינה 2 תאים נעולים של ג reinhardtii ^7, אשר בוצע על ידי הפרדת קרומי thylakoid solubilized בשיפוע צפיפות סוכרוז במהלך ultracentrifugation. שונה מאיוואי et al. ^7, הפרוטוקול המובא מתאר את הבידוד של CEF-supercomplex מג אנאירובי גדל תרבויות reinhardtii על ידי ביצוע הליך חלופי. זה כולל שינויים בפרוטוקול בידוד thylakoid כמו גם הבדלים הנוגעים לצעד solubilization והפרדה של קומפלקסי חלבונים על ידי ultracentrifugation. בפרוטוקול הנוכחי, קרומי thylakoidהם מבודדים על ידי יישום ההליך בהוצאת Chua וBennoun ^8, ואילו המאגרים המשמשים להכנת thylakoid ידי איוואי et al. הכיל 25 Mes מ"מ, 0.33 M סוכרוז, 5 מ"מ MgCl _2, 1.5 מ"מ NaCl (pH 6.5) כפי שתואר ^9. Solubilization בוצע עם חומר ניקוי 0.7-0.8% (n-tridecyl-β-D-maltoside) ל30 דקות על קרח במקרה של איוי ועמיתים לעבודה, ואילו בשיטת solubilization המתוארת כאן מסתמכת על השימוש בחומרי ניקוי 0.9% (n -Dodecyl-β-D-maltoside (β-DM)) והיא מבוצעת רק 20 דקות על קרח. שני הקבוצות השתמשו 0.8 מ"ג כלורופיל לכל מיליליטר לsolubilization עם חומר הניקוי המתאים. להפרדה של קומפלקסים פוטוסינתטיים מקרומי thylakoid solubilized איוואי et al. מיושם ריכוזי סוכרוז בין 0.1-1.3 M, ואילו מחברים של פרוטוקול זה משמשים ריכוזים הנעים .4-1.3 מ 'ההבדל האחרון היא מהירות צנטריפוגה, שהוא נמוך יותר בהשוואה לeaפרסום rlier.

Solubilization של קרומי thylakoid עם חומרי ניקוי nonionic אחרי חלוקה צפיפות סוכרוז שיפוע כבר הותקן במספר רב של מחקרים החל 1980s עד היום ^{7, 9-14} וגם היישום של תיוג חילוף חומרים של חלבונים הוא שיטה נפוצה בתחום פרוטאומיקה. הגישה המתוארת חלה תיוג ¹⁵ N חילוף חומרים לאחד משני הזנים בהשוואה ידי culturing אותו בנוכחותם של חנקן כבד כמקור חנקן יחיד בצורה של ¹⁵ N NH ₄ Cl, אשר שולב כל חומצות אמינו שמובילות למסה משמרת בהתאם לרצף חומצות אמינו של הפפטיד. בעת ניתוח תערובת של ¹⁴ N ^ו15 N בתוך אחד MS לרוץ, משמרת מסה זו יכולה לשמש כדי לקבוע את מקורם המדגם עבור כל הפפטיד ופפטיד היחסי ניתן לחשב שכיחותם מייצגת שכיחותם היחסית עבור להתכתבing חלבון ^15.

מחקרי פרוטאומיקה כמותיים רבים על ג reinhardtii זמין, אשר משווה כמות מוגדרת של חלבון כדי לנתח שינויים בproteome בין תנאי ניסוי (למשל שינויים בproteome בשל תזונתי ^16-19 או אור לחץ ^20,21). בהשוואה למחקרים אלה, בגישה שהוצגה כיום כמויות שווה של דגימות משולבות ונותחו. התקנה זו מאפשרת ללמוד את התנהגות הנדידה של חלבונים בתוך השיפוע ויותר מכך כדי לנתח את ההרכב של מתחמים שונים ביחס לזנים הנחקרים.

שיטה זו להיות מוסברת על ידי בעיקר להתרכז בשלושה חלבונים: המועמד הראשון הוא CAS חלבון חיישן סידן מקומי הכלורופלסט, אשר הוצג להיות מעורבים בצילום ההסתגלות בג reinhardtii ^22. סידן נחשב אות חשובהing יון למסלולים אשר מופעלים כתוצאה מלחצים ביוטיים ואביוטי שונים סופו של דבר מוביל לשינויים בביטוי גנים ותא פיזיולוגיה ²³ והוצעו כי כלורופלסטים עשויים לתרום לסלולרי Ca ^{2 +} איתות באמצעות חלבון CAS ^22,24,25. החלבון השני הוא ANR1 (תגובה אנאירובית 1 ^6), חלבון שהוצג להיגרם תחת תנאי גידול anoxic בג reinhardtii ^26. יש לציין, CAS, כמו גם ANR1 זוהו כיחידות משנה של CEF-supercomplex ויותר מכך, על ידי שימוש בגישות גנטיות הפוכה, זה היה הוכיח כי שני החלבונים תורמים מבחינה תפקודית לCEF in vivo ^6, תומכים בתפקידם כיחידות משנה תפקודית של חלבון מורכב זה. החלבון השלישי הוא חלבון thylakoid PGR5-Like 1 (PGRL1), שהוצג להיות מעורבים בCEF בChlamydomonas ^4,27 כמו גם בארבידופסיס ^5,28 והיה גם identified בעבודתו של אל איוואי et. ⁷

גישה זו יוצגו על ידי המציג את התוצאות של שני ניסויים שונים: wildtype (WT) לעומת זן ΔPSI ²⁹ (לעומת), מציג מחיקה של גן psab, קידוד לphotosystem החיונית למקטע, שהוא גם חלק מ CEF-supercomplex וWT לעומת pgrl1 עקום החוצה רצף ^4. עבור כל אחד מניסויים אלה בהרכב הכמותי של CEF-supercomplex בין ¹⁵ N-ומתח ¹⁴ N שכותרתו הושווה.

Protocol

1. Culturing של Chlamydomonas

1. ג הבא reinhardtii זנים ששימשו במחקר הנוכחי: cc124 WT, cw15-arg7 WT (auxotroph הלקוי וארגינין תא קיר), זן ΔPSI מוטציה ²⁹ ומתח עקום החוצה pgrl1 ^4.
2. כל הזנים גדלו בטריס-אצטט פוספט (TAP) בינוני ^30, ב ° C25 בעוצמה מתמשכת אור 20-50 μE / מ ² שניות ורועד ב120 סל"ד. התרבות של ΔPSI צריכה להיות עטופה בנייר אריזה דק לחשיפה לאור של <5 μE / מ ² שניות.
3. התרבויות של זני שכותרתו (ΔPSI וcc124 WT, בהתאמה) הכילו 7.5 מ"מ ¹⁵ N NH ₄ Cl, ואילו התרבויות לזני nonlabeled (WT cw15-arg7 וpgrl1, בהתאמה) הכילו 7.5 מ"מ ¹⁴ N ₄ Cl NH. תאים צריכים לגדול במשך לפחות ארבעה generatיונים כדי להשיג את תיוג ומלא חייבים להיות כל הזמן בשלב צמיחה מעריכית.
4. ביום שלפני תחילת הניסוי לספור ולדלל תאים לצפיפות של 1 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר בנפח של לפחות 750 מיליליטר / מתח.

שים לב ששני סוגים של מילויים צפיפות סוכרוז רציפים מתוארים בפרוטוקול הבא. הדרגתיים בצפיפות סוכרוז photosystem פי טקהאשי et al. ⁹ משמשים להפריד קומפלקסי חלבוני פוטוסינתזה השונים מthylakoids המבודד וsolubilized במהלך צנטריפוגה על הלילה וצריך להיות מוכן היום לפני (ראה פרוטוקול 2) והדרגתי בצפיפות סוכרוז thylakoid ⁸ מיושמים בהליך בידוד thylakoid (ראה פרוטוקול 3).

2. הכנת עירובי צפיפות photosystem סוכרוז

1. למילוי הדרגתיים שלושה פתרונות מניות יש צורך:
   1. 2 M סוכרוז
   2. 10% β-DM בH ₂ O
   3. 0.5 M tricine, pH 8.0 (NaOH)
2. באמצעות מניות אלה, להכין את הפתרונות הבאים:

   ריכוז:	1.3 M	1.0 M	0.85 M	0.7 M	0.65 M	0.4 M
   2 M סוכרוז	13 מיליליטר	10 מיליליטר	8.5 מיליליטר	7 מיליליטר	6.5 מיליליטר	4 מיליליטר
   10%46;-DM	100 μl	100 μl	100 μl	100 μl	100 μl	100 μl
   0.5 M tricine	200 μl	200 μl	200 μl	200 μl	200 μl	200 μl
   H 2 O	6.7 מיליליטר	9.7 מיליליטר	11.2 מיליליטר	12.7 מיליליטר	13.2 מיליליטר	15.7 מיליליטר

3. השתמש בצינורות צנטריפוגה x 89 מ"מ 14 מ"מ ויוצקים הדרגתיים לאט לאט, מתחיל עם פתרון צפיפות סוכרוז הגבוה ביותר לפתרון צפיפות נמוך יותר.
4. יוצקים רק 1 מיליליטר כל אחד ל1.3 ו1.0 M פתרונות ו2 מ"ל לשאר הפתרונות.
5. השאר הדרגתיים לילה בחדר הקר.

3. אנאירובי אינדוקציה ובידוד של Thylakoid ממברנות ⁸

1. לפני שמתחיל עם הבידוד של קרומי thylakoid, לגרום לתנאים אנאירוביים ידי מבעבע עם ארגון במשך 4 שעות. המבעבע יכול להתבצע באמצעות פיפטה זכוכית בculturing צלוחיות עם ערבוב מתמיד של התרבות עם בר ומערבב מגנטי.
2. התחל עם הבידוד של קרומי thylakoid ידי pelleting התאים 5 דקות ב2,500 XG, resuspend במאגר H1 (0.3 M סוכרוז, 25 HEPES מ"מ (pH 7.5), 5 מ"מ MgCl _2).
   (שים לב שכאשר מתחילים עם הבידוד של sh דגימות קרומי thylakoidולד לשמור על קרח, כדי למנוע פירוק חלבונים, בכל צעדי צנטריפוגה מבוצעים על 4 מעלות צלזיוס ועבודה עם כפפות מומלצת בחום כדי למנוע זיהום קרטין).
3. תאים גלולה במשך 5 דקות ב2,500 XG, resuspend במאגר H1.
4. לשבור את התאים עם שני קטעים באמצעות nebulizer עם לחץ חנקן של 1,500 hPa (לזנים ללא דופן תא לעשות רק קטע אחד).
5. ספין למטה תאים למשך 7 דקות ב2,500 x גרם.
   (לאחר שלב זה supernatant צריך להיות בצבע ירוק בהיר, אם לא, שבירת התא לא הייתה מוצלחת.)
6. תאי resuspend במאגר H2 (0.3 M סוכרוז, 5 מ"מ HEPES (pH 7.5), 10 mM EDTA (pH 8.0)) ותאי גלולה 10 דקות ב 32,800 x גרם.
7. תאי resuspend במאגר H3 (1.8 M סוכרוז, 5 מ"מ HEPES (pH 7.5), 10 mM EDTA (pH 8.0)) וhomogenize גלולה קדר (אין חלקיקים ירוקים צריכים להישאר בסופו של שלב זה עובד) עם.
8. הכן הדרגתיים צפיפות סוכרוז thylakoid באמבטיהes (25 מ"מ x 89 מ"מ) על ידי הפעלה בתחתית בשכבה של 12 מיליליטר H3 חיץ עם תאים, יוצק שכבה אמצעית של 12 מיליליטר חיץ H4 (1.3 M סוכרוז, 5 מ"מ HEPES (pH 7.5), 10 mM EDTA ( pH 8.0)) ועל חיץ H5 העליון 12 מיליליטר (0.5 M סוכרוז, 5 מ"מ HEPES (pH 7.5), 10 mM EDTA (pH 8.0)). היזהר בעת המזיגה הדרגתיים ולהימנע מהערבוב של שלוש שכבות.
9. איזון עם H5 חיץ והדרגות צפיפות צנטריפוגה thylakoid סוכרוז לשעה 1 ב70,700 x גרם.
10. הסר להקות thylakoid מהדרגות צפיפות סוכרוז thylakoid ולדלל אותם עם מאגר H6 הנפח מתאים (5 HEPES מ"מ (pH 7.5) 10 mM EDTA (pH 8.0)).
11. ספין למטה תאים ב XG 37,900 עבור 20 דקות. אם גלולה היא לא חזק, יותר חיץ H6 נדרש לצעד צנטריפוגה זו.
12. Resuspend thylakoids בחיץ H6 נפח קטן ולהמשיך בנחישות של ריכוז כלורופיל.

4. קביעת ריכוז הכלורופיל ^{ביום 31}

1. קביעת סכום כלורופיל מתבצעת עם אצטון 80%.
2. מערבבים 995 μl אצטון 80% ו -5 μl של thylakoids במאגר H6 (דילול 1:200).
3. וורטקס במשך כמה שניות עד שלא יישארו חלקיקים ירוקים ולאחר מכן ספין למטה ב14.1 XG במשך 5 דקות.
4. קח את supernatant ולמדוד את ההכחדה ב663.6 ו646.6 ננומטר ו750 ננומטר, בהתאמה.
5. לחשב את כמות הכלורופיל באמצעות נוסחאות הבאות:
   1. (- _{646,6 0,00255} * E * E .01225 _663.6) גורם לדילול * C _Chl [מ"ג / מיליליטר] =
   2. C _Chl [מ"ג / מיליליטר] _b = (.02031 * E _{646.6-0.00491} * _663.6 E) גורם לדילול *
   3. C _Chl [מ"ג / מיליליטר] = C _Chl C + _{Chl ב}

5. טעינה של עירובי צפיפות photosystem סוכרוז

1. לחשב את סכומי thylakoids, β-DM וחיץ H6 כי יש צורךלכל צבע:
   1. כל שיפוע צריך להיות עמוס בנפח כולל של 700 μl עם 0.8 מ"ג / מיליליטר כלורופיל ב0.9% β-DM (לפזר β-DM בH ₂ O), למלא את הנפח שנותר עם ​​חיץ H6.
2. לsolubilization להכין aliquots שונים עם thylakoids, β-DM וחיץ H6 לכל שיפוע.
3. עזוב את הדגימות ל20 דקות על קרח עם ערבוב באופן קבוע (היפוך) כל (צעד solubilization) כמה דקות.
4. צנטריפוגה במהירות המרבית (14,000 XG) במשך 10 דקות ב 4 ° C.
   (לאחר צנטריפוגה, גלולה צריכה להיות קטנה ולבנבן ואילו את supernatant הוא ירוק כהה.)
5. טען supernatant על ההדרגות.
6. איזון עם H6 חיץ וספין באמצעות ultracentrifuge ב134,470 XG הלילה (14 hr) ב 4 ° C.
   (שים לב שההפרדה המוצלחת של קומפלקסים פוטוסינתטיים באמצעות הדרגתיים צפיפות סוכרוז photosystem כפי שהוצג בפרוטוקול זה היא השיג רק כשמנצלגרם מבודד טרי thylakoids, שכן חיזוי לsolubilization והפרדה מורכבת קשה לעשות כאשר עובד עם ממברנות thylakoid שהוקפאו בעבר.)

6. חלוקה של עירובי צפיפות photosystem סוכרוז

1. קח תמונות של ההדרגות.
2. לנקב חור בחלק התחתון של הצינור באמצעות מחט והדרגות fractionate ב500 צינורות μl. לחלופין, חלוקה יכולה גם להתבצע באמצעות צלחת 96 היטב (microplate).
3. בעת השימוש בmicroplate, לקבוע הספיגה של השברים שיפוע השונים ב675 ננומטר.
   (בדגימות שלב זה ניתן לאחסן ב-80 ° C לכמה שבועות.)

7. SDS-PAGE וimmunodetection

(שים לב שרק להשוואה של WT לעומת ΔPSI ניתוח כתם מערבי שבוצע כדי לבחור את השברים עבור MS-ניתוח שלאחר מכן. לניסוי WT לעומת pgrl1 frפעולות נבחרו בדרך של הספיגה בברים השונים.)

1. 30 μl הנפרד של כל חלק משיפוע WT וΔPSI על 13% ג'ל polyacrylamide SDS ^32.
2. ביצוע ניתוח כתם מערבי ³³ באמצעות הנוגדנים הבאים: ANR1 (TEF7) ^26, PGRL1 ^34, CAS ^6, PSAD מקטע PSI ³² וD1 מקטע ליבת PSII. השתמש בכל הנוגדנים עם דילול של 1:1,000 (לטכניקת זיהוי chemiluminescence משופרת), פרט לנוגדן D1, שאמור להיות בשימוש עם דילול של 1:10,000.
3. בהתבסס על התוצאות של immunodetection, לקחת את שברי השיא של ANR1, PGRL1 וPSAD לWT וΔPSI (כאן שברים 6 ו13, בהתאמה), לערבב 30 μl של שבריר 6 מ WT וΔPSI ולעשות את אותו הדבר עם חלק מ13 שני ההכנות ולהפריד אותם שוב על 13% ג'ל polyacrylamide SDS.
4. להשוואת כמותית של WT לעומת pgrl1 לקחת Cשברים EF-supercomplex כפי שנקבע על ידי מדידת הספיגה בשברי שיפוע השונים ומערבבים 30 μl של שני הדגימות ואחרי הפרדה על 13% ג'ל polyacrylamide SDS.
5. כתם להקות חלבון עם פתרון Coomassie (85% חומצה זרחנית, אמוניום סולפט 757 מ"מ, .1.2% מתנול Coomassie כחול מבריק, 20%) עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר או מעל הלילה ב 4 ° C.
6. כדי להסיר כתמים נוקבים, לשטוף מספר פעמים עם DDH ₂ O.
7. חותכים את הנתיבים לחתיכות ג'ל 1 מ"מ ולהמשיך בעיכול בג'ל.
   (לחלופין, יכולות להיות מיובשות דגימות כמה דקות בצנטריפוגה בואקום ומאוחסנות במשך כמה שבועות לפני שתמשיך בעיכול בג'ל.)

8. עיכול בג'ל (השתנה מבצ'נקו et al. ³⁵⁾

שים לב להכין את כל המאגרים ופתרונות זמן קצר לפני השימוש ולקחת את בקבוקי זכוכית עבור מאגרים המכילים אצטוניטריל (ACN).
זהירות! עבודה עם ACN עלולה להיות מזיקה; מידע נוסף ניתן להוריד מ: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927335 (2013).

1. לשטוף חתיכות ג'ל עם> 10 כרכים של DDH ₂ O (~ μl 200) ל30 שניות.
2. דגירה חתיכות ג'ל עם 300 μl של 25 מ"מ NH ₄ HCO ₃ דקות ל15 עם רעד, להסיר נוזלי.
3. דגירה חתיכות ג'ל עם 300 μl של 25 מ"מ NH ₄ HCO ₃ ב50% ACN (להכין על ידי ערבוב ACN ו50 מ"מ NH ₄ HCO ₃ ביחס של 1:1) לדקות 15 עם רעד, להסיר נוזלי.
4. אם חתיכות ג'ל עדיין כחולות, חזור על NH ₄ HCO ₃ וNH ₄ HCO ₃ / ACN שוטף עד שרוב Coomassie מוסר.
   (למרות שחלק הארי של מכתים Coomassie יש להסיר, זה לא הכרחי לdestain חתיכות ג'ל לחלוטין.)
5. הוספה של ACN 100 μl מייבש את חתיכות ג'ל למשך 5 דקות. חתיכות ג'ל צריכה לכווץnd נראה לבן לגמרי.
6. להסיר כמה שיותר ACN ככל האפשר ולהמשיך בעיכול טריפסין. לחלופין, ניתן לאחסן דגימות ב-20 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות.
7. הוספת 10-20 μl ללהקה של 20 ng / μl טריפסין ב10% ACN / 25 מ"מ NH ₄ HCO ₃ (טרי מדולל), לשמור על דגימות קרח.
8. לאחר 30 דקות, לבדוק אם כל הפתרון היה שקוע ולהוסיף עוד חיץ טריפסין, במידת צורך. חתיכות ג'ל צריכה להיות מכוסות לחלוטין עם חיץ טריפסין. שמור דגימות על קרח.
9. השאר חתיכות ג'ל לעוד 90 דקות על קרח כדי להרוות אותם עם טריפסין.
   (שלב קריטי: התשואה של פפטידים tryptic מגדילה באופן משמעותי עם הגדלת פעמים דגירה על קרח, כנראה בגלל דיפוזיה האיטית של האנזים לתוך מטריצת polyacrylamide זה יש צורך יש עודף קטן של פתרון המכסה את חתיכות ג'ל, כדי למנוע שהחתיכות. נופל יבש במהלך הדגירה הלילה.)
10. לעכל ב37 מעלות צלזיוס למשך 4-6 שעות. לניסויים הדורשיםהתאוששות הפפטיד מקסימלי, לעכל בן לילה.
11. לאחר עיכול ספין למטה חיץ מרוכז.
12. צינורות Sonicate במשך 5 דקות כדי elute פפטידים ו צנטריפוגות שוב.
13. איסוף supernatant ולהעביר אותו לצינור חדש.
14. מבצע חילוץ פפטיד עם 80 μl של 30% ACN 1% חומצה / פורמית (FA) באמבטיה קולית ל15 דקות.
15. מבצע חילוץ עם 80 μl של 30% ACN / 1% FA באמבטיה קולית ל15 דקות.
16. מבצע חילוץ עם 80 μl של 70% ACN / 1% FA באמבטיה קולית ל15 דקות.
17. שוב וsupernatant הבריכה צנטריפוגה עם eluate המוקדם.
    (FA משמש כדי להשבית טריפסין ולהגדיל את מסיסות פפטיד).
18. פתרון פפטיד יבש בצנטריפוגה ואקום לחלוטין.
    (בשלב זה ניתן לאחסן דגימות במשך כמה שבועות ב-20 מעלות צלזיוס לפני שתמשיך עם MS-ניתוח.)
19. פפטידים resuspend ב 6 μl MS חיץ (5% ACN, 0.1 V / V-FA, מים) וsonicate במשך 2-5 דקות.
20. צנטריפוגה דגימות maximuמהירות מ 'במשך 5 דקות כדי להסיר את חלקיקי חומר.
21. השתמש 4 μl של supernatant לניתוח ספקטרומטריה.

9. MS-ניתוח נתונים עם "Proteomatic"

ניתוח הנתונים בוצע עם תוכנת קוד הפתוח "Proteomatic" (אשר ניתן להוריד בhttp://www.proteomatic.org/), פלטפורמה המאפשרת לדור והשלמת צינורות הערכת נתונים MS / MS, באמצעות תוכנה מסחרית וחופשית ^36. בקצרה, ההגדרות מתוארות להלן ניתן למצוא מידע מפורט יותר ^ב6,26.

1. זיהוי וכימות של MS-נתונים
   זיהוי וכימות של חלבונים מWT הניסויים לעומת ΔPSI נעשו עם OMSSA (גרסת 2.1.4 ^{37) ו26} qTrace, בהתאמה, כפי שתוארו ^6,26. לניתוח MS-נתונים מהניסוי לעומת WT pgrl1 המעודכן הצינור הבא היה בשימוש:
   1. בנוסף לOMSSA ^37, חלבונים זוהו גם עם X! טנדם (גרסה 2013/02/01 ^38). שני האלגוריתמים יושמו על ידי חיפוש במסד נתונים שנוצרו על ידי שילוב של גרסת בסיס הנתונים מודל גן JGI Chlamydomonas 4.3 עם גרסת מסד הנתונים של אוגוסטוס 10.2 כמו גם מול מסד נתונים הצטרפו של צמח השדה מסדי נתונים BK000554.2 וNC_001638.1.
   2. MS ² זיהוי של פפטידים בוצע על ידי שימוש בגישה יעד דמה ^39. דמה עבור כל חלבון שנוצר על ידי באופן אקראי דשדוש פפטידים tryptic תוך שמירה על היתירות של פפטידים nonproteotypic.
   3. אימות סטטיסטי של פפטידים בוצעה עם qvality התוכנה (גרסת 0.3.3 ⁴⁰⁾ באמצעות הסתברות שגיאה אחורית (PEP) סף של פחות מ 0.01 והתוצאות סוננו עם סובלנות המונית מבשר של 5 עמודים לדקה.
   4. פפטידים מOMSSA ו-X! ריצות טנדם הצטרפו ולכמת עם qTrace ^{26 החלת צעדי המסנן הבא: דורשים MS 2 זיהוי, להוסיף שמות חלבון / מידע על קבוצה ודורשים גם פפטידים האחות.}

כדי לחקור האם יחסי חלבון היו שונים משמעותי אחד כלפי שני בשברי CEF-supercomplex המעורבים מWT וpgrl1, ניתוח סטטיסטי בוצע יישום SPSS התוכנה (גרסת 21). יחידות משנה של מתחם ₆ / f ציטוכרום b נבדקו אחד נגד שני, כמו גם החלבונים FNR, FTSH2 וHCF136 נגד תת יחידות PSI. יחסי פפטיד של כל ספירת סריקה לכל חלבון מכל ארבעת משכפל נבדקו התפלגות נורמלית עם מבחן שהפיר-ילקס. מאז אוכלוסיות פפטיד לא מתפלגות נורמלי (p <0.001), סטטיסטיקה פרמטרית בוצעה. ראשית, מבחן קרוסקל-ארהב יושם הערכת הבדלים משמעותיים בין קבוצות. רק אם בדיקה זו ניבאה הבדל משמעותיים בין קבוצות, ניתוח נוסף בוצע על מנת לחזות הבדלים משמעותיים בין שתי קבוצות בלתי תלויות עם מבחן מאן ויטני-U.

תוצאות

גישת פרוטאומיקה כמותיים הציגה מטרה לאפיין את ההרכב של מתחמי multiprotein בקרומי thylakoid הודגמו על ידי הניתוח ההשוואתי של רכיבי CEF-supercomplex בג שונה מבחינה גנטית reinhardtii זנים. השיטה המתוארת בהצלחה יושמה על ידי Terashima et al. ⁶ וכוללת את הבידוד של קרומי thylakoid מתרב?...

Discussion

מחקרי proteomic כמותיים שונים באמצעות תיוג איזוטופ יציב כבר פורסמו בשנים האחרונות. בניסויים אלה בדרך כלל שני מדגמים שונים בהשוואה, מתוכם מדגם אחד מתויג עם איזוטופ יציב. לאחר מכן חלבונים או פפטידים משני המדגמים משולבים ביחס שווה ומעובד יחד נוסף ^48. מחקרים כאלה לעתים ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Acetic acid	AppliChem	A0662	http://www.applichem.com/home/
Acetone	AppliChem	A2300	http://www.applichem.com/home/
Acetonitrile Optigrade für LC-MS	Diagonal	9340	Harmful, work with gloves. See protocol text for further precautions. https://www.diagonal.de/
Ammonium chloride 15N	Cambridge Isotope Laboratories	39466-62-1	http://www.isotope.com/cil/index.cfm
Ammonium chloride 14N	AppliChem	A0988	http://www.applichem.com/home/
Ammonium hydrogen phosphate	AppliChem	A3583	http://www.applichem.com/home/
Ammonium sulfate	AppliChem	A3598	http://www.applichem.com/home/
Coomassie brilliant blue R-250	Fisher Scientific	10041653	http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex
n-Dodecyl-β-D-maltoside	AppliChem	A0819	http://www.applichem.com/home/
EDTA	AppliChem	A2937	http://www.applichem.com/home/
Formic acid	AppliChem	A3858	http://www.applichem.com/home/
HEPES	AppliChem	A3724	http://www.applichem.com/home/
Magnesium chloride	AppliChem	A4425	http://www.applichem.com/home/
Methanol	AppliChem	A2954	http://www.applichem.com/home/
Phosphorous acid	AppliChem	A0989	http://www.applichem.com/home/
Dipotassium hydrogen phosphate	AppliChem	A1042	http://www.applichem.com/home/
Potassium dihydrogen phosphate	AppliChem	A1043	http://www.applichem.com/home/
Sodium hydroxide	AppliChem	A1551	http://www.applichem.com/home/
Sucrose	AppliChem	A1125	http://www.applichem.com/home/
Tricine	AppliChem	A3954	http://www.applichem.com/home/
Tris	AppliChem	A2264	http://www.applichem.com/home/
Trypsin (sequencing grade modified) and Trypsin buffer	Promega	V5111	http://www.promega.de/
Equipment
Nebulizer (BioNeb cell disruptor)	Glas-Col		http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75
Centrifuge tubes (14 mm x 89 mm)	Beckman Coulter	331372	for preparation of Takahashi style gradients http://www.beckmancoulter.de/
Centrifuge tubes 25 mm x 89 mm	Beckman Coulter	344058	for preparation of thylakoid isolation gradients. http://www.beckmancoulter.de/
Coulter Avanti Centrifuge J-20 XP	Beckman Coulter		http://www.beckmancoulter.de/
Fuchs-Rosenthal cell couting chamber	Diagonal	449/72	https://www.diagonal.de/
Homogenizer (Potter) 50 ml	Fisherbrand	10618242	http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand
Pistil for homogenizer	Fisherbrand	105252220	http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand
Ultracentrifuge (Optima XPN-80 Ultracentrifuge)	Beckman Coulter		website: http://www.beckmancoulter.de/
Other
Antibodies	Agrisera		http://www.agrisera.com/en/index.html