多蛋白复合物的比较分析新方法基于<sup&gt; 15</sup&gt;Ñ代谢标记和定量质谱

摘要

所描述的比较，定量蛋白质组学方法的目的是获得见解多蛋白复合物的组成不同的条件下，并证明通过比较基因不同的菌株。为定量分析从蔗糖密度梯度不同的馏分等体积完全由质谱混合并进行分析。

摘要

所引入的协议提供了在类囊体膜多蛋白复合物的分析工具，通过在不同条件下揭示见解复杂的组合物。在这个协议中的方法被证明通过比较蛋白复合物负责在莱茵衣藻的循环电子流（CEF），分离自遗传上不同的菌株的组合物。该方法包括类囊体膜的分离，随后通过基于差分代谢标记^（14 N / ¹⁵ N）分离成多蛋白复合物通过蔗糖密度梯度离心法，SDS-PAGE，免疫检测和比较，定量质谱（MS）分析菌株。洗涤剂溶解的类囊体膜对蔗糖密度梯度装在平等的叶绿素浓度。超速离心后，将梯度分离成各种馏分，这是由大量spectromet分析RY基于等量。这种方法允许梯度组分中的成分进行调查，此外，分析不同蛋白质的迁移行为，尤其是专注于ANR1，CAS和PGRL1。此外，这种方法被证明了通过从以往的研究支持的结果（即先前描述的是CEF-超复合如PGRL1，FNR的一部分的蛋白质的识别和PSI-依赖的迁移，并在确认的结果与免疫印迹和另外细胞色素F）。值得注意的是，这种方法适用于解决范围广泛的有本协议可以通过， 例如用于多蛋白复合物成分从不同的环境条件下分离出的比较分析问题。

引言

在植物和藻类类囊体膜的光合过程可以以线性和环状的方式发挥作用。在线性电子流（LEF）光系统I（PSI），光系统II（PSII）和细胞色素b ₆ / f电子转移，最终从水到NADP + ^1，导致NADPH和ATP ²的产生。与此相反，循环电子传递（CEF），这被称为像状态2 ³和厌氧条件^4，结果在由注入电子返回到电子传递链的再还原氧化的PSI不同的环境条件下被诱导。这个过程可以发生在任何的色素b ₆ / f复合体¹的基质侧或在质体醌库⁵并产生ATP，但没有NADPH ^2。

所提出的协议的目的是展示一个质谱（MS）基于米法认列在莱茵衣藻的类囊体膜多蛋白复合物来获得不同的条件（通过比较基因不同的菌株例举）下洞察这些配合物的组合物的比较，定量分析。这种方法在出版物由寺岛等被使用。在2012年呈现持续进修基金C中的^钙离子依赖的调节衣藻由多蛋白复合物包括蛋白CAS号，ANR1和PGRL1 ⁶介导的。该过程将通过比较分析CEF-超复合两种基因不同菌株的组成，从而采取贴标两个菌株与重氮^（15 N）的一个优势来解释。简要地，该协议包括类囊体膜的制备，随后的洗涤剂溶解，并在蔗糖密度梯度光合配合物分馏。梯度分离后，选定压裂两株蒸发散是基于等体积混合，通过SDS-PAGE随后在凝胶内消化和随后的定量质谱分析分离。

如上所述，CEF是不同的环境条件下诱导，并从2010年出版演示了CEF功能，超复合的隔离状态下的2锁定单元格衣藻 ^7，这是由于超速离心过程中蔗糖密度梯度分离溶解的类囊体膜进行。从岩井等 ^7种不同的，所提出的协议说明了CEF-超复合的厌氧生长C.隔离莱茵衣藻培养物下面的替代程序。这包括在类囊体隔离协议的变化，以及关于在溶解步骤的差异和蛋白质复合物通过超速离心分离。在本协议中，类囊体膜通过施加由蔡氏和Bennoun ⁸公布的程序，而用于类囊体膜制剂通过岩井等的缓冲液中分离人含有25mM的MES，0.33M的蔗糖，5毫摩尔MgCl _2，1.5 mM氯化钠（pH6.5）中所描述的^9。用0.7-0.8％的洗涤剂（N-十三烷基-β-D-麦芽糖苷）进行增溶，在冰上在岩井和同事的情况下30分钟，而这里所描述的增溶方法依赖于使用0.9％的去污剂（正十二烷基-β-D-麦芽糖苷（β-DM））和仅20分钟在冰上进行。两组用每毫升0.8毫克叶绿素为与各自的洗涤剂的溶解。对于光合作用复合体从溶解的类囊体膜的分离岩井等人采用蔗糖浓度0.1-1.3 M之间，而该协议的作者使用浓度为0.4-1.3米的最后一个区别是离心速度，相比是较低的在EArlier出版。

类囊体膜与非离子洗涤剂然后再进行蔗糖密度梯度分级分离的增溶作用已经在大量的研究，从20世纪80年代，直至今日^7，9-14和还蛋白的代谢标记的应用是在蛋白质组学领域中的广泛的方法中得到应用。所描述的方法通过将其在重氮如在^{15 N}的NH _{4 Cl等} ，其掺入到所有氨基酸导致大规模的形式唯一氮源的存在下培养适用于比较两种菌株之一的^{15 N}代谢标记移取决于肽的氨基酸序列。当分析的内一个MS运行¹⁴ N和¹⁵ N的混合物，该质量转移可以被用来确定样品原点为每种肽的丰度和可以计算表示为对应的相对丰度相肽ING蛋白质^15。

C.上众多的定量蛋白质组学研究莱茵衣藻是可用的，这比较确定蛋白质的量来分析实验条件（ 例如 ，由于营养^16-19或光胁迫^20,21改变蛋白质组）之间变化，蛋白质组。相比，这些研究中，在目前提出的方法的样品的等体积相结合，并进行分析。这种设置允许以研究蛋白质的迁移行为的梯度内，此外，分析不同的复合物相对于所研究的菌株的组合物。

此方法将被解释主要集中在三种蛋白质：第一候选是叶绿体本地化钙传感器蛋白CAS，这被证明是涉及光驯化C中藻 ^22。钙被认为是一个重要的信号ING离子为激活由于不同的生物和非生物胁迫最终导致基因表达的变化和细胞生理学和²³有人提出，叶绿体可能有助于细胞内Ca ^{2 +}通过CAS蛋白^22,24,25的信号通路。第二蛋白是ANR1（厌氧反应1 ^6），其被证明是缺氧的生长条件下在C诱导的蛋白藻 ^26。值得注意的是，中科院以及ANR1被认定为CEF-超复合，而且，通过使用反向遗传学的方法，它表明，这两种蛋白质有助于在功能上的CEF 在体内 ^6，支持他们为这种蛋白质复合体的功能性亚基作用亚基。第三蛋白是类囊体蛋白PGR5样1（PGRL1），将其显示参与在CEF中衣藻 ^4,27以及在拟南芥 ^5,28和也标识entified在岩井等人的工作^。7

野生型（WT）相对于（对比）一个^ΔPSI29株表现出缺失的PSAB基因，编码为一个重要的光系统I亚单位，这也是该组成部分：该方法将通过示出的两个不同的实验的结果呈现CEF-超复合和WT与一个pgrl1敲除株^4。为每个实验的CEF-超复合的¹⁵ N和¹⁴ N-标记的菌株进行了比较之间的定量组成。

研究方案

1。 衣藻的培养

1. 以下三莱茵衣藻株在本研究中使用：WT cc124，WT CW15-arg7（细胞壁缺陷和精氨酸营养缺陷型），一个ΔPSI突变体菌株²⁹和一个pgrl1敲除菌株^4。
2. 所有菌株均生长在Tris-乙酸盐-磷酸盐（TAP）的介质^30，在25℃用20-50的连续光强度μE/米²秒，振摇在120rpm。 ΔPSI的文化应该被包裹着一些纸巾<5μE/米²秒的曝光。
3. 标记株（ΔPSI和WT cc124，分别）的培养物含有7.5 mM的¹⁵ N的NH _{4 Cl等} ，而文化对于未标记株（WT CW15-arg7和pgrl1，分别）含有7.5 mM的^{14 N}的NH _{4 Cl等} 。细胞具有生长为至少4 GENERAT离子全部实现标签和必须保持在指数生长期。
4. 于实验开始计数并稀释细胞至1×10 ⁶个细胞/在至少为750毫升/应变的体积ml的密度的前一天。

请注意，两种类型的不连续蔗糖密度梯度在以下方案中描述。根据Takahashi 等人 ⁹的光系统蔗糖密度梯度用来在过夜离心分离不同的光合蛋白质复合物从分离和溶解的类囊体，并且必须在一天前制备（参见方案2）和类囊体蔗糖密度梯度^8顷应用的类囊体分离过程中（见协议3）。

2。光系统蔗糖密度梯度准备

1. 浇注梯度需要三种股票的解决方案：
   1. 2M的蔗糖
   2. 10％的β-DM，在H _{2 O}的
   3. 0.5M的甲基甘氨酸，pH 8.0的氢氧化钠（NaOH）
2. 使用这些个股，准备了以下解决方案：

   浓度：	130万	1.0M的	0.85米	0.7M的	65万	0.4M的
   2M的蔗糖	13毫升	10毫升	8.5毫升	7毫升	6.5毫升	4毫升
   10％46;-DM	100微升	100微升	100微升	100微升	100微升	100微升
   0.5M的甲基甘氨酸	200微升	200微升	200微升	200微升	200微升	200微升
   H 2 O的	6.7毫升	9.7毫升	11.2毫升	12.7毫升	13.2毫升	15.7毫升

3. 使用14毫米x 89毫米离心管中，并倒入梯度非常缓慢，开始以较低的密度最高的解决方案蔗糖密度解决方案。
4. 倾每个只有1毫升的1.3和1.0M溶液和2ml的溶液的其余部分。
5. 离开梯度隔夜在寒冷的房间。

3。厌氧诱导和类囊体膜⁸的隔离

1. 开始的类囊体膜的分离之前，通过用4小时氩气鼓泡引起的厌氧条件。发泡可以通过玻璃吸管与培养的恒定混合有磁力搅拌棒的培养烧瓶中进行。
2. 通过在2,500 xg离心制粒细胞5分钟，从类囊体膜的分离，重悬在H 1缓冲液（0.3M的蔗糖，25mM的HEPES（pH值7.5），5mM的MgCl ₂的）。
   （请注意，与类囊体膜样品SH隔离时开始乌尔德保持在冰上，以避免蛋白质降解，所有离心步骤都在4℃和手套工作，强烈建议避免角蛋白污染。）
3. 颗粒细胞5分钟，2,500 xg离心，重悬在H1的缓冲区。
4. 通过与1500百帕氮气压力喷雾器打破细胞有两个通道（无细胞壁的菌株做只有一个通道）。
5. 降速细胞7分钟，2,500×g的。
   （在此步骤之后将上清液应该浅绿，如果不是，则电池单电池破损没有成功。）
6. 悬浮细胞在H2缓冲液（0.3M的蔗糖，5毫米的HEPES（pH值7.5），10 mM的EDTA（pH值8.0））和颗粒细胞在32,800×g的10分钟。
7. 悬浮细胞在H3的缓冲液（1.8米蔗糖，5毫米的HEPES（pH值7.5），10 mM的EDTA（pH值8.0））和均质颗粒与陶工（没有绿色的颗粒应保持在这一工作步骤结束）。
8. 在浴缸类囊体准备蔗糖密度梯度ES（25毫米x 89毫米）由从底部开始有一层12毫升H3缓冲液与细胞，倒入12毫升H4缓冲的中间层（1.3M蔗糖，5mM的HEPES（pH 7.5）中，10毫摩尔EDTA（ pH 8.0）中），和在顶部12毫升H5缓冲液（0.5M蔗糖，5mM的HEPES（pH 7.5）中，10毫摩尔EDTA（pH8.0）中）。浇注梯度时要小心，避免了三层的混合。
9. 平衡了H5缓冲和离心类囊体蔗糖密度梯度为1小时，在70,700×g的。
10. 从类囊体蔗糖密度梯度除去囊体条带，并与适当量H6缓冲液（5mM HEPES（pH 7.5）中的10mM EDTA（pH 8.0）中）稀释它们。
11. 降速细胞在37,900×g离心20分钟。如果颗粒不紧，更H6缓冲是需要这种离心步骤。
12. 类囊体悬浮在小体积H6缓冲区，并进行测定叶绿素浓度。

4。叶绿素浓度³¹的测定

1. 叶绿素量的确定是用80％的丙酮进行​​。
2. 混合995微升80％的丙酮和5μl，以H6缓冲液囊体（1:200稀释）。
3. 涡流几秒钟，直到没有绿色颗粒保持，然后停止旋转，在14.1×g离心5分钟。
4. 取上清液，测定灭绝在663.6和646.6 nm和750 nm处，分别。
5. 使用下列公式计算叶绿素金额：
   1. Ç _叶绿素a [毫克/毫升] =（0.01225 * E _663.6 - 0.00255 * E _646,6）*稀释倍数
   2. Ç _叶绿素b [毫克/毫升] =（0.02031 * E _646.6 - 0.00491 * E _663.6）*稀释倍数
   3. Ç _叶绿素 [毫克/毫升] = C _叶绿素a + C _叶绿素b

5。光系统蔗糖密度梯度加载中

1. 计算类囊体，β-DM和H6缓冲区需要的金额每个梯度：
   1. 每个梯度应装有700微升总体积为0.8毫克/毫升的叶绿素在0.9％的β-DM（溶解β-DM中H ₂ O），填充H6缓冲液的剩余量。
2. 对于增溶准备不同的等份与类囊体，β-DM和H6缓冲区每个梯度。
3. 离开样本20分钟，冰与定期混合（反相）每隔几分钟（溶解步骤）。
4. 以最大速度离心（14,000×g离心）为10分钟，在4°C。
   （离心后，将沉淀物应该是小而发白，而上清液为暗绿色。）
5. 加载上清对梯度。
6. 用H6缓冲液并在4℃下旋转利用超速离心机在134,470×g离心过夜（14小时）平衡
   （请注意，使用如本协议提出了光系统蔗糖密度梯度光合复合物的分离成功是全光照时才能实现克新鲜分离的类囊体，由于预测为增溶和复杂的分离是困难的与已经之前冻结类囊体膜中工作时作出。）

6。光系统蔗糖密度梯度分离

1. 采取梯度的照片。
2. 使用针和分馏梯度中加入500μl管穿刺孔在管的底部。或者，所述分馏也可以通过使用96孔板（微孔板）上进行。
3. 当使用微板，确定不同的梯度级分的吸光度在675纳米。
   （在这一步骤中的样品可以贮存于-80℃下几个星期。）

7。 SDS-PAGE和免疫检测

（请注意，只有对WT的对比ΔPSI比较的免疫印迹分析已选择分数为后续质谱分析。对于实验WT与pgrl1 FR行动者是由在不同部位的吸光度的方法。）

1. 独立的30微升的WT和ΔPSI在13％SDS-聚丙烯酰胺凝胶³²梯度每个分数的。
2. ^{ANR1（TEF7）26，PGRL1 34，CAS}号^6，PSI的亚基PSAD ³²和PSII核心亚基D1：使用下列抗体进行免疫印迹分析^33。使用的所有抗体用稀释1:1,000（增强化学发光检测法），除了D1抗体，其中应用稀释为1:10,000被使用。
3. 基于免疫检测的结果，采取ANR1，PGRL1及PSAD的峰组分WT和ΔPSI（这里馏分6和13，分别），混合30微升部分6从WT和ΔPSI，并与部分13从做同样的无论筹备工作，并再次将它们分开在13％SDS聚丙烯酰胺凝胶。
4. 对于WT与pgrl1的定量比较采取了C通过测量在不同的梯度级分的吸光度测定，混合30μl的两个样品随后在13％的SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离的EF-超复合馏分。
5. 染色的蛋白条带在4℃的考马斯溶液（85％亚磷酸，757 mM的硫酸铵，1.2％的考马斯亮兰，20％甲醇）处理2小时，在室温或过晚
6. 要删除非特异性染色，洗几次与双蒸₂ O。
7. 切车道成1mm的凝胶块，并继续进行胶内消化。
   （可替换地，样本可以干燥几分钟，在真空离心机和贮存几周的凝胶内消化，然后再继续）。

8。胶内消化（从舍甫琴科等人 ³⁵修正）

请注意，准备在即将使用前的所有缓冲区和解决方案，并采取玻璃瓶含有乙腈（ACN）的缓冲区。
注意！用ACN工作可能是有害的，更多的信息可以从以下网站下载：http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927335（2013年）。

1. > 10卷双蒸_{2 O（〜200}微升）的30秒洗凝胶块。
2. 孵育凝胶块用300微升25毫米的NH ₄ HCO ₃为15分钟，振摇，除去液体。
3. 孵育凝胶片用300微升的25mM NH ₄ HCO ₃在50％ACN 15分钟，在摇动（通过混合乙腈和50mM NH ₄ HCO ₃以1:1的比例制备），除去液体。
4. 如果凝胶块还是蓝色的，重复的NH ₄ HCO ₃和NH ₄ HCO ₃ /乙腈洗，直到大部分的考马斯亮被删除。
   （虽然大部分考马斯染色的应被删除，这是没有必要完全脱色的凝胶块。）
5. 加入100μl乙腈脱水的凝胶片5分钟。凝胶块应该收缩ND看起来完全白色。
6. 删除尽可能多的ACN，尽量进行胰蛋白酶消化。或者，样品可以贮存于-20℃下几个星期。
7. 添加每个波段10-20微升20纳克/微升胰蛋白酶在10％乙腈/ 25 mM的NH ₄ HCO _3（新鲜摊薄），继续冰样本。
8. 30分钟后，检查是否所有溶液吸收，并在必要时添加更多的胰蛋白酶缓冲。凝胶块应完全覆盖胰蛋白酶缓冲。继续冰样本。
9. 离开凝胶块在冰上另外90分钟，以用胰蛋白酶饱和它们。
   （关键步骤：胰蛋白酶肽的产率与在冰上增加孵育时间大大增加了酶进入聚丙烯酰胺基质慢速扩散的可能，因为它需要有一个稍微过量的溶液覆盖所述凝胶片，以避免碎片。隔夜孵化期间跌倒干。）
10. 消化在37℃4-6小时。对于需要实验最大的肽恢复，消化过夜。
11. 消化后降速简明缓冲区。
12. 超声处理管5分钟，再洗脱肽和离心机。
13. 收集上清液，并将其转移至新管。
14. 在超声波水浴中15分钟80微升的30％乙腈/ 1％甲酸（FA）进行肽的提取。
15. 与80μL30％乙腈/ 1％FA在超声波水浴中15分钟进行提取。
16. 与80μL70％乙腈/ 1％FA在超声波水浴中15分钟进行提取。
17. 再次和池上清液离心与以往洗脱液。
    （FA用于灭活胰蛋白酶和肽增加溶解度。）
18. 完全在真空离心机干燥的肽溶液。
    （此时样品可存放数周在-20℃下继续进行质谱分析之前。）
19. 重悬肽6微升的MS缓冲液（5％乙腈，0.1 V / V FA，水）和超声为2-5分钟。
20. 离心样品在maximu米速度5分钟，以去除颗粒物质。
21. 使用4μL上清进行质谱分析。

9。与“Proteomatic”MS-数据分析

与开源软件“Proteomatic”（可在http://www.proteomatic.org/下载），一个平台，允许发电和MS / MS数据评估管道完成后，通过进行数据分析免费和商业软件^36。简单地说，设置如下所述，更详细的信息，可以在^6,26找到。

1. 的质谱数据鉴定和量化
   从实验WT与ΔPSI识别和蛋白质的定量进行了与OMSSA（版本2.1.4 ^37）和qTrace ^26，分别描述^6,26。从实验中野生型与pgrl1以下更新管线的MS数据分析方法：
   1. 除了​​OMSSA ^37，蛋白质也被确定了X！串联（版本2013年2月1日^38）。两种算法通过检索对由衣 JGI的基因模型数据库4.3版结合奥古斯数据库版本10.2，以及对NCBI的加入数据库生成的数据库应用数据库BK000554.2和NC_001638.1。
   2. 通过使用一个目标诱饵的方法³⁹进行质谱鉴定²肽。一个诱饵每个蛋白通过随机洗牌的胰蛋白酶肽，同时保留nonproteotypic肽的冗余创建的。
   3. 使用小于0.01和结果进行过滤，用5 ppm的前体质量耐受后验误差概率（PEP）的阈值与该软件qvality（0.3.3 ⁴⁰版）进行肽的统计验证。
   4. 肽从OMSSA和X！串联运行被加入并与qTrace量化 ^{26采用以下过滤器的步骤：要求MS 2鉴定，补充蛋白质名/组信息，需要两个妹妹肽。}

为了研究蛋白质之比是否朝向彼此显著不同在来自WT和pgrl1混合CEF-超复合馏分，进行统计学分析应用软件SPSS（版本21）。该色素b ₆ / f复合体的亚基测试对彼此以及蛋白质FNR，FTSH2和HCF136对PSI亚基。每蛋白质每扫描计数四个重复的肽比例进行了测试正态分布与夏皮罗 - 威尔克斯测试。由于肽种群不是正态分布（P <0.001），非参数统计被执行。首先，Kruskal-Wallis检验施加评估组间显著发散。只有当这个测试预测显著差异团体s之间，进行进一步的分析，预测两个独立的组间显著差异与采用Mann-Whitney-U检验。

结果

所引入的定量蛋白质组学方法的目的是多蛋白复合物的组成表征由基因不同C. CEF-超复合成分的比较分析表明类囊体膜衣藻株。所描述的方法已经被成功地由寺岛等人 ⁶施加，并且包括从厌氧生长的培养物类囊体膜，随后洗涤剂增溶的隔离。随后，样品装载到蔗糖密度梯度的基础上平等的叶绿素量和复合物通过超速离心分级。用于定量质谱分析从不同菌株2梯度组分等体?...

讨论

利用稳定同位素标记不同的蛋白质组定量研究已经发表在最近几年。在这些实验中通常有两种不同的样品进行比较，其中一个样品都标有一个稳定的同位素。其后，两个样品的蛋白质或肽组合在相等的比率，并进一步处理一起^48。这种研究常常想比较定义孤立的细胞区室（ 例如叶绿体，线粒体，或类囊体膜）暴露于不同应激条件^26,34,49调查向上或向下调节特定蛋白质。所描?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Acetic acid	AppliChem	A0662	http://www.applichem.com/home/
Acetone	AppliChem	A2300	http://www.applichem.com/home/
Acetonitrile Optigrade für LC-MS	Diagonal	9340	Harmful, work with gloves. See protocol text for further precautions. https://www.diagonal.de/
Ammonium chloride 15N	Cambridge Isotope Laboratories	39466-62-1	http://www.isotope.com/cil/index.cfm
Ammonium chloride 14N	AppliChem	A0988	http://www.applichem.com/home/
Ammonium hydrogen phosphate	AppliChem	A3583	http://www.applichem.com/home/
Ammonium sulfate	AppliChem	A3598	http://www.applichem.com/home/
Coomassie brilliant blue R-250	Fisher Scientific	10041653	http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex
n-Dodecyl-β-D-maltoside	AppliChem	A0819	http://www.applichem.com/home/
EDTA	AppliChem	A2937	http://www.applichem.com/home/
Formic acid	AppliChem	A3858	http://www.applichem.com/home/
HEPES	AppliChem	A3724	http://www.applichem.com/home/
Magnesium chloride	AppliChem	A4425	http://www.applichem.com/home/
Methanol	AppliChem	A2954	http://www.applichem.com/home/
Phosphorous acid	AppliChem	A0989	http://www.applichem.com/home/
Dipotassium hydrogen phosphate	AppliChem	A1042	http://www.applichem.com/home/
Potassium dihydrogen phosphate	AppliChem	A1043	http://www.applichem.com/home/
Sodium hydroxide	AppliChem	A1551	http://www.applichem.com/home/
Sucrose	AppliChem	A1125	http://www.applichem.com/home/
Tricine	AppliChem	A3954	http://www.applichem.com/home/
Tris	AppliChem	A2264	http://www.applichem.com/home/
Trypsin (sequencing grade modified) and Trypsin buffer	Promega	V5111	http://www.promega.de/
Equipment
Nebulizer (BioNeb cell disruptor)	Glas-Col		http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75
Centrifuge tubes (14 mm x 89 mm)	Beckman Coulter	331372	for preparation of Takahashi style gradients http://www.beckmancoulter.de/
Centrifuge tubes 25 mm x 89 mm	Beckman Coulter	344058	for preparation of thylakoid isolation gradients. http://www.beckmancoulter.de/
Coulter Avanti Centrifuge J-20 XP	Beckman Coulter		http://www.beckmancoulter.de/
Fuchs-Rosenthal cell couting chamber	Diagonal	449/72	https://www.diagonal.de/
Homogenizer (Potter) 50 ml	Fisherbrand	10618242	http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand
Pistil for homogenizer	Fisherbrand	105252220	http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand
Ultracentrifuge (Optima XPN-80 Ultracentrifuge)	Beckman Coulter		website: http://www.beckmancoulter.de/
Other
Antibodies	Agrisera		http://www.agrisera.com/en/index.html