عزل وتوصيف وظيفي من الإنسان البطيني العضلية من العينات الجراحية الطازجة

Summary

المعرفة الحالية على أساس الخلوية من أمراض القلب تعتمد في الغالب على دراسات على نماذج حيوانية. نحن هنا وصف والتحقق من صحة طريقة جديدة للحصول العضلية قابلة للحياة واحد من عينات جراحية صغيرة من عضلة القلب البطيني الإنسان. myocytes البطين الإنسان يمكن أن تستخدم للدراسات الكهربية واختبار المخدرات.

Abstract

تخضع العضلية من قلوب المريضة إلى العمليات المعقدة التي تنطوي على إعادة عرض التغيرات في بنية الخلية، الإثارة انكماش اقتران والتيارات أيون الغشاء. ومن المرجح أن تكون مسؤولة عن زيادة خطر محدث اضطراب النظم والتعديلات التي تؤدي إلى ضعف مقلص الانقباضي والانبساطي في مرضى القلب تلك التغييرات. ومع ذلك، فقد تأتي معظم المعلومات على التعديلات وظيفة خلية عضلية في أمراض القلب من النماذج الحيوانية.

نحن هنا وصف والتحقق من صحة بروتوكول لعزل myocytes قابلة للحياة من عينات جراحية صغيرة من عضلة القلب البطيني من المرضى الذين يخضعون لعمليات جراحية في القلب. يوصف البروتوكول بالتفصيل. وذكرت القياسات الكهربية والكالسيوم داخل الخلايا لإثبات جدوى لعدد من القياسات وحيدة الخلية العضلية في البطين الإنسان التي تم الحصول عليها مع هذا الأسلوب.

ذكرت وبروتوكول انهيمكن أن يكون مفيدا لإعادة التحقيقات مستقبل أساس الخلوية والجزيئية من تعديلات وظيفية من قلب الإنسان في وجود أمراض القلب المختلفة. علاوة على ذلك، يمكن استخدام هذا الأسلوب لتحديد أهداف علاجية جديدة على المستوى الخلوي واختبار فعالية مركبات جديدة على العضلية البشرية، مع قيمة متعدية المباشرة.

Introduction

تشريح الخصائص الكهربية لعضلة القلب قد تقدم بشكل ملحوظ بعد تطوير تقنيات لعزل واحد خلية عضلية قلبية. كما بذلت التطورات الأخيرة في فهم القلب الإثارة تقلص اقتران (EC-اقتران) بفضل القدرة على عزل العضلية واحد قابلة للحياة التي تحتفظ كافة الخصائص الفسيولوجية للأنسجة سليمة. ويعمل أساليب التصحيح المشبك بشكل روتيني لدراسة وظيفة وتعديل الدوائية للsarcolemmal القلب التيارات أيون. كما أجريت تسجيلات لديناميات الكالسيوم داخل الخلايا مع كا ^{2 +} الأصباغ الحساسة بانتظام على myocytes القلب واحد من مجموعة متنوعة من النماذج السليمة والمريضة، وتوفير البيانات الحيوية على فسيولوجيا EC-اقتران وكذلك على التغيرات المرضية من داخل الخلايا كا ^{2 +} مما يؤدي إلى اختلال التوازن الميكانيكية وزيادة العبء محدث اضطراب النظم في أمراض القلب. انفورمانشوئها من هذه الدراسات هو أمر حاسم لفهم الآثار الكهربية والميكانيكية المخدرات في الإعداد السريرية. ومع ذلك، هناك اختلافات محددة في الأنواع التيارات وعبر الغشاء في البروتينات EC-اقتران التي تمثل سمات محددة من إمكانات العمل القلب والميكانيكا القلب. وهكذا، في حين أوضحت دراسات myocytes المعزولة من الثدييات غير البشرية الخصائص الفيزيائية الحيوية والفسيولوجية للأدوار القنوات الأيونية عبر الغشاء محددة والبروتينات EC-اقتران، فإنها لا توفر بالضرورة النماذج ذات الصلة من myocytes القلب البشري. وبالتالي عزلة myocytes قابلة للحياة من عضلة القلب البشري هو ضروري لفهم كامل للالفيزيولوجيا المرضية لأمراض القلب والتحقق من صحة النهج العلاجية الرواية.

النسيج الأذيني الإنسان متاحة بسهولة في كثير من الأحيان يتم تجاهل الزوائد الأذيني أثناء العمليات الجراحية. الدراسات الكمية الأولي من إمكانات العمل القلب البشري الكبار ومكعب الأيونيةrrents العاملين الخلايا الأذيني معزولة إنزيمي ^1-4. وقد تم الإبلاغ عن تسجيلات لإمكانات العمل أو تيارات من خلايا الإنسان البالغ البطين المعزولة في وقت لاحق ^3،5-10. وقد استخدمت معظم هذه الدراسات تم الحصول عليها من خلايا قلوب explanted والاستفادة منها إما كولاجيناز نضح من شريحة الشريان التاجي أو التعرض كميات كبيرة نسبيا من الأنسجة رفعه إلى كولاجيناز للحصول على خلايا معزولة. سمحت هذه الدراسات على توصيف مفصل لعدد من التيارات عبر الغشاء أيون من العضلية البطين الإنسان من قلوب سليمة ومن المرضى الذين يعانون من قصور في القلب الطرفية. تسجيلات من نوع L-كا ^{2 +} الحالية (I _CA-L) ^5-7، عابر الحالية البوتاسيوم الخارج (أنا _ل) ^8، الداخل المعدل الحالي البوتاسيوم (I _κ1) ^8، ومكونات مختلفة من تأخر المعدل الحالي البوتاسيوم (I _κ ) تم الإبلاغ عن ^9. السلف وتكريرالإجراء العزلة ^10، يسمح للتوصيف واضح للأساس الأيونية للزيادة المحتملة محدث اضطراب النظم في فشل القلب المحطة، التي تضم ¹¹ إطالة عمل محتمل، وتأخر بعد depolarizations ¹² وزيادة مضحك الحالي ¹³ مما يؤدي إلى إزالة الاستقطاب الانبساطي ويدق سابقا لأوانه.

يتم عزل myocytes القلب الكبار عادة من الحيوانات الصغيرة عن طريق نضح الوراء من القلب كله مع خليط من مختلف انزيم، وهي تقنية التي تنتج غلة عالية من الكالسيوم ^{2 +} الخلايا التي تتحمل ^14. عزلة myocytes القلب من شظايا الأنسجة هي بطبيعتها أقل نجاحا ربما بسبب وصول محدود من الانزيمات لmyocytes الفردية مقارنة مع تلك التي نضح من الشرايين التاجية التي تحققت. بسبب توافر محدود جدا من قلوب المانحة غير المستخدمة، والطريقة العملية الوحيدة للحصول على خلايا البطين الإنسان العادي على أساس منتظم هي digestio الأنزيميةن من شظايا الأنسجة في كثير من الأحيان صغيرة جدا رفعه أثناء العمليات الجراحية الاختيارية. نموذج المرض البشري الوحيد الذي اتسم بدقة على مستوى الخلية هو قصور القلب المحطة، نظرا لإمكانية الوصول إلى قلوب المزروعة. ومع ذلك، يحدث فشل القلب محطة في أقلية من المرضى وينطوي على الطريق الشائع للإعادة حاد في خلايا عضلة القلب، وهي مستقلة نسبيا من السبب الكامن وراء ¹⁵ في كثير من الأحيان. القدرة على تقييم وظيفة العضلية واحد من المرضى في مرحلة مبكرة غير الفشل من المرض أمر حاسم لفهم الفيزيولوجيا المرضية محددة من الظروف الموروثة أو المكتسبة مختلفة. اعتلال عضلة القلب الضخامي (HCM) هو مثال القصص. HCM هو مشترك (1/500 فرد) حالة القلب القابلة للتوريث تتميز تضخم القلب، وزيادة خطر ومقلص التعديلات محدث اضطراب النظم بسبب انسداد المسالك وتدفق الخلل الانبساطي ^16. العضلية من قلوب HCM يوndergo على عمليات إعادة معقدة تنطوي على تغييرات في هيكل الخلية (تضخم، حالة من الفوضى myofibrillar) واقتران ^EC-17. ومع ذلك، فقد تأتي معظم المعلومات من ضعف خلية عضلية في HCM من النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا. منذ أقلية فقط من المرضى HCM تتطور نحو فشل القلب محطة ويتطلب زرع القلب، هي جدا نادرا ما تتوفر لعزل الخلايا مع الأساليب القياسية قلوب HCM. ومع ذلك، لا يقل عن 30٪ من المرضى الذين تظهر عليهم أعراض الانسداد HCM بسبب تدفق هائل الحاجز تضخم المحورة لتدفق الدم أثناء انقباض المسالك (HCM) ^18. الخيار العلاجية المتاحة الأكثر فعالية للتخفيف من انسداد في HCM هو الحاجز الجراحية استئصال العضلة: خلال هذه العملية الجراحية، تتم إزالة جزء متغير الحجم من الحاجز العلوي نهج الأبهر غير المشبعة. هذا الجزء من الحاجز متضخما وبالتالي تتوفر لعزل الخلايا من أنسجة جديدة.

وهناك طريقة لعزل ventricula الإنسانص myocytes من واحد، عبر الوريد عينات خزعة شغاف وعضلة القلب صغيرة وقد وضعت سابقا ونشرت ^19. نفذنا طريقة لعزل myocytes الحاجز واحد من عينات عضلة القلب البطيني من المرضى الذين يخضعون لجراحة القلب، بما في ذلك المرضى الذين يعانون من HCM تمر استئصال العضلة الحاجز والمرضى الذين يخضعون لإجراءات استبدال صمام. بالإضافة إلى وصف مفصل للبروتوكول العزلة، ممثل الكهربية والكالسيوم ^{2 +} مضان يتم عرض القياسات، مما يدل على جدوى معزولة myocytes البطين الإنسان وجدوى المشبك التصحيح والكالسيوم داخل الخلايا ^{2 +} دراسات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على البروتوكولات التجريبية على الأنسجة البشرية من قبل اللجنة الأخلاقية من جامعة مستشفى Careggi (2006/0024713؛ تجدد مايو 2009). أعطى كل مريض الموافقة المسبقة عن مكتوب.

1. حلول وإعداد معدات

ووصف الحلول في الجدول 1. تم العثور على مخطط مبسط لإجراء العزل الخلية في الشكل 1.

حل		CP	DB	KB	مرض السل	PS	EB1	EB2
كاشف (ملم)	KH 2 PO 4	50
	MgSO 4	8	1.2	5			1.2	1.2
	HEPES	10			10	10
	الأدينوزين	5
	جلوكوز	140	10	20	10		10	10
	مانيتول	100
	التورين	10	20	5			20	20
	كلوريد الصوديوم		113		136		113	113
	بوكل		4.7	85	5.4	25	4.7	4.7
	MgCl 2				1.2	5
	KH 2 PO 4		0.6	30			0.6	0.6
	نا 2 هبو 4		0.6				0.6	0.6
	NaHCO 3		12				12	12
	KHCO 3		10				10	10
	NA-البيروفات		4				4	4
	BDM		10				10	10
	BHBA			5
	حمض السكسينيك			5
	EGTA			0.5
	K-2 ATP			2
	حمض البيروفيك			5
	الكرياتين			5
	KMES					115
الأنزيمات (U / مل)	كولاجيناز نوع V						250	250
	النوع البروتيني الرابع والعشرون						4
درجة الحموضة		7.4 KOH	7.3 هيدروكسيد الصوديوم	7.1 KOH	7.35 هيدروكسيد الصوديوم	7.2 KOH	7.3 هيدروكسيد الصوديوم	7.3 هيدروكسيد الصوديوم

. الجدول 1 حلول المستخدمة لجمع العينات، والعزلة خلية وتوصيف وظيفي من myocytes CP = حل شلل القلب؛ DB = تفارق العازلة؛ KB = حل كرافت-Bruhe؛ السل = عازلة تايرود؛ PS = حل ماصة؛ EB1 = انزيم العازلة 1؛ EB2 = انزيم العازلة 2.

1. إعداد شلل القلب (CP) حل. ويمكن تخزين حل CP في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع.
2. إعداد كا ^{2 +} خالية من التفكك العازلة (DB). ينبغي استخدام هذا الحل خلال اليوم.
3. إعداد كرافت-Bruhe (KB) حل. ويمكن تخزين KB الحل في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 ويك.
4. إعداد كا ^{2 +} خالية العازلة تايرود (السل). ينبغي استخدام هذا الحل خلال اليوم.
5. تصفية جميع الحلول باستخدام مرشحات حقنة قبل استخدامها.
6. إعداد جهاز الهضم (الشكل 2)، وعاء مصنوع من تجريف اثنين من فرش تواجه من السيليكون والمطاط الصناعي، واحدة منها استدارة بواسطة محرك كهربائي. هو العرف الجهاز الهضم. التفاصيل على الجهاز الهضم هي في الشكل 8؛ صور الجهاز في الشكلين 2 C و 2D. غسل الغرفة الأنسجة مع الايثانول 70٪ والمياه.

2. جمع وتجهيز العينات عضلة القلب

1. صب 40 مل من cardiplegic (CP) الحل في أنبوب 50 مل وتخزينها في الجليد لنقل عينة من غرفة المنطوق إلى المختبر العزلة الخلية.
2. جمع العينة عضلة القلب البطيني من غرفة المنطوق مباشرة بعد الختان، وغسله مع الثلج الباردةالحل CP وتخزينها في الأنبوب. استخدام العينات الشغاف رفعه من الحاجز البطيني العليا المشتركة خلال جراحة القلب المفتوح، الترجيح> 100 ملغ.
3. بسرعة نقل العينة إلى المنطقة المختبر؛ بدء تجهيز العينات في غضون 10 دقيقة من العينة الختان.
4. مع الحفاظ على العينة في المخزن الجليد الباردة CP، وإزالة بعناية طبقة تليفي الشغاف باستخدام مقص غرامة تحت stereomicroscope؛ بعد ذلك، قص الأنسجة عضلة القلب إلى قطع صغيرة (2-3 ملم طويلة). اعتمادا على حجم العينة الأنسجة، وقطع المبلغ الإجمالي للالبطين عضلة القلب ما بين 100 ملغ و 1 غرام لكل العزلة.
5. عند الانتهاء من تنميق الأنسجة، ونقل أجزاء عضلة القلب في الجهاز الهضم، مع الجليد نظيفة حل CP الباردة. تجنب ملء مجلدا كاملا بين اثنين من فرش السيليكون (3-4 مل) مع قطع عضلة القلب، وذلك باستخدام ما لا يزيد عن 1 غرام من الأنسجة المجموع.

3. الغسيل والهضم من عضلة القلب قطعة غليظة

1. الخلفإيه يتم نقل قطع في غرفة تجريف للجهاز الهضم، وتغيير المخزن المؤقت CP في غرفة مع الكالسيوم الباردة ² تفارق العازلة خالية من ⁺ (DB).
2. وضع الجهاز الهضم في حمام الحراري، وذلك للغرفة ليكون في اتصال مع الماء الساخن في الحمام (الشكل 1). تعيين الحمام إلى 37.5 درجة مئوية، وتشغيله، وذلك لرفع درجة الحرارة ببطء من الغرفة الأنسجة. تشغيل المحرك للجهاز الهضم، وتحديد سرعة دوران الثورة إلى 1 / ثانية.
3. تنفيذ 3 دورات الغسيل مع DB، وتغيير الحل في غرفة نظيفة مع DB كل 8 دقائق. وارتفعت درجة حرارة DB (37 ° C) والأكسجين المشبع قبل الحصول على اتصال مع أجزاء عضلة القلب.
4. إعداد انزيم عازلة 1 (EB1) وذلك بإضافة 250 U / مل من كولاجيناز نوع V و 4 U / مل البروتياز نوع الرابع والعشرون لحل DB. إعداد انزيم العازلة 2 (EB2) وذلك بإضافة 250 U / مل كولاجيناز نوع V إلى حل DB. الاحماء (37 ° C) وoxygenatه EB1 وEB2.
5. تنفيذ دورتين 12 دقيقة من عملية الهضم في الجهاز الهضم بالتناوب مع EB1 الاوكسيجين 100٪ (عند 37 درجة مئوية). في كل دورة، استخدم ~ 3 مل من EB1. إزالة حل عن طريق الشفط ماصة وتجاهل أنه بعد كل دورة.
6. 6 إعداد 15 مل أنابيب لجمع الخلايا و~ 80 مل من البرد (4 درجات مئوية) KB حل ليبلغ حجمه المخازن المؤقتة.
7. إجراء دورة الهضم 15 دقيقة الأولى مع 3 مل 100٪ EB2 الاوكسيجين في 37 درجة مئوية. بعد دورة الهضم، وجمع محلول يحتوي على myocytes فصلها الأول في أنبوب 15 مل وتمييع تعليق الخلية مع 12 مل KB الباردة الحل. تخزين مسطحة أنبوب في درجة حرارة الغرفة.
8. تمييع الحل EB2 المتبقية مع مبلغ مساو من DB من أجل خفض تركيز كولاجيناز الخامس للدورات التالية الهضم.
9. تنفيذ دورات أخرى 5 12 دقيقة الهضم مع 3 مل EB2 عند 37 درجة مئوية؛ بعد كل منهم جمع من خلية عضلية تحتوي على العازلة في أنبوب مخروطي 15 مل وتمييع مع 12 مل KB الحل. تخزين الخلايا التي تحتوي على أنابيب 6 في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

4. إعادة تعليق الخليوي وكا ^{2 +} إعادة التكيف

1. إضافة 1 ملغ / مل ألبومين المصل البقري (BSA) إلى 20 مل كا ^{2 +} خالية من تايرود العازلة (السل). تحديد الحل.
2. أجهزة الطرد المركزي لستة خلية عضلية تحتوي على أنابيب مخروطية في 100 x ج لمدة 5 دقائق لإجبار myocytes لتسوية. إزالة طاف و resuspend الخلايا في كل أنبوب مع كمية متغير (1-3 مل، اعتمادا على المحصول) من جيش صرب البوسنة التي تحتوي على السل في RT.
3. تدريجيا يزيدون كا ^{2 +} تركيز في المخزن المؤقت الخلية التي تحتوي بإضافة مأخوذة صغيرة من 100 مليمول / لتر و CaCl ₂ الحل. في الخطوات الأولى والثانية يتم رفع كا ^{2 +} تركيز تصل إلى 50 ميكرومول / لتر و 100 ميكرومول / لتر، على التوالي. يتم تنفيذ الخطوات كا ^{2 +} بالإضافة التالية كل 5 دقائق ويتم رفع تركيز بنسبة 100 ميكرومول / لتر في كل خطوة رالزراعة العضوية تركيز النهائي من 0.9 ملمول / لتر.
4. تقييم العائد من إجراء العزل. نقل 0.5 مل من خلية عضلية تحتوي على الحل على غرفة أسفل الزجاج من المجهر. تقييم 15 حقلا المجهر على التكبير 10x الهدف وحساب النسبة المئوية من myocytes صحية (مثل قضيب على شكل الخلايا مع التصدعات واضحة ولا شوائب كبيرة، الشكل 2). العائد المتوقع هو حوالي 20٪.

5. التقييم الوظيفي للالمعزولة العضلية.

بروتوكول التالي هو مثال من cardiomyocyte تقييم وظيفي الإنسان بما في ذلك التسجيلات في وقت واحد من إمكانات العمل والكالسيوم داخل الخلايا ^{2 +} التدفقات.

1. إعداد الحل ماصة (PS) لإجراء التجارب المشبك التصحيح في التكوين التصحيح مثقبة. ويمكن تخزين الحل في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
2. إضافة 1.8 ملمول / لتر و CaCl ₂ إلى كا ² عازلة خالية من تايرود ⁺ (السل). Uحد ذاته هذا الحل لsuperfusion من خلال التجارب العضلية المشبك التصحيح / مضان.
3. نقل 1 مل من تعليق خلية إلى أنبوب 1.5 مل وإضافة 10 ميكرومول / لتر Fluoforte و 10 ميكرولتر Powerload التركيز. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT. بعد ذلك، تعيين أنبوب في الوضع الرأسي وترك الخلية لتسوية لمدة 5 دقائق؛ resuspend الخلايا في كا ^{2 +} التي تحتوي على السل.
4. نقل 0.25 مل من تعليق خلية إلى صغيرة (0.5 مل)، ودرجة الحرارة التي تسيطر عليها المجهر شنت غرفة تسجيل، superfused عن طريق الجاذبية مع نظام microperfusor ساخنة في معدل تدفق 0.3 مل / دقيقة (درجة الحرارة: 37 ± 0.5 درجة مئوية).
5. باستخدام مجتذب micropipette، وإعداد التصحيح ماصات المشبك بقطر غيض من 3 إلى 5 ميكرون والمقاومة من 3-4،5 م عندما تمتلئ PS.
6. إضافة الأمفوتريسين B إلى مجموعة من PS (250 ميكروغرام / مل) واستخدامها لملء الأقطاب.
7. تحديد شكل الخلية قضيب مع التصدعات واضحة، تخلو من شوائب، لجمهورية مقدونيا ختم جيجا وانتظر 5 إلى 10 دقيقة، حتى قطرات المقاومة وصول أقل من 20 MΩ.
8. انتزاع إمكانات العمل في وضع المشبك الحالي باستخدام نبضات قصيرة (<3 ميللي ثانية) على ترددات مختلفة من التحفيز (0.2 هرتز، 0.5 هرتز و 1 هرتز، 1 دقيقة في كل تردد). أثناء مرحلة التسجيل، وتشغيل إضاءة حقل مشرق في 492 ± 3 نانومتر، والكشف عن مضان في Fluoforte 505-520 نانومتر. اكتساب مضان وغشاء المحتملة باستخدام إشارات Digidata 1440A وpClamp 10.0 البرمجيات. تكرار تسلسل تسجيل عدة مرات إذا لزم الأمر؛ ومع ذلك، والحفاظ على مجموع وقت تسجيل أقل من 15 دقيقة لكل خلية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

كان يعمل الطريقة الموصوفة أعلاه لتوصيف وظيفي من تشوهات العضلية معزولة عن الحاجز بين البطينين من المرضى الذين يعانون من اعتلال عضلة القلب الضخامي (HCM) الذي خضع لعملية استئصال العضلة، مقارنة مع مرضى الفشل الضخامي غير غير الجراحية ^21. وتستمد النتائج الواردة في هذا ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وصفناها والتحقق من صحتها وسيلة لعزل myocytes قابلة للحياة من عينات جراحية من عضلة القلب البطيني الإنسان. بدءا من البروتوكولات التي سبق وصفها التي استخدمت بنجاح إلى خلايا معزولة من العينات الجراحية الأذيني، والتقنية للسماح وقد وضعت فصل myocytes واحدة قابلة للحياة المريضة م?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791
Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4*7H2O)	Sigma-Aldrich	M1880
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Adenosine	Sigma-Aldrich	A9251
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	P5958
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S7907
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6297
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Sigma-Aldrich	237205
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	B0753
Sodium hydroxide(NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045
L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate	Sigma-Aldrich	49601
Pyruvic acid	Sigma-Aldrich	107360
3-Hydroxybutyric acid	Sigma-Aldrich	166898
Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP)	Sigma-Aldrich	A8937
Creatine	Sigma-Aldrich	C0780
Succinic Acid	Sigma-Aldrich	S3674
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E0396
Albumin from bovine serum	Sigma-Aldrich	A0281
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V	Sigma-Aldrich	C9263
Proteinase, Bacterial, Type XXIV	Sigma-Aldrich	P8038
Calcium chloride solution, ~1 M in H2O	Sigma-Aldrich	21115
Calcium chloride 0.1 M solution	Sigma-Aldrich	53704
Potassium methanesulfonate	Sigma-Aldrich	83000
FluoForte Reagent	Enzo Life Sciences	ENZ-52015
Powerload concentrate, 100X	Life Technologies	P10020
Perfusion Fast-Step System	Warner Instruments	VC-77SP
Amphotericin B solubilized	Sigma-Aldrich	A9528
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier	Molecular Devices
Digidata 1440A	Molecular Devices
pClamp10.0	Molecular Devices
Digestion Device	CUSTOM	CUSTOM	The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Figure 1C-1D and in Figure7. We can provide further details if requested.
Silicone elastomer for the digestion device's brushes	Dow Corning	SYLGARD® 184
Variable speed rotating motor for the digestion device	Crouzet	Crouzet 178-4765
Mold for brushes casting	N.A.	N.A.	The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods.