Isolamento e caratterizzazione funzionale di Human ventricolare Cardiomyocytes da campioni freschi chirurgici

Riepilogo

Le attuali conoscenze sulla base cellulare di malattie cardiache si basa principalmente su studi su modelli animali. Qui descriviamo e validare un nuovo metodo per ottenere singoli cardiomiociti vitali da piccoli campioni chirurgici di miocardio ventricolare umana. Miociti ventricolari umani possono essere utilizzati per studi elettrofisiologici e test della droga.

Abstract

Cardiomiociti da cuori malati sono sottoposti a processi di rimodellamento complessi che coinvolgono cambiamenti nella struttura cellulare, accoppiamento eccitazione contrazione e correnti ioniche di membrana. Tali modifiche sono suscettibili di essere responsabile per l'aumento del rischio aritmogena e le alterazioni contrattili che portano alla disfunzione sistolica e diastolica nei pazienti cardiopatici. Tuttavia, la maggior informazioni sulle alterazioni della funzione miociti nelle malattie cardiache proviene da modelli animali.

Qui descriviamo e validare un protocollo per isolare miociti vitali da piccoli campioni chirurgici di miocardio ventricolare da pazienti sottoposti a interventi di chirurgia cardiaca. Il protocollo è descritto in dettaglio. Misure elettrofisiologiche e calcio intracellulare sono segnalati per dimostrare la fattibilità di un numero di misurazioni singola cellula in cardiomiociti ventricolari umane ottenute con questo metodo.

Il protocollo ha riferito chere possono essere utili per le future ricerche di base cellulare e molecolare delle alterazioni funzionali del cuore umano in presenza di differenti malattie cardiache. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per identificare nuovi bersagli terapeutici a livello cellulare e per testare l'efficacia di nuovi composti in cardiomiociti umani, con valore traslazionale diretta.

Introduzione

La dissezione delle proprietà elettrofisiologiche del miocardio è progredita notevolmente dopo lo sviluppo di tecniche per l'isolamento singolo dei miociti cardiaci. Recenti progressi nella comprensione dei cardiaco eccitazione contrazione Coupling (CE-Coupling), sono stati resi possibili dalla capacità di isolare vitali singoli cardiomiociti che conservano tutte le proprietà fisiologiche del tessuto intatto. Metodi di patch clamp sono abitualmente impiegati per studiare la funzione e la modulazione farmacologica di correnti ioniche sarcolemma cardiaco. Registrazioni di dinamica del calcio intracellulare con Ca ^{2 +} coloranti sensibili sono regolarmente eseguite su miociti cardiaci singoli da una varietà di modelli sani e malati, fornendo dati vitali sulla fisiologia del CE-Coupling nonché sulle alterazioni patologiche intracellulare Ca ^{2 +} omeostasi che porta a danni meccanici ed aumento degli oneri aritmogena nelle malattie cardiache. Informazione da questi studi è fondamentale per la comprensione degli effetti elettrofisiologici e meccanici di farmaci in ambito clinico. Tuttavia, ci sono specie specifiche differenze nelle correnti transmembrana e nelle proteine ​​CE-coupling che rappresentano caratteristiche specifiche di potenziale cardiaco e meccanica cardiaca. Così, mentre gli studi di miociti isolati da mammiferi non umani hanno chiarito le proprietà biofisiche e ruoli fisiologici di specifici canali ionici transmembrana e proteine ​​EC-Coupling, non necessariamente forniscono modelli provvisti di miociti cardiaci umani. Isolamento dei miociti vitali di miocardio umano è quindi essenziale per comprendere appieno la fisiopatologia delle malattie cardiache e validare nuovi approcci terapeutici.

Tessuto atriale umano è facilmente disponibile come appendici atriali sono spesso scartati durante le procedure chirurgiche. Studi quantitativi iniziali di adulti potenziali d'azione cardiaci umani e cu ionicarrents impiegate cellule atriali enzimatica isolate ^1-4. Registrazioni di potenziali d'azione o correnti di isolate cellule ventricolari umane adulte sono stati successivamente segnalati ^3,5-10. La maggior parte di questi studi hanno utilizzato cellule ottenute da cuori espiantati e utilizzati sia perfusione con collagenasi di un segmento di arteria coronaria o l'esposizione di una rilevante quantità di tessuto asportato alla collagenasi per ottenere cellule isolate. Questi studi hanno permesso una caratterizzazione dettagliata di un numero di correnti ioniche transmembrana di cardiomiociti ventricolari umani da cuori sani e da pazienti con insufficienza cardiaca terminale. Registrazioni di tipo L Ca ^{2 +} corrente (I _Ca-L) ^5-7, corrente di potassio verso l'esterno transitoria _(I) ^8, corrente entrante potassio raddrizzatore (I _κ1) ^8, le varie componenti della corrente di potassio delayed rectifier (I _κ ) ⁹ sono stati segnalati. Anticipi e raffinazione dila procedura di isolamento ^10, ha consentito una chiara caratterizzazione della base ionica del potenziale aumento aritmogenico nello scompenso cardiaco terminale, che comprende l'azione potenziale prolungamento ^11, ritardato dopo depolarizzazioni ¹² e aumentato divertente attuali ¹³ che porta alla depolarizzazione diastolica e battiti prematuri.

Miociti cardiaci adulti sono normalmente isolati da piccoli animali da perfusione retrograda di tutto cuore con varie miscele enzimatiche, una tecnica che produce rendimenti elevati di Ca ^{2 +} cellule-tolleranti ^14. Isolamento di miociti cardiaci da frammenti di tessuto è intrinsecamente meno successo probabilmente a causa del limitato accesso di enzimi per singoli miociti rispetto a quella ottenuta mediante perfusione delle arterie coronarie. A causa della limitata disponibilità di cuori erogatori non utilizzati, l'unico modo pratico per ottenere cellule ventricolari umane normali su base regolare è da digestio enzimatican dei piccolissimi frammenti di tessuto spesso asportati durante le procedure chirurgiche elettive. L'unico modello di malattia umana che è stato ampiamente caratterizzato a livello cellulare è insufficienza cardiaca terminale, a causa della accessibilità ai cuori trapiantati. Tuttavia, insufficienza cardiaca terminale si verifica in una minoranza di pazienti e spesso comporta un percorso comune di grave rimodellamento delle cellule del miocardio, che è relativamente indipendente dalla causa sottostante ^15. La capacità di valutare la funzione di singoli cardiomiociti di pazienti in una fase precedente non avendo della malattia è fondamentale per capire la fisiopatologia specifica delle diverse condizioni ereditarie o acquisite. La cardiomiopatia ipertrofica (HCM) è un esempio eloquente. HCM è un comune (1/500 persone) condizione cardiaca ereditaria caratterizzata da ipertrofia cardiaca, aumento alterazioni rischio e contrattili aritmogenici a causa di ostruzione del tratto di efflusso e disfunzione diastolica ^16. Cardiomiociti da cuori HCM undergo un complesso di processi di rimodellamento che comportano cambiamenti nella struttura delle cellule (ipertrofia, allo sbando miofibrillare) e EC-Coupling ^17. Tuttavia, la maggior informazioni di miociti erettile in HCM è venuto da modelli animali transgenici. Dal momento che solo una minoranza di pazienti HCM evolve verso l'insufficienza cardiaca terminale e necessita di trapianto cardiaco, il cuore HCM sono molto raramente disponibili per l'isolamento delle cellule con metodi standard. Tuttavia, almeno il 30% dei pazienti HCM sviluppano sintomi ostruttivi dovuti alla enorme flusso di sangue tratto ipertrofia settale alterazione deflusso durante la sistole (HCM) ^18. Il più efficace opzione terapeutica disponibile per il sollievo di ostruzione in HCM è chirurgica del setto miectomia: durante questa procedura chirurgica, una porzione di dimensioni variabile del setto superiore viene rimosso approccio aortica trans. Questa porzione di setto ipertrofico è quindi disponibile per l'isolamento delle cellule dal tessuto fresco.

Un metodo per l'isolamento di ventricula umanar miociti dai singoli, piccoli transvenous campioni di biopsia endomiocardica è stato precedentemente sviluppato e pubblicato ^19. Abbiamo implementato un metodo per isolare singoli miociti del setto da campioni di miocardio ventricolare da pazienti sottoposti a chirurgia cardiaca, inclusi i pazienti con HCM sottoposti miectomia settale e pazienti sottoposti a procedure di sostituzione della valvola. Oltre a una descrizione dettagliata del protocollo di isolamento, elettrofisiologico rappresentante e Ca ^{2 +} fluorescenza misurazioni sono presentati, dimostrando la vitalità dei miociti ventricolari isolati umani e la fattibilità di patch clamp e ^{Ca2 +} intracellulare studi.

Protocollo

I protocolli sperimentali su tessuti umani sono stati approvati dal comitato etico di Careggi University-Hospital (2006/0024713; rinnoverà maggio 2009). Ogni paziente ha dato il consenso informato scritto.

1. Soluzioni agricole per la preparazione

Le soluzioni sono descritte nella Tabella 1. Un diagramma di flusso semplificato della procedura di isolamento cellulare è situato nella Figura 1.

Soluzione		CP	DB	KB	TB	PS	EB1	EB2
Reattivo (mm)	KH 2 PO 4	50
	MgSO 4	8	1.2	5			1.2	1.2
	HEPES	10			10	10
	adenosina	5
	glucosio	140	10	20	10		10	10
	mannitolo	100
	taurina	10	20	5			20	20
	NaCl		113		136		113	113
	KCl		4.7	85	5.4	25	4.7	4.7
	MgCl 2				1.2	5
	KH 2 PO 4		0.6	30			0.6	0.6
	Na 2 HPO 4		0.6				0.6	0.6
	NaHCO 3		12				12	12
	KHCO 3		10				10	10
	Na-piruvato		4				4	4
	BDM		10				10	10
	BHBA			5
	acido succinico			5
	EGTA			0.5
	K 2-ATP			2
	acido piruvico			5
	creatina			5
	KMES					115
Enzimi (U / ml)	Collagenase tipo V						250	250
	Protease Tipo XXIV						4
pH		7.4 KOH	7.3 NaOH	7.1 KOH	7.35 NaOH	7.2 KOH	7.3 NaOH	7.3 NaOH

. Tabella 1 Soluzioni utilizzati per la raccolta dei campioni, l'isolamento delle cellule e caratterizzazione funzionale di miociti CP = soluzione cardioplegica.; DB = buffer di dissociazione; KB = soluzione Kraft-Brühe; TB = tampone Tyrode; PS = soluzione di pipetta; EB1 = tampone enzimatico 1; EB2 = tampone enzima 2.

1. Preparare la soluzione cardioplegica (CP). Soluzione CP può essere conservato a 4 ° C per 1 settimana.
2. Preparare Ca ^{2 +} libero-tampone di dissociazione (DB). Questa soluzione deve essere utilizzata entro la giornata.
3. Preparare la soluzione Kraft-Brühe (KB). KB soluzione può essere conservato a 4 ° C per un massimo di 1 week.
4. Preparare Ca ² buffer di Tyrode libero ⁺ (TB). Questa soluzione deve essere utilizzata entro la giornata.
5. Filtrare con usando filtri siringa prima dell'uso.
6. Preparare il dispositivo di digestione (Figura 2), un contenitore raschiatura fatta di due spazzole affacciate di elastomero siliconico, una delle quali in rotazione da un motore elettrico. Il dispositivo di digestione è su misura. Dettagli sul dispositivo digestione sono in Figura 8; immagini del dispositivo sono nelle figure 2 C e 2D. Lavare la camera di tessuto con il 70% di etanolo e acqua.

2. Raccolta ed elaborazione dei Campioni Infarto

1. Versare 40 ml di soluzione cardiplegic (CP) in un tubo da 50 ml e conservare in ghiaccio per trasporto campione dalla sala operatoria al laboratorio di isolamento cellulare.
2. Raccogliere il campione del miocardio ventricolare dalla sala operatoria subito dopo l'asportazione, lavarlo con ghiaccio freddoSoluzione CP e memorizzarlo nel tubo. Utilizzare campioni endocardiche asportato dal setto ventricolare tra superiore durante l'intervento chirurgico a cuore aperto, la ponderazione> 100 mg.
3. Trasferire rapidamente il campione alla zona di laboratorio; avviare l'elaborazione del campione entro 10 minuti da un campione escissione.
4. Pur mantenendo il campione di tampone a freddo ghiaccio CP, rimuovere delicatamente lo strato fibrotico endocardial con le forbici sottili allo stereomicroscopio; poi, tagliare il tessuto miocardico a piccoli pezzi (2-3 mm di lunghezza). A seconda delle dimensioni del campione di tessuto, tagliare un importo complessivo di miocardio ventricolare tra 100 mg e 1 g per ogni isolamento.
5. Al termine della macinazione tessuto, trasferire i pezzi del miocardio nel dispositivo di digestione, con ghiaccio pulito soluzione CP freddo. Evitare di riempire tutto il volume tra le due spazzole di silicio (3-4 ml) con pezzi del miocardio, utilizzando non più di 1 g di tessuto totale.

3. Lavaggio e Digestione del miocardio Chunks

1. A poppaer i pezzi vengono trasferiti nella camera raschiando il dispositivo di digestione, modificare il buffer CP nella camera con il freddo Ca ^{2 +} buffer di dissociazione-free (DB).
2. Posizionare il dispositivo di digestione in un bagno termostatico, in modo che la camera di essere in contatto con l'acqua riscaldata nella vasca (Figura 1). Impostare la vasca di 37,5 ° C e accenderla, al fine di aumentare lentamente la temperatura della camera di tessuto. Accendere il motore del dispositivo di digestione, impostando la velocità di rotazione di 1 giro / secondo.
3. Eseguire 3 cicli di lavaggio con DB, cambiando la soluzione nella camera pulita con DB ogni 8 min. Il DB è riscaldata (37 ° C) e ossigeno saturo prima di entrare in contatto con i pezzi del miocardio.
4. Preparare tampone enzimatico 1 (EB1) con l'aggiunta di 250 U / ml di collagenasi di tipo V e 4 U / ml Protease Tipo XXIV alla soluzione DB. Preparare tampone enzima 2 (EB2) con l'aggiunta di 250 U / ml collagenasi di tipo V di soluzione DB. Warm up (37 ° C) e oxygenate EB1 ed EB2.
5. Eseguire due cicli di 12 min di digestione nel dispositivo digestione rotante con 100% EB1 ossigenato (a 37 ° C). Ad ogni ciclo, utilizzare ~ 3 ml di EB1. Rimuovere la soluzione pipetta aspirazione e scartarla dopo ogni ciclo.
6. Preparare 6 provette da 15 ml per la raccolta di cellule e ~ 80 ml di freddo (4 ° C) KB soluzione per eluire i buffer.
7. Effettuare un primo ciclo digestione 15 min con 3 ml 100% EB2 ossigenata a 37 ° C. Dopo il ciclo di digestione, raccogliere la soluzione contenente i primi miociti dissociate in una provetta da 15 ml e diluire la sospensione cellulare con 12 ml di soluzione fredda KB. Conservare il piatto tubo a temperatura ambiente.
8. Diluire la soluzione EB2 rimanente con una quantità uguale di DB per dimezzare la concentrazione di collagenasi V per i seguenti cicli di digestione.
9. Eseguire altri cicli 5 12 min digestione con 3 EB2 ml a 37 ° C; dopo ciascuno di loro raccolta di miociti contenente tampone in un tubo da 15 ml ediluire con 12 ml di soluzione KB. Conservare le provette cella contenente 6 a temperatura ambiente per 30 min.

4. Resuspension cellulare e Ca ^{2 +} riadattamento

1. Aggiungere 1 mg / ml di albumina di siero bovino (BSA) per 20 ml tampone Ca ^{2 +-Tyrode} libero (TB). Filtrare la soluzione.
2. Centrifugare le sei tubi conici miociti contenente 100 xg per 5 minuti per forzare miociti per risolvere. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in ciascun tubo con un ammontare variabile (1-3 ml, a seconda della resa) di BSA contenente TB a RT.
3. Aumentare gradualmente Ca ^{2 +} concentrazione nella memoria di cella contenente aggiungendo piccole aliquote di 100 mmol / L CaCl ₂ soluzione. Nella prima e nella seconda fase di Ca ^{2 +} concentrazione viene aumentata fino a 50 mmol / L e 100 mmol / L, rispettivamente. I seguenti passaggi Ca ^{2 +} addizione vengono eseguiti ogni 5 minuti e la concentrazione viene sollevato da 100 micromol / L ad ogni passo toa concentrazione finale di 0,9 mmol / L.
4. Valutare la resa della procedura di isolamento. Trasferire 0,5 ml di soluzione contenente miociti sulla camera inferiore di vetro di un microscopio. Valutare 15 campi di microscopio a 10x obiettivo e calcolare la percentuale di miociti sani (ad esempio cellule a forma di bastoncello, con striature chiare e senza inclusioni significative, Figura 2). Il rendimento atteso è di circa il 20%.

5. Valutazione funzionale dei cardiomiociti isolati.

Il protocollo che segue è un esempio di valutazione funzionale dei cardiomiociti umani tra cui registrazioni simultanee di potenziali d'azione e intracellulare Ca ^{2 +} flussi.

1. Preparare la soluzione di pipetta (PS) per esperimenti di patch clamp in configurazione di patch perforato. La soluzione può essere conservata a -20 ° C per 3 mesi.
2. Aggiungere 1,8 mmol / L CaCl ₂ a Ca ^{2 +} tampone Tyrode-free (TB). Use questa soluzione per superfusione dei cardiomiociti durante esperimenti di patch clamp / fluorescenza.
3. Trasferire 1 ml di sospensione cellulare in una provetta da 1,5 ml e aggiungere 10 micromol / L Fluoforte e 10 microlitri Powerload Concentrato. Incubare per 30 minuti a RT. Successivamente, impostare il tubo in posizione verticale e lasciare la cella accontentarsi di 5 min; risospendere le cellule in Ca ^{2 +} contenente TB.
4. Trasferire 0,25 ml di sospensione cellulare in un piccolo (0,5 ml), microscopio temperatura controllata montato camera di registrazione, superfuse per gravità con un sistema microperfusor riscaldato a una velocità di flusso di 0,3 ml / min (temperatura: 37 ± 0,5 ° C).
5. Con un estrattore micropipetta, preparare pipette di patch clamp con un diametro di punta di 3 a 5 micron e una resistenza da 3 a 4,5 m quando riempita con PS.
6. Aggiungere amfotericina B a un lotto di PS (250 mcg / ml) e usarlo per riempire gli elettrodi.
7. Selezionare una cella canna a forma di striature chiare, privo di inclusioni, form il sigillo giga e aspettare 5-10 minuti, fino a quando la resistenza accesso scende al di sotto di 20 mW.
8. Suscitare potenziali d'azione in modalità pinza corrente utilizzando impulsi brevi (<3 msec) a diverse frequenze di stimolazione (0,2 Hz, 0.5 Hz e 1 Hz, 1 min ciascuna frequenza). Durante la fase di registrazione, accendere l'illuminazione in campo chiaro a 492 ± 3 nm e rilevare Fluoforte fluorescenza a 505-520 nm. Acquisire fluorescenza e membrana segnali di potenziali utilizzando Digidata 1440A e software pClamp 10.0. Ripetere la sequenza di registrazione più volte, se necessario; tuttavia, mantenere il tempo di registrazione totale inferiore a 15 minuti per ogni cella.

Risultati

Il metodo sopra descritto è stato impiegato per caratterizzare le alterazioni funzionali di cardiomiociti isolati dal setto interventricolare di pazienti con cardiomiopatia ipertrofica (HCM) che hanno subito un'operazione miectomia, rispetto ai pazienti non in mancanza non ipertrofiche chirurgici ^21. I risultati contenuti in questa sezione provengono da quel lavoro ²¹ e sono mostrati qui come un esempio di come questa tecnica può essere utilizzata per caratterizzare le alterazioni della funzi...

Discussione

Abbiamo descritto e validato un metodo per isolare miociti vitali da campioni chirurgici di miocardio ventricolare umano. Partendo da protocolli precedentemente descritti che erano stati utilizzati con successo per cellule isolate da campioni chirurgici atriali, la tecnica per consentire la separazione dei miociti vitali singoli da malato miocardio ventricolare è stato sviluppato e perfezionato. I primi rapporti hanno mostrato che l'isolamento dei singoli cardiomiociti da pezzi di atriale e ventricolare tessuto sel...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791
Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4*7H2O)	Sigma-Aldrich	M1880
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Adenosine	Sigma-Aldrich	A9251
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	P5958
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S7907
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6297
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Sigma-Aldrich	237205
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	B0753
Sodium hydroxide(NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045
L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate	Sigma-Aldrich	49601
Pyruvic acid	Sigma-Aldrich	107360
3-Hydroxybutyric acid	Sigma-Aldrich	166898
Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP)	Sigma-Aldrich	A8937
Creatine	Sigma-Aldrich	C0780
Succinic Acid	Sigma-Aldrich	S3674
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E0396
Albumin from bovine serum	Sigma-Aldrich	A0281
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V	Sigma-Aldrich	C9263
Proteinase, Bacterial, Type XXIV	Sigma-Aldrich	P8038
Calcium chloride solution, ~1 M in H2O	Sigma-Aldrich	21115
Calcium chloride 0.1 M solution	Sigma-Aldrich	53704
Potassium methanesulfonate	Sigma-Aldrich	83000
FluoForte Reagent	Enzo Life Sciences	ENZ-52015
Powerload concentrate, 100X	Life Technologies	P10020
Perfusion Fast-Step System	Warner Instruments	VC-77SP
Amphotericin B solubilized	Sigma-Aldrich	A9528
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier	Molecular Devices
Digidata 1440A	Molecular Devices
pClamp10.0	Molecular Devices
Digestion Device	CUSTOM	CUSTOM	The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Figure 1C-1D and in Figure7. We can provide further details if requested.
Silicone elastomer for the digestion device's brushes	Dow Corning	SYLGARD® 184
Variable speed rotating motor for the digestion device	Crouzet	Crouzet 178-4765
Mold for brushes casting	N.A.	N.A.	The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods.