L'isolement et la caractérisation fonctionnelle de Human ventriculaire cardiomyocytes à partir des échantillons chirurgicaux frais

Résumé

Les connaissances actuelles sur la base cellulaire de maladies cardiaques repose principalement sur des études sur des modèles animaux. Nous décrivons ici et valider une nouvelle méthode pour obtenir des cardiomyocytes viables simples de petits échantillons chirurgicaux de myocarde ventriculaire humaine. Myocytes ventriculaires humains peuvent être utilisés pour des études électrophysiologiques et le dépistage des drogues.

Résumé

Cardiomyocytes de coeurs malades sont soumis à des processus de remodelage complexes impliquant des changements dans la structure de la cellule, le couplage excitation contraction et les courants ioniques membranaires. Ces changements sont susceptibles d'être responsable de l'augmentation du risque arythmogène et les altérations contractiles conduisant à un dysfonctionnement systolique et diastolique chez les patients cardiaques. Cependant, la plupart des informations sur les modifications de la fonction des myocytes cardiaques dans les maladies est venu à partir de modèles animaux.

Nous décrivons ici et valider un protocole d'isoler les myocytes viables de petits échantillons chirurgicaux de myocarde ventriculaire de patients subissant des opérations de chirurgie cardiaque. Le protocole est décrit dans le détail. Les mesures de calcium intracellulaires et électrophysiologiques sont rapportés à démontrer la faisabilité d'un certain nombre de mesures de cellules simples dans des cardiomyocytes ventriculaires humains obtenus avec cette méthode.

Le protocole a signalére peuvent être utiles pour des enquêtes futures de la base cellulaire et moléculaire des altérations fonctionnelles du cœur humain en présence de différentes maladies cardiaques. En outre, cette méthode peut être utilisée pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques au niveau cellulaire et pour tester l'efficacité de nouveaux composés sur des cardiomyocytes humains, avec une valeur de translation direct.

Introduction

Dissection des propriétés électrophysiologiques du myocarde a progressé de façon marquée après la mise au point de techniques pour seule isolation des myocytes cardiaques. Les récents progrès dans la compréhension de la contraction cardiaque excitation Coupling (CE-Coupling) ont également été rendue possible par la capacité d'isoler des cardiomyocytes viables simples qui conservent toutes les propriétés physiologiques des tissus intacts. Procédés de patch-clamp sont couramment utilisées pour étudier la fonction et la modulation pharmacologique des courants ioniques sarcolemmiques cardiaque. Les enregistrements de la dynamique du calcium intracellulaire avec Ca ^{2 +} colorants sensibles sont également effectués régulièrement sur ​​les myocytes cardiaques simples d'une variété de modèles sains et malades, fournir des données essentielles sur la physiologie de la CE-couplage ainsi que sur les modifications pathologiques de Ca ^{2 +} homéostasie conduisant à une altération mécanique et l'augmentation du fardeau des maladies cardiaques arythmogène. Information de ces études est essentiel pour comprendre les effets électrophysiologiques et mécaniques des médicaments en milieu clinique. Cependant, il ya des différences entre les espèces spécifiques dans les courants transmembranaires et des protéines CE-couplage qui représentent caractéristiques de potentiel d'action cardiaque et la mécanique cardiaque. Ainsi, bien que les études sur des myocytes isolés à partir de mammifères non humains ont permis d'élucider les propriétés biophysiques et les rôles physiologiques des canaux spécifiques d'ions transmembranaires et des protéines EC-couplage, ils ne constituent pas nécessairement des modèles pertinents de myocytes cardiaques humaines. Isolation des myocytes viables du myocarde humain est donc essentiel de bien comprendre la physiopathologie des maladies cardiaques et de valider de nouvelles approches thérapeutiques.

Tissu auriculaire humain est facilement disponible comme des appendices auriculaires sont souvent jetés pendant les interventions chirurgicales. Études quantitatives initiales de potentiels d'action cardiaque humains adultes et cu ioniquerrents employés cellules auriculaires isolées enzymatiquement ^1-4. Enregistrements de potentiels d'action ou des courants à partir de cellules humaines isolées ventriculaires adultes ont ensuite été rapportés ^3,5-10. La plupart de ces études ont utilisé des cellules obtenues à partir de cœurs expiantes et utilisés perfusion de collagénase ou l'autre d'un segment de l'artère coronaire ou l'exposition de relativement grandes quantités de tissu excisé de la collagénase pour obtenir des cellules isolées. Ces études ont permis une caractérisation détaillée d'un certain nombre de courants ioniques transmembranaires de cardiomyocytes ventriculaires droits de coeurs sains et de patients atteints d'insuffisance cardiaque terminale. Les enregistrements de type L de Ca ^{2 +} de courant (I _Ca-L) ^5-7, courant potassique transitoire sortant _{(I to)} ^8, le courant entrant de potassium redresseur (I _κ1) ^8, les différentes composantes du courant potassique redresseur retardé (I _κ ) ⁹ ont été rapportés. Avances et raffinage dela procédure d'isolement ^10, a permis une caractérisation précise de la base ionique du potentiel arythmogène augmenté dans l'insuffisance cardiaque terminale, comprenant une action potentielle prolongation ^11, retardée après dépolarisations ¹² et a augmenté actuel drôle ¹³ menant à la dépolarisation diastolique et extrasystoles.

Myocytes cardiaques adultes sont normalement isolés de petits animaux par perfusion rétrograde de l'ensemble du cœur avec différents mélanges d'enzymes, une technique qui produit des rendements élevés de Ca ^{2 +} cellules tolérantes ^14. Isolation des myocytes cardiaques à partir de fragments de tissu est intrinsèquement moins réussie probablement à cause de l'accès limité des enzymes de myocytes individuels par rapport à celui obtenu par perfusion des artères coronaires. En raison de la disponibilité très limitée de cœurs de donneurs non utilisés, le seul moyen pratique d'obtenir des cellules ventriculaires humains normaux sur une base régulière est par digestio enzymatiquen des fragments de tissus sont souvent très petites excisés au cours de procédures chirurgicales non urgentes. Le seul modèle de la maladie humaine qui a été caractérisé de façon approfondie au niveau de la cellule est l'insuffisance cardiaque terminale, en raison de l'accessibilité aux cœurs transplantés. Cependant, l'insuffisance cardiaque terminale se produit dans une minorité de patients et implique une voie commune de remodelage grave des cellules du myocarde, ce qui est relativement indépendante de la cause sous-jacente ¹⁵ souvent. La capacité d'évaluer la fonction des cardiomyocytes simples des patients à un stade précoce de la maladie non défaut est crucial de comprendre la physiopathologie spécifique des différentes maladies héréditaires ou acquises. Cardiomyopathie hypertrophique (CMH) est un exemple éloquent. HCM est une commune (1/500 personnes) de l'état cardiaque héréditaire caractérisée par une hypertrophie cardiaque, une augmentation des altérations de risque et contractiles arythmogènes due à une obstruction des voies et la dysfonction diastolique ^16. Cardiomyocytes de coeurs HCM undergo un processus de remodelage complexes impliquant des changements dans la structure cellulaire (hypertrophie, désarroi myofibrillaire) et CE-couplage ^17. Cependant, la plupart des informations de dysfonctionnement des myocytes dans HCM est venu de modèles animaux transgéniques. Depuis, seule une minorité de patients HCM évolue vers l'insuffisance cardiaque terminale et nécessite une transplantation cardiaque, coeurs HCM sont très rarement disponibles pour l'isolement de cellules avec des méthodes classiques. Cependant, au moins 30% des patients HCM développer des symptômes d'obstruction due à la circulation sanguine massif hypertrophie septale modification des sorties de voies au cours de la systole (HCM) ^18. L'option thérapeutique disponible la plus efficace pour le soulagement de l'obstruction à Ho Chi Minh est chirurgical septale myectomie: au cours de cette intervention chirurgicale, une portion de taille variable de la cloison supérieure est enlevée par l'approche aortique trans. Cette partie du septum hypertrophié est donc disponible pour l'isolement de cellules à partir du tissu frais.

Procédé pour l'isolement de l'homme ventricular myocytes de simples, petites biopsies endomyocardiques transveineuses a déjà été élaboré et publié ^19. Nous avons implémenté une méthode pour isoler les myocytes septum simples à partir d'échantillons de myocarde ventriculaire chez les patients subissant une chirurgie cardiaque, y compris les patients avec HCM subissant myectomie septale et patients subissant des procédures de remplacement de la valve. En plus d'une description détaillée du protocole d'isolement, électrophysiologiques et représentant Ca ^{2 +} fluorescence mesures sont présentés, ce qui démontre la viabilité des myocytes ventriculaires isolés humains et la faisabilité de patch-clamp et de Ca ^{2 +} intracellulaire études.

Protocole

Les protocoles expérimentaux sur des tissus humains ont été approuvés par le comité d'éthique de l'Université de Careggi-Hôpital (2006/0024713; renouvelé mai 2009). Chaque patient a donné son consentement éclairé.

1. Solutions et Préparation du matériel

Les solutions sont décrites dans le tableau 1. Un organigramme simplifié de la procédure d'isolement des cellules est constaté sur la figure 1.

Solution		CP	DB	KB	TB	PS	EB1	EB2
Réactif (mM)	KH 2 PO 4	50
	MgSO4	8	1.2	5			1.2	1.2
	HEPES	10			10	10
	adénosine	5
	glucose	140	10	20	10		10	10
	mannitol	100
	taurine	10	20	5			20	20
	NaCl		113		136		113	113
	KCl		4.7	85	5.4	25	4.7	4.7
	MgCl2				1.2	5
	KH 2 PO 4		0,6	30			0,6	0,6
	Na 2 HPO 4		0,6				0,6	0,6
	NaHCO 3		12				12	12
	KHCO3		10				10	10
	Na-pyruvate		4				4	4
	BDM		10				10	10
	BHBA			5
	l'acide succinique			5
	EGTA			0,5
	K 2-ATP			2
	l'acide pyruvique			5
	créatine			5
	KMES					115
Enzymes (U / ml)	Collagénase de type V						250	250
	Protéase de type XXIV						4
pH		7.4 KOH	7.3 NaOH	7.1 KOH	7,35 NaOH	7.2 KOH	7.3 NaOH	7.3 NaOH

. Tableau 1 Les solutions utilisées pour la collecte de l'échantillon, l'isolement cellulaire et la caractérisation fonctionnelle des myocytes CP = solution de cardioplégie.; DB = tampon de dissociation; KB = solution Kraft-Brühe; TB = tampon Tyrode; PS = solution de pipette; EB1 = enzyme tampon 1; EB2 = enzyme tampon 2.

1. Préparer cardioplégie (CP) solution. solution de CP peut être stocké à 4 ° C pendant 1 semaine.
2. Préparer Ca ^{2 +} libre-dissociation tampon (DB). Cette solution doit être utilisée dans la journée.
3. Préparer Kraft-Brühe (KB) solution. KB solution peut être stockée à 4 ° C pendant jusqu'à 1 week.
4. Préparer Ca ² tampon de Tyrode sans ⁺ (TB). Cette solution doit être utilisée dans la journée.
5. Filtrer toutes les solutions en utilisant des filtres à seringue avant utilisation.
6. Préparer le dispositif de digestion (figure 2), un récipient de raclage constitué de deux brosses opposées de l'élastomère de silicone, dont l'une en rotation par un moteur électrique. Le dispositif de digestion est fait sur mesure. Détails sur le dispositif de digestion sont dans la figure 8; des images de l'appareil sont dans les figures 2 C et 2D. Laver la chambre de tissu avec 70% d'éthanol et d'eau.

2. Collecte et traitement des échantillons du myocarde

1. Verser 40 ml d'cardiplegic (CP) solution dans un tube de 50 ml et de le stocker dans de la glace pour le transport de l'échantillon de la pièce opératoire au laboratoire de l'isolement cellulaire.
2. Recueillir l'échantillon du myocarde ventriculaire de la salle opératoire immédiatement après l'excision, le laver avec le froid de la glacesolution de CP et de le stocker dans le tube. Utilisez spécimens endocardiaques excisés du septum inter ventriculaire supérieure pendant la chirurgie à cœur ouvert, la pondération> 100 mg.
3. Transférer rapidement l'échantillon dans la zone de laboratoire; commencer le traitement des échantillons dans les 10 minutes à partir de l'échantillon excision.
4. Tout en gardant l'échantillon dans un tampon glacé de CP, retirer délicatement la couche fibreuse endocardique l'aide de ciseaux fins sous un stéréomicroscope; après, couper le tissu myocardique en petits morceaux (2-3 mm de long). Selon tissu taille de l'échantillon, couper un montant total de myocarde ventriculaire entre 100 mg et 1 g pour chaque isolement.
5. À la fin de hachage de tissus, de transférer les morceaux du myocarde dans le dispositif de la digestion, avec une solution de CP froid de la glace propre. Éviter de remplir l'ensemble du volume entre les deux brosses de silicium (3-4 ml) avec des morceaux du myocarde, en n'utilisant pas plus de 1 g de tissu ensemble.

3. Laver et la digestion de l'infarctus morceaux

1. À l'arrièreer les morceaux sont transférés dans la chambre de raclage de l'appareil de digestion, changer le tampon de CP dans la chambre avec ² Ca froid tampon de dissociation ⁺ libre (DB).
2. Placer l'appareil de digestion dans un bain thermostatique, pour que la chambre à être en contact avec l'eau chaude dans le bain (figure 1). Réglez le bain à 37,5 ° C et allumez-le, afin d'augmenter lentement la température de la chambre de tissus. Mettre en marche le moteur du dispositif de digestion, régler la vitesse de rotation de 1 tour / seconde.
3. Effectuer 3 cycles de lavage avec DB, en changeant la solution dans la chambre avec propre DB toutes les 8 min. La DB est réchauffé (37 ° C) et d'oxygène saturé avant entrer en contact avec les morceaux du myocarde.
4. Préparer une enzyme tampon (EB1) par addition de 250 U / ml de collagénase de type V et de 4 U / ml de protéase de type XXIV solution à DB. Préparer enzyme tampon 2 (EB2) en ajoutant 250 U / ml de collagénase de type V de solution DB. Warm up (37 ° C) et oxygenate EB1 et EB2.
5. Effectuer deux cycles de 12 min de digestion dans le dispositif de rotation digestion avec 100% EB1 oxygénée (à 37 ° C). A chaque cycle, utilisez ~ 3 ml de EB1. Retirer la solution par pipette d'aspiration et le jeter après chaque cycle.
6. Préparer six tubes de 15 ml pour la collecte de cellules et ~ 80 ml de froid (4 ° C), KB solution pour éluer les tampons.
7. Effectuez un premier cycle de digestion de 15 minutes avec 3 ml 100% EB2 oxygénée à 37 ° C. Après le cycle de digestion, de recueillir la solution contenant les premières myocytes dissociées dans un tube de 15 ml et diluer la suspension cellulaire avec 12 ml de solution froide KB. Rangez le plat du tube à température ambiante.
8. Diluer la solution EB2 restant avec une quantité égale de DB afin de réduire de moitié la concentration de collagénase V pour les cycles de digestion suivantes.
9. S'acquitter d'autres cycles 5 12 min de digestion avec 3 ml EB2 à 37 ° C; après chacun d'eux collecter des myocytes contenant du tampon dans un tube conique de 15 ml etdiluer avec 12 ml KB solution. Conserver les tubes de cellules contenant de 6 à la température ambiante pendant 30 min.

4. Remise en suspension cellulaire et Ca ^{2 +} de réadaptation

1. Ajouter 1 mg / ml d'albumine de sérum bovin (BSA) à 20 ml de Ca ^{2 +} Tyrode sans tampon (TB). Filtrer la solution.
2. Centrifuger les six myocytes contenant des tubes coniques à 100 g pendant 5 min à la force pour régler les myocytes. Eliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans chaque tube avec une quantité variable (1 à 3 ml, en fonction du rendement) de BSA contenant TB à TA.
3. Augmenter progressivement la concentration en ^{Ca2 +} dans le tampon de cellule contenant par addition de petites portions aliquotes de 100 mmol / L de solution de CaCl _2. Dans les première et deuxième étapes concentration en ^{Ca2 +} est augmentée jusqu'à 50 pmol / L et de 100 pmol / L, respectivement. Les étapes Ca ^{2 +} d'addition suivantes sont effectuées toutes les 5 min et la concentration est soulevé par 100 pmol / L à chaque étape to une concentration finale de 0,9 mmol / L.
4. Évaluer le rendement de la procédure d'isolement. Transférer 0,5 ml d'une solution contenant des myocytes sur le fond de chambre de verre de microscope. Évaluer 15 champs microscopiques à un grossissement de 10x objectif et calculer le pourcentage de myocytes sains (par exemple, les cellules en forme de tige avec des stries claires et sans inclusions importantes, figure 2). Le rendement attendu est de l'ordre de 20%.

5. Evaluation fonctionnelle des cardiomyocytes isolés.

Le protocole suivant est un exemple de l'évaluation fonctionnelle des cardiomyocytes humains, y compris des enregistrements simultanés de potentiels d'action et ^{Ca2 +} intracellulaire flux.

1. Préparer la solution de la pipette (PS) pour les expériences de patch clamp en configuration patch perforé. La solution peut être stockée à -20 ° C pendant jusqu'à 3 mois.
2. Ajouter 1,8 mmol / L CaCl ₂ à ^Ca2 tampon de Tyrode ⁺ libre (TB). Usoi cette solution pour surfusion des cardiomyocytes au cours des expériences de patch-clamp / fluorescence.
3. Transfert de 1 ml de suspension cellulaire à un tube de 1,5 ml et ajouter 10 umol / L et 10 ul Fluoforte Powerload concentré. Incuber pendant 30 min à température ambiante. Ensuite, réglez le tube en position verticale et quitter la cellule se contenter de 5 min; remettre les cellules en Ca ^{2 +} contenant la tuberculose.
4. Transférer 0,25 ml de la suspension cellulaire à un petit (0,5 ml), à température contrôlée au microscope monté chambre d'enregistrement, superfusées par gravité avec un système de microperfusor chauffée à un débit de 0,3 ml / min (température: 37 ± 0,5 ° C).
5. L'utilisation d'un étirage de micropipettes, plaquées préparer les pipettes de serrage avec un diamètre de pointe de 3 à 5 um et une résistance de 3 à 4,5 M lorsqu'elle est remplie avec PS.
6. Ajouter amphotéricine B à un lot de PS (250 pg / ml) et l'utiliser pour remplir les électrodes.
7. Sélectionner une tige en forme de cellule avec des stries claires, dépourvues d'inclusions, form le sceau de giga et attendre 5 à 10 min, jusqu'à ce que la résistance d'accès est inférieur à 20 MQ.
8. Induire des potentiels d'action dans le mode de blocage de courant en utilisant des impulsions courtes (<3 ms) à différentes fréquences de stimulation (0,2 Hz, 0,5 Hz et 1 Hz, 1 min à chaque fréquence). Au cours de la phase d'enregistrement, allumer l'éclairage du champ lumineux à 492 ± 3 nm et détecter Fluoforte fluorescence à 505 à 520 nm. Acquérir la fluorescence et de la membrane en utilisant des signaux potentiels Digidata 1440A et le logiciel pClamp 10,0. Répétez la séquence d'enregistrement plusieurs fois si nécessaire; Cependant, gardez la durée totale d'enregistrement en dessous de 15 min pour chaque cellule.

Résultats

La méthode décrite ci-dessus a été utilisé pour caractériser les anomalies fonctionnelles des cardiomyocytes isolés du septum interventriculaire des patients atteints de cardiomyopathie hypertrophique (CMH) qui ont subi une opération de myectomie, par rapport aux patients défaut hypertrophiques non non chirurgicaux ^21. Les résultats présentés dans cette section sont dérivées à partir de ce travail ²¹ et sont représentés ici comme un exemple de comment cette technique peut être uti...

Discussion

Nous avons décrit et validé une méthode pour isoler les myocytes viables à partir d'échantillons chirurgicaux de myocarde ventriculaire humaine. A partir de protocoles décrits précédemment qui avaient été utilisées avec succès pour des cellules isolées à partir d'échantillons chirurgicaux auriculaire, la technique pour permettre la séparation des myocytes viables simples du malade myocarde ventriculaire a été développé et affiné. Les premiers rapports ont montré que l'isolement des card...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791
Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4*7H2O)	Sigma-Aldrich	M1880
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Adenosine	Sigma-Aldrich	A9251
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	P5958
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S7907
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6297
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Sigma-Aldrich	237205
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	B0753
Sodium hydroxide(NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045
L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate	Sigma-Aldrich	49601
Pyruvic acid	Sigma-Aldrich	107360
3-Hydroxybutyric acid	Sigma-Aldrich	166898
Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP)	Sigma-Aldrich	A8937
Creatine	Sigma-Aldrich	C0780
Succinic Acid	Sigma-Aldrich	S3674
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E0396
Albumin from bovine serum	Sigma-Aldrich	A0281
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V	Sigma-Aldrich	C9263
Proteinase, Bacterial, Type XXIV	Sigma-Aldrich	P8038
Calcium chloride solution, ~1 M in H2O	Sigma-Aldrich	21115
Calcium chloride 0.1 M solution	Sigma-Aldrich	53704
Potassium methanesulfonate	Sigma-Aldrich	83000
FluoForte Reagent	Enzo Life Sciences	ENZ-52015
Powerload concentrate, 100X	Life Technologies	P10020
Perfusion Fast-Step System	Warner Instruments	VC-77SP
Amphotericin B solubilized	Sigma-Aldrich	A9528
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier	Molecular Devices
Digidata 1440A	Molecular Devices
pClamp10.0	Molecular Devices
Digestion Device	CUSTOM	CUSTOM	The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Figure 1C-1D and in Figure7. We can provide further details if requested.
Silicone elastomer for the digestion device's brushes	Dow Corning	SYLGARD® 184
Variable speed rotating motor for the digestion device	Crouzet	Crouzet 178-4765
Mold for brushes casting	N.A.	N.A.	The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods.