Выделение и функциональная характеристика человека желудочка кардиомиоцитов из свежих хирургических образцов

Резюме

Современные знания на клеточном основе сердечных заболеваний в основном опирается на исследования на моделях животных. Здесь мы опишем и проверить новый метод для получения одного жизнеспособного кардиомиоциты от небольших хирургических образцах миокарда человека желудочка. Миоциты человека желудочковая могут быть использованы для электрофизиологических исследований и тестирования на наркотики.

Аннотация

Кардиомиоциты от больных сердец подвергаются сложных ремоделирования процессов, связанных с изменениями в структуре клеток, сокращение возбуждения муфты и мембраны ионных токов. Эти изменения, вероятно, будут ответственны за увеличение аритмогенного риска и сократительных изменений, ведущих к систолического и диастолического дисфункции у кардиологических больных. Тем не менее, большая часть информации об изменениях функции миоцитов при кардиологических заболеваниях пришел из животных моделей.

Здесь мы опишем и проверить протокол для изоляции жизнеспособных миоцитов от небольших хирургических образцах миокарда желудочков у пациентов, перенесших операции на сердце операции. Протокол описан подробно. Электрофизиологические и внутриклеточных измерений кальция, как сообщается, продемонстрировать возможность ряда измерений одиночных клеток в кардиомиоциты желудочков человека, полученных с помощью этого метода.

Протокол сообщил онповторно может быть полезно для будущих исследований в области клеточной и молекулярной основе функциональных изменений человеческого сердца в присутствии различных сердечных заболеваний. Кроме того, этот метод может быть использован для идентификации новых терапевтических целей на клеточном уровне и для проверки эффективности новых соединений на кардиомиоцитов человека, с прямым поступательного стоимости.

Введение

Рассечение электрофизиологических свойств миокарда прогрессировала заметно после разработки методов для одной изоляции сердечной миоцитов. Последние достижения в понимании сердечной возбуждения сжимающих Муфта (ИС-связь) также стало возможным благодаря способности изоляции жизнеспособных одиночных кардиомиоцитов, которые сохраняют все физиологические свойства неповрежденной ткани. Регулярно используются методы патч зажим для изучения функции и фармакологической модуляции сердечного сарколемных ионных токов. Записи динамики внутриклеточного кальция с Са ^{2 +} чувствительных красителей также регулярно выступал на отдельных кардиомиоцитов из различных здоровых и больных моделей, предоставляя жизненно важные данные о физиологии EC-муфтой, а также на патологических изменений внутриклеточного Ca ^{2 +} гомеостаз приводит к механической обесценение и повышенной аритмогенного бремени при кардиологических заболеваниях. InformaТион из этих исследований имеет решающее значение для понимания электрофизиологические и механические эффекты препаратов в клинических условиях. Однако есть виды характерные отличия в трансмембранных токов и в белках EC-Голова, на которые приходится особенностей потенциала сердечной действий и сердечных механики. Таким образом, в то время как исследования миоцитов изолированных от не человека млекопитающих выяснена биофизические свойства и физиологические роли конкретных трансмембранных ионных каналов и EC-Голова белков, они не обязательно предоставлять соответствующие модели кардиомиоцитов человека. Выделение жизнеспособных миоцитов из миокарда человека Поэтому крайне важно, чтобы в полной мере понять патофизиологии заболеваний сердца и утвердить новые терапевтические подходы.

Человеком предсердий ткань легко доступна как ушек предсердий часто отбрасывается во время хирургических процедур. Первоначальные количественные исследования взрослого человека потенциалов сердца действий и ионной у.е.rrents занятых ферментативно изолированный: мерцательная ячеек ^1-4. Записи потенциалов действия или токов от отдельных взрослых желудочковой клеток человека были впоследствии сообщил ^3,5-10. Большинство из этих исследований использовали клетки, полученные из эксплантированных сердца и используемые либо коллагеназы перфузии сегмента коронарной артерии или воздействием относительно большого количества вырезанной ткани коллагеназы, чтобы получить изолированных клеток. Эти исследования позволили подробную характеристику ряда трансмембранных ионных токов от желудочковой кардиомиоцитов человека от здоровых сердец и от пациентов с терминальной сердечной недостаточности. Записи L-типа Са ^{2 +} ток (Я _Ca-L) ^5-7, переходный ток наружу калия (я _к) ^8, внутрь выпрямителя тока калия (Я _κ1) ^8, различные компоненты замедленного выпрямителя тока калия (Я _κ ) ⁹ поступало. Авансы и переработкапроцедура изоляции ^10, позволило четко охарактеризовать ионной основе возросшей аритмогенного потенциала в терминальной сердечной недостаточности, содержащей потенциала действия продление ^11, задержка после деполяризаций ¹² и увеличился смешное текущий ¹³ приводит к диастолической деполяризации и экстрасистол.

Взрослые кардиомиоцитов, как правило, изолированы от мелких животных по ретроградной перфузии всем сердцем с различными смесей ферментов, техника, которая производит высокие урожаи Ca ^{2 +-толерантных} клеток ^14. Выделение кардиомиоцитов из фрагментов ткани по своей сути менее успешным, вероятно, из-за ограниченного доступа ферментов в отдельных миоцитов по сравнению с, что достигается за счет перфузии коронарных артерий. Из-за очень ограниченного наличия неиспользованных доноров сердца, единственный практический способ получить нормальные человеческие желудочков клетки на регулярной основе является путем ферментативного digestioн из часто очень небольших фрагментов ткани, вырезанных во время плановых хирургических процедур. Единственная модель болезни человека, который был тщательно характеризуется на клеточном уровне является терминал сердечная недостаточность, из-за доступности пересаженных сердец. Тем не менее, терминал сердечная недостаточность возникает в меньшинстве пациентов и часто включает в себя общий путь тяжелой ремоделирования клеток миокарда, которая является относительно независимым от основной причины ^15. Возможность оценить функцию отдельных кардиомиоцитов из пациентов на более ранней, не сбой стадии заболевания важно понять конкретную патофизиологии различных наследственных или приобретенных условиях. Гипертрофическая кардиомиопатия (HCM) является показательным примером. НСМ является общим (1/500 человек) по наследству сердечной состояние, характеризующееся гипертрофии сердца, повышенное аритмогенных риска и сократительные изменений вследствие обструкции выходного тракта и диастолической дисфункции ^16. Кардиомиоцитов из HCM сердцах уndergo достаточно сложные ремоделирования процессы с участием изменения в структуре клеток (гипертрофия, миофибриллярный беспорядок) и EC-муфта ^17. Тем не менее, большая часть информации из миоцитов дисфункции у HCM пришел из трансгенных животных моделях. Поскольку только меньшинство пациентов HCM развивается в сторону терминальной сердечной недостаточности и требует трансплантации сердца, HCM сердца очень редко доступны для выделения клеток со стандартными методами. Тем не менее, по крайней мере, 30% пациентов HCM развивать симптомы обструкции из-за массивного притока крови гипертрофия перегородки изменяющие выносящего тракта во время систолы (HCM) ^18. Наиболее эффективным доступны терапевтический вариант для облегчения обструкции в HCM является хирургическое перегородки myectomy: во время этой хирургической процедуры, переменная размера часть верхней перегородки удаляют транс аорты подхода. Эта часть гипертрофированной перегородки Поэтому для выделения клеток из свежей ткани.

Способ выделения человеческого ventriculaг миоциты с одного, малых трансвенозной эндомиокардиальной биопсии был ранее разработан и опубликован ^19. Мы реализовали метод, чтобы изолировать одиночные септальные миоциты из образцов миокарда желудочков у пациентов, перенесших операцию на сердце, в том числе пациентов с HCM, проходящих перегородки myectomy и пациентов, перенесших процедуры замены клапана. В дополнение к подробным описанием протокола изоляции, представитель электрофизиологических и Са ^{2 +} флуоресценции измерения представлены, демонстрируя жизнеспособность изолированных желудочковых миоцитов человека и возможности патч зажима и внутриклеточных Са ^{2 +} исследований.

протокол

Экспериментальные протоколы о человеческой ткани были одобрены этическим комитетом Кареджи University-больницы (2006/0024713; обновляется мая 2009 года). Каждый пациент дали письменное информированное согласие.

1. Решения и Подготовка оборудования

Решения, описаны в таблице 1. Упрощенная схема последовательности операций процедуры выделения ячейка найдена на рисунке 1.

Решение		СР	DB	КБ	ТБ	PS	EB1	EB2
Реагент (мМ)	KH 2 PO 4	50
	MgSO 4	8	1.2	5			1.2	1.2
	HEPES	10			10	10
	аденозин	5
	глюкоза	140	10	20	10		10	10
	маннитол	100
	таурин	10	20	5			20	20
	NaCl		113		136		113	113
	KCl		4.7	85	5.4	25	4.7	4.7
	MgCl 2				1.2	5
	KH 2 PO 4		0,6	30			0,6	0,6
	Na 2 HPO 4		0,6				0,6	0,6
	NaHCO 3		12				12	12
	КНСО3		10				10	10
	Na-пируват		4				4	4
	BDM		10				10	10
	BHBA			5
	янтарная кислота			5
	ЭГТА			0.5
	К 2-АТФ			2
	пировиноградная кислота			5
	креатин			5
	KMES					115
Ферменты (U / мл)	Коллагеназы типа V						250	250
	Протеазы Тип XXIV						4
рН		7.4 КОН	7.3 NaOH	7.1 КОН	7.35 NaOH	7.2 КОН	7.3 NaOH	7.3 NaOH

Таблица 1. Решения, используемые для сбора образцов мокроты, выделения клеток и функциональной характеристике миоцитов CP = кардиоплегический решения.; DB = диссоциации буфера; КБ = решение Крафт-Bruhe; ТБ = Тироде буфера; PS = пипетки решение; EB1 = фермент буфер 1; EB2 = фермент буфер 2.

1. Подготовка кардиоплегический (СР) решение. CP раствор можно хранить при температуре 4 ° С в течение до 1 недели.
2. Подготовка Ca ^{2 +-бесплатно} диссоциации буфера (DB). Это решение следует использовать в течение дня.
3. Подготовка Крафт-Bruhe (КБ) решение. Решение КБ можно хранить при температуре 4 ° С в течение 1 пик.
4. Подготовка Ca ^{2 +-свободный} буфер Тироде (ТБ). Это решение следует использовать в течение дня.
5. Фильтр все решения с использованием шприцев фильтры перед использованием.
6. Подготовьте пищеварения устройство (рис. 2), очищая контейнер из двух лицевых щеток силиконового эластомера, одна из которых вращают на электродвигатель. Переваривание устройство на заказ. Подробности на пищеварение прибора находятся в рисунке 8; образы прибора находятся в рисунках 2 C и 2D. Вымойте тканей камеру с 70% этанола и воды.

2. Сбор и обработка инфаркт образцов

1. Налейте 40 мл cardiplegic (СР) растворе в 50 мл трубки и хранить его в лед для образца транспортировки от оперативного комнаты в лаборатории изоляторе.
2. Соберите желудочка миокарда образец из оперативной комнате сразу после удаления, промойте его ледянойРешение СР и хранить его в трубке. Использование эндокарда образцы вырезают из верхнего межжелудочковой перегородки в течение операции на открытом сердце, взвешивание> 100 мг.
3. Быстро передавайте образца в область лаборатории; начать обработку образца в течение 10 мин от образца удаления.
4. Сохраняя образца в ледяной CP буфера, аккуратно снимите эндокарда фиброзной слой с помощью тонких ножниц под стереомикроскопом; после этого, отрезать ткань миокарда на мелкие кусочки (длиной 2-3 мм). В зависимости от размера выборки ткани, вырезать на общую сумму миокарда желудочков между 100 мг и 1 г для каждого изоляции.
5. После завершения ткани измельчения, перенести инфаркты куски в пищеварения устройства, с чистым льдом холодный раствор CP. Не заполняйте весь объем между двумя кремниевыми щеток (3-4 мл) с инфарктом куски, используя не более 1 г общей ткани.

3. Стиральная и Переваривание инфаркта Куски

1. Кормовойэ куски передаются в выскабливание палаты пищеварения устройства измените буфер CP в камере с холодным Ca ^{2 +} свободного буфера диссоциации (БД).
2. Поместите пищеварения устройство в термостатической ванне, для того камеру, чтобы быть в контакте с нагретой воды в ванне (рис. 1). Установка ванны до 37,5 ° С и включить его, с тем чтобы медленно повышения температуры тканей камеры. Включите мотора пищеварения устройства, установка скорости вращения на 1 оборот / секунду.
3. Выполните 3 цикла стирки с БД, изменяя решение в камере с чистой БД каждые 8 ​​мин. DB нагревают (37 ° C) и насыщенным кислородом, прежде чем в контакте с инфарктом куски.
4. Подготовка фермента буфера 1 (EB1) добавлением 250 ед / мл коллагеназы типа V и 4 ед / мл протеазы типа XXIV в растворе DB. Подготовка фермента буфер 2 (Eb2) добавлением 250 ед / мл коллагеназы типа V к решению DB. Разминка (37 ° C) и oxygenatэ EB1 и EB2.
5. Выполнение двух циклов 12 мин пищеварения во вращающейся пищеварения устройства со 100% кислородом EB1 (при 37 ° С). В каждом цикле, используйте ~ 3 мл EB1. Снимите решение, пипетки стремления и выбросьте его после каждого цикла.
6. Подготовка 6 15 мл пробирки для сбора клеток и ~ 80 мл холодного (4 ° C) KB раствора для элюирования буферы.
7. Выполните первые 15 мин пищеварения цикл с 3 мл 100% кислородом EB2 при 37 ° С После цикла варки, собирают раствор, содержащий первую разложенных миоцитов в 15 мл пробирку и разбавленной клеточной суспензии с 12 мл холодного раствора KB. Храните трубы квартиру при комнатной температуре.
8. Развести оставшийся раствор Eb2 с равным количеством БД, с тем чтобы сократить вдвое концентрацию коллагеназы V для следующих циклов пищеварение.
9. Выполнение других циклов 5 12 мин гидролиза с 3 мл EB2 при 37 ° С; после каждого из них собирают из миоцитов, содержащей буфер, в 15 мл коническую пробирку иразбавить его с 12 мл раствора KB. Храните 6 ячеек, содержащий трубки при комнатной температуре в течение 30 мин.

4. Ресуспендирование сотовый и Са ^{2 +} реадаптации

1. Добавить 1 мг / мл бычьего сывороточного альбумина (BSA) в 20 мл Ca ^{2 +-буфере} Тирода (TB). Фильтр решение.
2. Центрифуга шесть миоцитов содержащие конические пробирки при 100 мкг в течение 5 мин, чтобы заставить миоцитов по урегулированию. Удалить супернатант и ресуспендирования клеток в каждую пробирку с переменным количеством (1-3 мл, в зависимости от выход) BSA, содержащем ТБ при комнатной температуре.
3. Постепенно увеличивайте концентрации Са ^{2 +} в клеточной содержащий буфер путем добавления небольших аликвот 100 ммоль / л CaCl ₂ решения. В первом и втором этапах Ca ^{2 +} концентрация повышается до 50 мкмоль / л и 100 мкмоль / л, соответственно. Следующие Ca ^{2 +-аддитивные} этапы выполняются каждые 5 мин и концентрации увеличивается на 100 мкмоль / л на каждом шаге тО.А. конечная концентрация 0,9 ммоль / л
4. Оценка урожайности процедуры выделения. Передача 0,5 мл раствора, содержащего миоцитов на стеклянную нижнюю камеру микроскопа. Оценка 15 микроскопа поля на 10-кратным увеличением и объективной вычислить процент здоровых миоцитов (например, стержневые клетки с четкими страт и без значительных включений, рисунок 2). Ожидаемая доходность составляет около 20%.

5. Функциональная оценка изолированном кардиомиоцитов.

Следующий протокол является примером человека кардиомиоцитов функциональной оценки, включая одновременной регистрации потенциалов действия и внутриклеточных Са ^{2 +} потоков.

1. Подготовка пипетки решение (PS) для патч зажим экспериментов в перфорированной конфигурации патч. Раствор можно хранить при температуре -20 ° С в течение до 3 месяцев.
2. Добавить 1,8 ммоль / л CaCl ₂ к Са ^{2 +} без буферной Тироде (ТБ). Uсебе это решение для суперфузии кардиомиоцитов во время патч зажим / флуоресценции экспериментов.
3. Передача 1 мл клеточной суспензии в 1,5 мл трубки и добавить 10 мкмоль / л Fluoforte и 10 мкл энергосети концентрат. Инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре. После этого, установите трубку в вертикальном положении и оставить клетку урегулировать в течение 5 мин; ресуспендирования клеток в Ca ^{2 +,} содержащий ТБ.
4. Передача 0,25 мл суспензии клеток к небольшой (0,5 мл), с контролем температуры микроскоп смонтированы записи камеру, орошали под действием силы тяжести с нагретой системы microperfusor при скорости потока 0,3 мл / мин (температура: 37 ± 0,5 ° С).
5. Использование микропипетки съемник, подготовить патч зажим пипетки с диаметром кончика 3 до 5 мкм и сопротивления от 3 до 4,5 М при наполненной PS.
6. Добавить амфотерицин В в пакет ПС (250 мкг / мл) и использовать его для заполнения электрода.
7. Выберите стержневых ячейку с четкими страт, лишенный включений, FOгт печать гига и ждать от 5 до 10 мин, пока сопротивление доступа не ниже 20 МОм.
8. Выявите потенциалов действия в текущем режиме зажим с помощью коротких импульсов (<3 мсек) при различных частотах стимуляции (0,2 Гц, 0,5 Гц и 1 Гц, 1 мин на каждой частоте). Во время фазы записи, включите ярком освещении поля на 492 ± 3 нм и обнаружения флуоресценции Fluoforte на 505-520 нм. Приобретать флуоресценции и мембранный потенциал сигналов с использованием DIGIDATA 1440A и pClamp 10,0 программного обеспечения. Повторите последовательность записи нескольких раз, если это необходимо; однако, иметь общее время записи ниже 15 мин для каждой ячейки.

Результаты

Описанный выше способ был использован для характеристики функциональных нарушений кардиомиоцитов, выделенных из межжелудочковой перегородки пациентов с гипертрофической кардиомиопатией (НСМ), перенесших операции myectomy, по сравнению с не являющихся В противном случае гипертрофическ...

Обсуждение

Мы описали и утверждена метод, чтобы изолировать жизнеспособные миоциты от хирургических образцах миокарда человека желудочка. Начиная с описанными ранее протоколов, которые были успешно использованы для изолированных клеток от предсердий хирургических образцов, техники, чтобы поз?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791
Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4*7H2O)	Sigma-Aldrich	M1880
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Adenosine	Sigma-Aldrich	A9251
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	P5958
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S7907
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6297
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Sigma-Aldrich	237205
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	B0753
Sodium hydroxide(NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045
L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate	Sigma-Aldrich	49601
Pyruvic acid	Sigma-Aldrich	107360
3-Hydroxybutyric acid	Sigma-Aldrich	166898
Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP)	Sigma-Aldrich	A8937
Creatine	Sigma-Aldrich	C0780
Succinic Acid	Sigma-Aldrich	S3674
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E0396
Albumin from bovine serum	Sigma-Aldrich	A0281
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V	Sigma-Aldrich	C9263
Proteinase, Bacterial, Type XXIV	Sigma-Aldrich	P8038
Calcium chloride solution, ~1 M in H2O	Sigma-Aldrich	21115
Calcium chloride 0.1 M solution	Sigma-Aldrich	53704
Potassium methanesulfonate	Sigma-Aldrich	83000
FluoForte Reagent	Enzo Life Sciences	ENZ-52015
Powerload concentrate, 100X	Life Technologies	P10020
Perfusion Fast-Step System	Warner Instruments	VC-77SP
Amphotericin B solubilized	Sigma-Aldrich	A9528
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier	Molecular Devices
Digidata 1440A	Molecular Devices
pClamp10.0	Molecular Devices
Digestion Device	CUSTOM	CUSTOM	The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Figure 1C-1D and in Figure7. We can provide further details if requested.
Silicone elastomer for the digestion device's brushes	Dow Corning	SYLGARD® 184
Variable speed rotating motor for the digestion device	Crouzet	Crouzet 178-4765
Mold for brushes casting	N.A.	N.A.	The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods.