Taze Cerrahi Örneklerden İzolasyon ve İnsan Ventriküler kardiyomiyositlerin Fonksiyonel Karakterizasyonu

Özet

Kalp hastalıklarının hücre temelinde Mevcut bilgi çok hayvan modelleri üzerinde yapılan çalışmalara dayanmaktadır. Burada açıklamak ve insan ventrikülün küçük cerrahi örneklerinden tek bir canlı kardiyomiyositlerin elde etmek için yeni bir yöntem doğrulamak. İnsan ventriküler miyositler elektrofizyolojik çalışmalar ve uyuşturucu testi için kullanılabilir.

Özet

Hastalıklı kalplerinden Kardiyomiyositler hücre yapısındaki değişiklikler, eksitasyon kasılma kaplin ve membran iyon akımları içeren karmaşık yeniden işlemlere tabi tutulur. Bu değişiklikler, artmış aritmojenik riski ve kalp hastalarında sistolik ve diyastolik fonksiyon bozukluğu yol açan büzülme değişikliklerden sorumlu olması muhtemeldir. Bununla birlikte, kalp hastalıklarında miyosit fonksiyonu değişiklikler üzerinde en çok bilgi hayvan modellerinde geldi.

Burada tarif ve kardiyak cerrahi operasyon geçiren hastaların ventriküler miyokardın küçük cerrahi örneklerinden canlı miyositleri izole etmek için bir protokol doğrulamak. Protokol detaylı olarak tarif edilmektedir. Elektrofizyolojik ve hücre içi kalsiyum ölçümleri, bu yöntem ile elde edilen insan ventriküler kardiyomiyositlerde tek hücre ölçümler bir dizi uygulanabilirliğini göstermek için rapor edilmiştir.

Protokol he bildirdiYeniden farklı kalp hastalıklarının mevcudiyetinde insan kalbinin fonksiyonel değişiklikler hücresel ve moleküler temelinin gelecek çalışmalar için yararlı olabilir. Bundan başka, bu yöntem, hücresel seviyede yeni terapötik hedeflerini tanımlamak için ve doğrudan translasyonel değeri, insan kardiyomiyositler yeni bileşiklerin etkinliğini test etmek için de kullanılabilir.

Giriş

Miyokardın elektrofizyolojik özelliklerinin diseksiyonu tek kardiyak miyosit izolasyon tekniklerinin geliştirilmesi sonra belirgin ilerlemiştir. Kardiyak Uyarma Daralma Kavrama (EC-Kavrama) anlayışı son gelişmeler de sağlam doku tüm fizyolojik özelliklerini muhafaza uygulanabilir tek kardiyomiyositlerin izole yeteneği ile mümkün olmuştur. Yama kelepçe yöntemleri rutin kardiyak sarkolemmal iyon akımlarının fonksiyonu ve farmakolojik modülasyon çalışma istihdam edilmektedir. Ca ^{2 +} duyarlı boyalar ile hücre içi kalsiyum dinamikleri kayıtları da düzenli EC-Kuplajın fizyolojisi yanı sıra hücre içi Ca ^{2 +} patolojik değişiklikler ile ilgili önemli veriler sağlayan, sağlıklı ve hastalıklı modeller çeşitli tek miyositlerindeki yapılmaktadır mekanik düşüklüğü ve kalp hastalıklarında artış aritmojen yüküne yol açan homeostasis. InformaBu çalışmalardan elde edilen tion klinik ortamda ilaçların elektrofizyolojik ve mekanik etkilerini anlamak için çok önemlidir. Ancak, zar-ötesi akımları ve kardiyak ve kardiyak hareket potansiyeli mekaniği belirli özellikler için hesap, AT-Coupling proteinlerde türe özel farklılıklar vardır. Insan olmayan memelilerden izole miyosit çalışmalar biyofiziksel özellikleri ve özel zar iyon kanalları ve EM-Coupling proteinlerinin fizyolojik rolleri durulaştırmamızdan Böylece, bu durum, insan kardiyak miyosit uygun modeller sağlamaz. İnsan miyokardiyumundan canlı miyositlerin izolasyonu tam kalp hastalıklarının patofizyolojisi anlamak ve yeni tedavi yaklaşımları doğrulamak için elzemdir.

Atriyal uzantıları genellikle cerrahi işlemler sırasında atılır gibi insan atriyal doku kolayca kullanılabilir. Yetişkin insan kalp aksiyon potansiyelleri ve iyonik cu ilk nicel çalışmalarrrents enzimatik olarak izole edilmiş atrial hücreler ^1-4 kullanılabilir. Aksiyon potansiyelleri veya izole yetişkin insan ventriküler hücrelerinden akımların kayıtları sonradan ^3,5-10 bildirilmiştir. Bu çalışmaların çoğu nakledilmiş kalplerinden edilen ve izole edilmiş hücreleri elde etmek için kolajenaz için koroner arter bölümü ya da kesilen doku nispeten büyük miktarlarda maruz kolajenaz perfüzyon ya da kullanılan hücreleri kullandık. Bu çalışmalar, sağlıklı kalpleri insan ventriküler kardiyomiyositlerinde gelen ve terminal kalp yetmezliği olan hastaların transmembran iyon akımların bir dizi ayrıntılı bir karakterizasyonu izin verdi. L-tipi Kayıtlar Ca ^{2 +} akımı (I ^{_Ca-L), 5-7,} geçici dışa potasyum akımı (I _için) ^8, potasyum rektifayer akım içeri doğru (I _κ1) ^8, geciktirilmiş düzeltici potasyum akımının farklı bileşenlerinin (I _κ ) ⁹ bildirilmiştir. Avanslar ve rafine birizolasyon prosedürü ^10, aksiyon potansiyeli uzamasını ¹¹ içeren terminali, kalp yetmezliği, artan aritmojen potansiyelinin iyonik temeli net bir karakterizasyonu izin depolarizasyonlarından ¹² sonra gecikmeli ve diyastolik depolarizasyon ve erken atım giden komik geçerli ¹³ arttı.

Yetişkin kardiyak miyositler, normalde çeşitli enzim karışımları ile bütün kalp, Ca ^{2 +-hücrelerinin} toleranslı ¹⁴ arasında yüksek verimler üreten bir tekniğin retrograd perfüzyon göre küçük hayvanlardan izole edilir. Doku fragmanlarından kardiyak miyosit izolasyonu muhtemelen koroner arter perfüzyon ile elde edilene kıyasla tek miyositlerine enzimlerin sınırlı erişim doğal olarak daha az başarılı olmuştur. Çünkü kullanılmayan donör kalplerinin çok sınırlı durumu, düzenli olarak normal insan ventriküler hücreleri elde etmek tek pratik yolu enzimatik digestio tarafındanelektif cerrahi işlemler sırasında kesilip genellikle çok küçük doku parçalarının n. Iyice hücre düzeyinde karakterize edilmiştir sadece insan hastalık modeli nakledilen kalpleri erişilebilirlik nedeniyle terminali kalp yetmezliğidir. Ancak, Terminal kalp yetmezliği hastalarının bir kısmında görülür ve genellikle altta yatan neden ¹⁵ nispeten bağımsız olan miyokard hücrelerinin ciddi yeniden, ortak bir yol içerir. Hastalığın erken bir sigara başarısız aşamada hastaların tek kardiyomiyositlerin fonksiyonunu değerlendirmek için yetenek, farklı kalıtsal veya edinsel koşulların belirli patofizyolojisini anlamak için çok önemlidir. Hipertrofik kardiyomiyopati (HKM) söylüyorum örnektir. HKM, ortak bir (1/500 kişi) kardiyak hipertrofisi ile karakterize kalıtsal kardiyak durum nedeniyle çıkış yolu tıkanıklığı ve diyastolik disfonksiyon ¹⁶ aritmojen risk ve kasılma değişiklikler artar. HKM kalplerinden Kardiyomiyositler uHücre yapısındaki değişiklikler (hipertrofisi, miyofibriler kargaşa) ve EC-Kuplajını ¹⁷ içeren karmaşık bir yeniden süreçleri ndergo. Ancak, HKM'de miyositlerdeki disfonksiyon en çok bilgi transgenik hayvan modellerinde geldi. HKM hastaların sadece bir azınlık terminali kalp yetmezliği doğru geliştikçe ve kalp nakli gerektirdiğinden, HKM kalpleri standart yöntemlerle hücre izolasyonu için çok nadiren mevcuttur. Ancak, HKM hastaların en az% 30 sistolik (HKM) ¹⁸ sırasında masif septal hipertrofi değiştiren çıkış yolu kan akışı nedeniyle obstrüktif belirtiler gelişir. HKM'de tıkanıklığın giderilmesi için en etkili tedavi seçeneği mevcut cerrahi septal miyektomi: Bu cerrahi işlem sırasında, üst septum değişken ölçekli bölümü trans aort yaklaşımla kaldırılır. Hipertrofik septum bu bölümü taze dokudan izole edilmesi için, bu nedenle hücre kullanılabilir.

İnsan ventricula izolasyonu için bir yöntem,r tek, küçük transvenöz endomiyokardiyal biyopsi ile miyositler önce geliştirilen ve ¹⁹ yayımlanmıştır. Biz septal miyektomi ve kapak replasmanı işlemleri uygulanan hastalarda uygulanan HKM hastalar dahil olmak üzere kalp ameliyatı geçiren hastaların ventrikül myokard örneklerinden tek septal miyositleri izole etmek için bir yöntem uyguladı. Izolasyon protokol, temsili elektrofizyolojik ve Ca ^{2 +} floresan ayrıntılı bir açıklama ilaveten ölçümler izole edilmiş beşeri ventriküler miyositlerde yaşayabilirliği ve yama kelepçe ve hücre içi ^{Ca2 +} çalışmalar fizibilitesini gösteren sunulmaktadır.

Protokol

Insan dokusu üzerinde deneysel protokoller Careggi Üniversitesi Hastanesinde (; 2009 yenilendi Mayıs 2006/0024713) etik komitesi tarafından onaylandı. Her hasta yazılı bilgilendirilmiş onam verdi.

1.. Çözümleri ve Ekipmanları Hazırlık

Çözümler, Tablo 1 'de tarif edilmiştir. Hücre izolasyon prosedürü basitleştirilmiş bir akış şeması Şekil 1' de bulunur.

Çözüm		CP	DB	KB	TB	PS	EB1	EB2
Reaktif (mM)	KH 2 PO 4	50
	MgSO 4	8	1.2	5			1.2	1.2
	Hepes	10			10	10
	adenozin	5
	glikoz	140	10	20	10		10	10
	mannitol	100
	boğa	10	20	5			20	20
	NaCl		113		136		113	113
	KCl		4.7	85	5.4	25	4.7	4.7
	MgCI2				1.2	5
	KH 2 PO 4		0.6	30			0.6	0.6
	Na 2 HPO 4		0.6				0.6	0.6
	NaHCO 3		12				12	12
	KHCO 3		10				10	10
	Na-piruvat		4				4	4
	BDM		10				10	10
	BHBA			5
	süksinik asit			5
	EGTA			0.5
	K 2-ATP			2
	piruvik asit			5
	kreatin			5
	KMES					115
Enzimler (U / ml)	Kolajenaz Tip V						250	250
	Proteaz tipi XXIV						4
pH		7.4 KOH	7.3 NaOH	7.1 KOH	7.35 NaOH	7.2 KOH	7.3 NaOH	7.3 NaOH

.. Tablo 1 örnek toplama, hücre izolasyonu ve miyositlerin fonksiyonel karakterizasyonu CP = kardioplejik çözümü için kullanılan solüsyonlar; DB = ayrışma tamponu; KB = Kraft-Brühe çözümü; TB = Tyrode tamponu; PS = pipet çözüm; EB1 = enzim tamponu 1; EB2 = enzim tamponu 2.

1. Kardioplejik (CP) çözeltisi hazırlayın. CP çözelti kadar 1 hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
2. Ca ^{2 +} ücretsiz ayrışma tamponu (DB) hazırlayın. Bu çözelti bir gün içinde kullanılmalıdır.
3. Kraft-Brühe (KB) çözeltisi hazırlayın. KB çözelti kadar 1 çiş boyunca 4 ° C'de saklanabilirk.
4. Ca ^{2 +} ücretsiz Tirod tampon (TB) hazırlayın. Bu çözelti bir gün içinde kullanılmalıdır.
5. Kullanmadan önce şırınga filtreleri kullanarak tüm çözümleri filtre.
6. Sindirim cihazı (Şekil 2), bir elektrik motoru ile döndürüldüğünde biri silikon elastomer birbirine bakan iki fırçalar, yapılmış bir kazıma kap hazırlayın. Sindirim Cihaz özel yapılır. Sindirim aygıtında ayrıntıları Şekil 8 vardır; Cihazın görüntüleri, Şekil 2 ve 2B C içindedir. % 70 etanol ve su ile doku odası yıkayın.

Miyokard Örneklerinin 2.. Toplama ve İşleme

1. 50 ml'lik bir tüp içinde cardiplegic (CP) çözeltisi 40 ml dökün ve hücre izolasyon laboratuara ameliyat oda numune taşıma için buz içinde depolar.
2. Buz ile yıkayın, hemen çıkarıldıktan sonra ameliyat odasından ventriküler miyokard örnek toplamakCP çözeltisi ve bu tüp içinde saklayın. Açık kalp ameliyatı sırasında üst arası ventriküler septum, ağırlık> 100 mg kesilip endokardiyal örnekleri kullanın.
3. Hızla laboratuar alanına numune aktarmak; Numune eksizyondan 10 dakika içinde numune işleme başlar.
4. Buz gibi soğuk CP tamponu örnek tutarken, dikkatli bir stereo mikroskop altında ince bir makas kullanarak endokardiyal fibrotik tabakayı kaldırmak; sonra, küçük parçalara (uzun 2-3 mm) miyokard doku kesti. Doku numunesi büyüklüğüne bağlı olarak, her bir izolasyon için 100 mg ila 1 g arasında ventriküler miyokardın toplam miktarı kesti.
5. Doku kıyma haline gelme işleminin tamamlanması üzerine, buz gibi soğuk temiz CP çözeltisi ile, sindirim cihazı içine miyokard parçalar aktarın. Artık toplam doku g 1'den kullanarak, miyokard parçaları ile iki silikon fırça arasındaki tüm hacmi (3-4 ml) doldurmaktan kaçının.

3.. Yıkama ve Miyokard topakları Sindirim

1. Kıçtaparçalar sindirim cihazın kazıma odasına transfer edilir, er, soğuk ^{Ca2 +} içermeyen ayrışma tamponu (DB) ile oda içindeki CP tampon değiştirin.
2. Banyosu içinde ısıtılmış, su (Şekil 1) ile temas halinde olması için bölme için sırayla, termostatik banyoda sindirim yerleştiriniz. 37.5 ° C banyo ayarlayın ve yavaş yavaş doku odasının sıcaklığını yükseltmek için, açın. 1 devir / saniye dönme hızını ayarlayarak, sindirim cihazının motora çevirin.
3. Her 8 dakika temiz DB ile oda içindeki solüsyonu değişen, DB ile 3 yıkama çevrimi gerçekleştirin. DB (37 ° C) ısıtılır ve oksijen miyokard parçalar ile temas etmeden önce doymuş.
4. DB çözeltisine kollajenaz Tip V ve 4 U / ml Proteaz tipi XXIV 250 U / ml eklenerek enzim tamponu 1 (EB1) hazırlayın. DB çözüm 250 U / ml kollajenaz Tip V ekleyerek enzim tamponu 2 (EB2) hazırlayın. (37 ° C) ve oxygenat ısınmake EB1 ve EB2.
5. (37 ° C)% 100 oksijenli EB1 ile dönen sindirim cihazda sindirim iki 12 dakika döngüleri yapın. Her bir döngüde, bir EB1 ~ 3 ml kullanın. Pipet aspirasyonu ile çözüm çıkarın ve her döngüden sonra atın.
6. Hücresi ile toplama ve ~ tamponlar elüsyon için soğuk (4 ° C) KB çözeltisi 80 ml için 6 15 ml tüpler hazırlayın.
7. 37 ° C de 3 ml% 100 oksijene EB2 ile bir birinci 15 dakika sindirim çevrimi gerçekleştirme Sindirim devresini sonra, 15 ml bir tüp içinde birinci ayrışmış miyositleri içeren çözelti toplamak ve 12 ml soğuk KB çözeltisi ile hücre süspansiyonu seyreltin. Oda sıcaklığında tüp düz saklayın.
8. Aşağıdaki sindirim devir için V kolajenaz konsantrasyonunun yarıya amacıyla DB eşit bir miktarı ile geri kalan EB2 çözeltisi ile seyreltilir.
9. 37 ° C de 3 ml EB2 diğer 5 12 dakika sindirim döngüleri yapın; bunların her biri ardından 15 ml konik bir tüp içinde tampon içeren miyosit ve toplamak ve12 ml KB çözeltisi ile seyreltilir. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında, 6 hücre ihtiva eden tüpler saklayın.

4. Hücre tabanda ve Ca ^{2 +} READAPTAYON

1. 20 ml Ca ^{2 +} içermeyen Tyrode tamponu (TB) ve 1 mg / ml sığır serum albümini (BSA) ilave edin. Çözüm Filtre.
2. Yerleşmek için miyositleri zorlamak için 5 dakika boyunca 100 x g'de altı miyosit içeren konik santrifüj tüpleri. Süpernatantı ve oda sıcaklığında TB içeren BSA (verim bağlı olarak 1-3 mi) değişken bir miktarı ile, her bir tüp içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
3. Yavaş yavaş 100 mmol / L _CaCI2 çözeltisi, az miktar eklenerek hücre ihtiva eden tampon içinde ^{Ca2 +} konsantrasyonu artar. Birinci ve ikinci adım olarak ^{Ca2 +} konsantrasyonu sırasıyla 50 umol / L ve 100 umol / L 'ye kadar yükseltilir. Aşağıdaki Ca ^{2 +} ekleme adımlarını her 5 dakikada gerçekleştirilir ve konsantrasyon her adım t 100 umol / L ile yükseltilir0.9 mmol / L OA nihai konsantrasyonu
4. Izolasyon prosedürü verimini değerlendirmek. Mikroskop cam alt bölmesi üzerine miyosit ihtiva eden bir çözeltinin 0.5 ml aktarın. 10x objektif büyütmede 15 mikroskop alanları değerlendirmek ve (net izlerse ve anlamlı içerikleri ile, örneğin çubuk biçimli hücreler, Şekil 2) sağlıklı miyositlerin yüzdesini hesaplamak. Beklenen verim% 20 civarındadır.

İzole kardiyomiyositlerinin 5. Fonksiyonel Değerlendirme.

Aşağıdaki protokol hareket potansiyellerine ve hücre içi ^{Ca2 +} akıları eş zamanlı kayıt dahil olmak üzere insan kardiyomiyosit fonksiyonel değerlendirmesi örneğidir.

1. Delikli yama yapılandırmada yama kelepçe deneyler için pipet çözüm (PS) hazırlayın. Çözelti, 3 aya kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
2. Ca ^{2 +} ücretsiz Tirod tampon (TB) 1.8 mmol / L CaCl ₂ ekleyin. Use patch clamp / floresan deneyleri sırasında kardiyomiyositlerin süperfüzyon için bu çözüm.
3. 1.5 ml tüp aktarın hücre süspansiyonu 1 ml ve 10 umol / L ve 10 ul Fluoforte Powerload Konsantre ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, dikey konumda boru seti ve 5 dakika için yerine getirilmesi için hücreyi terk; Ca hücreleri tekrar süspansiyon ^{2 +} TB içeren.
4. (: 37 ± 0.5 ° C sıcaklık), küçük bir (0.5 mi) hücre süspansiyonu, 0.25 ml transfer, sıcaklık kontrollü mikroskop 0.3 ml / dk 'lık bir akış hızında ısıtılmış microperfusor sistemi ile yer çekimi ile süperfüze kayıt odası, monte edilebilir.
5. Mikropipet çektirmenin kullanarak, 3-5 um'lik bir uç çapı ve PS ile dolu 3 M 4.5 arasında bir direnç ile yama kelepçe pipetler hazırlar.
6. PS (250 ug / ml) içinde bir toplu amfoterisin B ekleyin ve elektrotlar doldurmak için kullanın.
7. Kapanım yoksun açık desenli bir çubuk şeklinde hücreyi, fo seçinerişim direnci altında 20 MQ düşene kadar rm, 5 ile 10 dakika giga mühür ve bekleyin.
8. Stimülasyon farklı frekanslarda (0.2 Hz, 0.5 Hz, 1 Hz, her bir frekansta 1 dakika) kısa darbeleri (<3 msn) kullanılarak geçerli kelepçe modunda aksiyon potansiyelleri toplayın. Kayıt aşamasında, 492 ± 3 nm parlak alan aydınlatma açmak ve 505-520 nm Fluoforte floresan algılar. Floresan Edinme ve Digidata 1440A ve pClamp 10.0 yazılımını kullanarak potansiyel sinyalleri membran. Gerekirse kayıt dizisini birden çok kez tekrarlayın; Ancak, her hücre için 15 dakika aşağıda toplam kayıt süresini tutmak.

Sonuçlar

Olmayan başarısız olmayan hipertrofik cerrahi hastalarında ²¹ ile karşılaştırıldığında, yukarıda açıklanan yöntem, miyektomi operasyon yapıldı hipertrofik kardiyomiyopati (HKM) hastalarda interventriküler septum izole kardiyomiyositlerin fonksiyonel anormalliklerini karakterize etmek için kullanılmıştır. Bu bölümde yer alan sonuçlar, çalışma ²¹ elde edilir ve bu teknik kardiyak hastalık koşullarında miyokard hücresi işlevinin değişiklikler karakterize etmek içi...

Tartışmalar

Bu tarif edilen ve insan ventriküler miyokardın cerrahi örneklerden uygun miyositleri izole etmek için bir yöntem onaylamıştır. Başarılı bir şekilde hastalıklı ventriküler miyokardın ikinci bir uygun miyosit ayrılması geliştirilmiş ve ince ayarlı edildi izin vermek için atrial cerrahi örnekler, bu teknikle izole edilmiş hücrelere kullanılmıştır, daha önce tarif edilen protokollere başlayarak. Erken raporlar seçici, fizyolojik uyaran ^8,24 ile değiştirilmiş elektrofizyolojik ?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791
Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4*7H2O)	Sigma-Aldrich	M1880
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Adenosine	Sigma-Aldrich	A9251
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	P5958
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S7907
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6297
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Sigma-Aldrich	237205
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	B0753
Sodium hydroxide(NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045
L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate	Sigma-Aldrich	49601
Pyruvic acid	Sigma-Aldrich	107360
3-Hydroxybutyric acid	Sigma-Aldrich	166898
Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP)	Sigma-Aldrich	A8937
Creatine	Sigma-Aldrich	C0780
Succinic Acid	Sigma-Aldrich	S3674
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E0396
Albumin from bovine serum	Sigma-Aldrich	A0281
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V	Sigma-Aldrich	C9263
Proteinase, Bacterial, Type XXIV	Sigma-Aldrich	P8038
Calcium chloride solution, ~1 M in H2O	Sigma-Aldrich	21115
Calcium chloride 0.1 M solution	Sigma-Aldrich	53704
Potassium methanesulfonate	Sigma-Aldrich	83000
FluoForte Reagent	Enzo Life Sciences	ENZ-52015
Powerload concentrate, 100X	Life Technologies	P10020
Perfusion Fast-Step System	Warner Instruments	VC-77SP
Amphotericin B solubilized	Sigma-Aldrich	A9528
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier	Molecular Devices
Digidata 1440A	Molecular Devices
pClamp10.0	Molecular Devices
Digestion Device	CUSTOM	CUSTOM	The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Figure 1C-1D and in Figure7. We can provide further details if requested.
Silicone elastomer for the digestion device's brushes	Dow Corning	SYLGARD® 184
Variable speed rotating motor for the digestion device	Crouzet	Crouzet 178-4765
Mold for brushes casting	N.A.	N.A.	The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods.