Isolierung und funktionelle Charakterisierung der Menschen ventrikuläre Kardiomyozyten von Fresh Chirurgische Proben

Zusammenfassung

Aktuelle Erkenntnisse über die zellulären Grundlagen von Herzerkrankungen meist stützt sich auf Studien an Tiermodellen. Hier beschreiben wir und Validierung einer neuen Methode, um einzelne lebende Herzmuskelzellen von kleinen chirurgischen Proben menschlichen Myokard zu erhalten. Menschen Kardiomyozyten können für elektrophysiologische Studien-und Drogentests verwendet werden.

Zusammenfassung

Kardiomyozyten von erkrankten Herzen sind komplexe Umbauprozesse, die Änderungen in der Zellstruktur, Erregung Kontraktion Kupplung und Membranionenströme unterzogen. Diese Veränderungen sind wahrscheinlich für das erhöhte Risiko und die arrhythmogene Kontraktions Veränderungen, die zu den systolischen und diastolischen Dysfunktion bei Herzpatienten verantwortlich zu sein. Allerdings hat die meisten Informationen über die Veränderungen der Myozyten-Funktion im Herzerkrankungen aus Tiermodellen zu kommen.

Hier beschreiben wir ein Protokoll und zu validieren, um lebensfähige Muskelzellen von kleinen chirurgischen Proben von ventrikulären Myokard von Patienten, die Herzchirurgie Operationen zu isolieren. Das Protokoll wird im Detail beschrieben. Elektrophysiologischen und intrazellulären Calciummessungen berichtet, um die Durchführbarkeit einer Anzahl von Einzelzellmessungen in menschlichen Kardiomyozyten mit diesem Verfahren erhalten zu demonstrieren.

Das Protokoll berichtet erWieder kann für zukünftige Untersuchungen der zellulären und molekularen Basis der funktionellen Veränderungen des menschlichen Herzens in Gegenwart verschiedener Herzkrankheiten sein. Außerdem kann diese Methode verwendet, um neue therapeutische Targets auf zellulärer Ebene zu identifizieren und die Wirksamkeit der neuen Verbindungen auf die menschliche Herzmuskelzellen zu testen, mit direktem Translationswert werden.

Einleitung

Dissection der elektrophysiologischen Eigenschaften des Herzmuskels hat sich deutlich nach der Entwicklung von Techniken für die einzelnen Herzmuskelzellen Isolation vorangekommen. Die jüngsten Fortschritte im Verständnis der Herzkontraktion Anregung Kopplung (EC-Coupling) haben auch durch die Fähigkeit der Isolierung lebensfähigen Einzel Kardiomyozyten, die alle physiologischen Eigenschaften des intakten Gewebes behalten gemacht worden. Patch-Clamp-Verfahren werden routinemäßig verwendet, um die Funktion und pharmakologische Modulation von Herz sarkolemmalen Ionenströme zu untersuchen. Aufnahmen der intrazellulären Calcium-Dynamik mit Ca ^{2 +-sensitiven} Farbstoffen werden auch regelmäßig auf einzelne Herzmuskelzellen aus einer Vielzahl von gesunden und kranken Modelle durchgeführt wird, liefert wichtige Daten über die Physiologie des EG-Kupplung als auch auf die pathologischen Veränderungen der intrazellulären Ca ^{2 +} Homöostase, die zu mechanischen Beeinträchtigungen und erhöhte Belastung in arrhythmogene Herzkrankheiten. Information aus diesen Studien ist entscheidend für das Verständnis der elektrophysiologischen und mechanischen Auswirkungen von Drogen in der Klinik. Es gibt jedoch bestimmte Arten Unterschiede in den Transmembranströmen und in den EG-Kupplung Proteine, die für bestimmte Funktionen des Herzaktionspotentials und der Herzmechanik zu berücksichtigen. Während also Studien von Myozyten aus nicht-menschlichen Säugetieren isoliert haben die biophysikalischen Eigenschaften und physiologischen Rollen von spezifischen Transmembranionenkanäle und EC-Kopplung Proteine ​​aufgeklärt, sie sind nicht zwangsläufig relevanten Modelle der menschlichen Herzmuskelzellen. Isolation von lebensfähigen Muskelzellen aus menschlichen Herzmuskel ist daher unerlässlich, um die Pathophysiologie von Herzerkrankungen verstehen und Validierung neuer therapeutischer Ansätze.

Menschenvorhofgewebe ist leicht verfügbar, wie Vorhof Anhänge werden oft während der chirurgischen Verfahren verworfen. Erste quantitative Untersuchungen der erwachsenen menschlichen Herzaktionspotentiale und Ionen currents beschäftigt enzymatisch isolierten Vorhofzellen ^1-4. Aufnahmen von Aktionspotentialen oder Ströme aus isolierten erwachsenen Menschen ventrikuläre Zellen wurden anschließend berichtet ^3,5-10. Die meisten dieser Studien wurden Zellen aus explantierten Herzen gewonnen und verwendet entweder Collagenase-Perfusion einer Koronararterie Segment oder Belichtung von relativ großen Mengen an Kollagenase Exzidate isolierte Zellen zu erhalten. Diese Studien ermöglichte eine detaillierte Charakterisierung einer Anzahl von Transmembran-Ionenströme aus humanen Kardiomyozyten aus gesunden Herzen und von Patienten mit terminaler Herzinsuffizienz. Aufnahmen von L-Typ-Ca ^{2 +-Strom} (I _CA-L) ^5-7, transiente Kalium-Auswärtsstrom _{(I to)} ^8, Einwärtsgleichrichter Kaliumstrom (I _κ1) ^8, die verschiedenen Komponenten des verzögerten Gleichrichter-Kaliumstrom (I _κ ) ⁹ berichtet. Vorschüsse und Raffination vondie Isolationsverfahren ^10, erlaubt eine eindeutige Charakterisierung der ionischen Basis der erhöhten arrhythmogene Potential in terminaler Herzinsuffizienz, bestehend aus Aktionspotential-Verlängerung ¹¹ nach Depolarisationen ¹² verzögert und erhöhte lustig Strom ¹³ führt zu diastolischen Depolarisation und Extrasystolen.

Erwachsene Herzmuskelzellen werden in der Regel von kleinen Tieren durch retrograde Perfusion des ganzen Herzens mit verschiedenen Enzymmischungen, eine Technik, die hohe Ausbeuten von Ca ^{2 +-Zellen} tolerant ¹⁴ erzeugt isoliert. Isolierung von Herzmuskelzellen, die aus Fragmenten von Gewebe von Natur aus weniger erfolgreich wahrscheinlich wegen des begrenzten Zugangs zu einzelnen Enzyme Myozyten verglichen mit der durch Perfusion der Koronararterien erreicht. Wegen der sehr begrenzten Verfügbarkeit von Spenderherzen ungenutzt ist der einzige praktische Weg, um normale menschliche ventrikuläre Zellen auf einer regelmäßigen Basis zu erhalten, die durch enzymatische digestion der oft sehr kleinen Gewebefragmenten bei elektiven chirurgischen Verfahren ausgeschnitten. Die einzige menschliche Krankheitsmodell, die gründlich auf Zellebene charakterisiert worden ist terminaler Herzinsuffizienz aufgrund der Zugänglichkeit zu transplantierten Herzen. Allerdings tritt terminaler Herzinsuffizienz in einer Minderheit der Patienten und oft mit einem gemeinsamen Weg von schweren Umbau des Herzmuskelzellen, die relativ unabhängig von der zugrunde liegenden Ursache ¹⁵ ist. Die Fähigkeit, die Funktion der einzelnen Herzmuskelzellen von Patienten zu einem früheren nicht andernfalls Stadium der Erkrankung zu beurteilen ist entscheidend, um die spezifische Pathophysiologie verschiedener ererbte oder erworbene Zustände zu verstehen. Die hypertrophe Kardiomyopathie (HCM) ist ein beredtes Beispiel. HCM ist eine gemeinsame (1/500 Personen) vererbbare Herzerkrankung, die durch Herzhypertrophie, erhöhter arrhythmogene Risiko-und Kontraktions Änderungen aufgrund Ausflusstraktobstruktion und diastolischen Dysfunktion ^16. Kardiomyozyten aus HCM Herzen undergo eine komplexe Umbauprozesse, die Änderungen in der Zellstruktur (Hypertrophie, myofibrillären Unordnung) und EC-Kupplung ^17. Allerdings hat die meisten Informationen von Myozyten Dysfunktion bei HCM aus transgenen Tiermodellen zu kommen. Da nur eine Minderheit von HCM-Patienten entwickelt sich in Richtung Terminal Herzinsuffizienz und Herztransplantation benötigt, sind HCM Herzen sehr selten zur Zellisolierung mit Standard-Methoden zur Verfügung. Jedoch mindestens 30% der HCM-Patienten entwickeln obstruktive Symptome aufgrund massiver Blut Septumhypertrophie verändernde Ausflusstrakt Fluss während der Systole (HCM) ^18. Die wirksamste verfügbare therapeutische Option für die Entlastung der Obstruktion in HCM ist die chirurgische Septum Myektomie: während dieser chirurgische Eingriff ist eine variable Größe oberen Teil der Scheidewand von trans Aorten-Ansatz entfernt. Dieser Teil des hypertrophierten Septum ist deshalb zur Zellisolierung aus dem frischen Gewebe zur Verfügung.

Verfahren zur Isolierung von menschlichen ventricular Muskelzellen von einzelnen, kleinen transvenous Endomyokardbiopsie Proben zuvor entwickelt und veröffentlicht ^19. Wir implementierten eine Methode, um einzelne septalen Myozyten von Myokard-Proben von Patienten, die Herzchirurgie, einschließlich Patienten mit HCM unterziehen Septum Myektomie und Patienten, die sich Ventil Ersatzverfahren zu isolieren. Zusätzlich zu einer detaillierten Beschreibung der Trennprotokolls, repräsentativen elektrophysiologischen und Ca ^{2 +-Fluoreszenzmessungen} vorgestellt werden, was die Lebensfähigkeit der isolierten humanen Kardiomyozyten und die Durchführbarkeit der Patch-Clamp-und intrazellulären Ca ^{2 +-Studien.}

Protokoll

Die Versuchsprotokolle auf menschlichem Gewebe wurden von der Ethikkommission der Universität Careggi-Krankenhaus (; erneuert Mai 2009 2006/0024713) zugelassen. Jeder Patient hat eine schriftliche Einverständniserklärung.

1. Solutions und Vorbereitung der Ausrüstung

Lösungen werden in Tabelle 1 beschrieben. Ein vereinfachtes Flussdiagramm des Zellisolationsverfahren ist in Fig. 1 angegeben.

Lösung		CP	DB	KB	TB	PS	EB1	EB2
Reagens (mM)	KH 2 PO 4	50
	MgSO 4	8	1.2	5			1.2	1.2
	HEPES	10			10	10
	Adenosin	5
	Glucose	140	10	20	10		10	10
	Mannit	100
	Taurin	10	20	5			20	20
	NaCl		113		136		113	113
	KCl		4.7	85	5.4	25	4.7	4.7
	MgCl 2				1.2	5
	KH 2 PO 4		0,6	30			0,6	0,6
	Na 2 HPO 4		0,6				0,6	0,6
	NaHCO 3		12				12	12
	KHCO 3		10				10	10
	Na-Pyruvat		4				4	4
	BDM		10				10	10
	BHBA			5
	Bernsteinsäure			5
	EGTA			0,5
	2 K-ATP			2
	Brenztraubensäure			5
	Kreatin			5
	KMES					115
Enzyme (U / ml)	Collagenase Typ V						250	250
	Protease Typ XXIV						4
pH-Wert		7,4 KOH	7.3 NaOH	7.1 KOH	7,35 NaOH	7.2 KOH	7.3 NaOH	7.3 NaOH

. Tabelle 1 Lösungen für die Probengewinnung, Zellisolierung und funktionelle Charakterisierung von Myozyten CP = kardioplegischen Lösung verwendet. DB = Dissoziationspuffer; KB = Kraft-Brühe Lösung; TB = Tyrode-Puffer; PS = Pipettenlösung; EB1 = Enzympuffer 1; EB2 = Enzympuffer 2.

1. Bereiten kardioplegischen (CP)-Lösung. CP-Lösung kann bei 4 ° C für bis zu 1 Woche gelagert werden.
2. Bereiten Ca ^{2 +-freien} Puffer Dissoziation (DB). Diese Lösung sollte innerhalb des Tages verwendet werden.
3. Bereiten Kraft-Brühe (KB)-Lösung. KB-Lösung kann bei 4 ° C für bis zu 1 wee gespeichert werdenk.
4. Bereiten Ca ^{2 +-freien} Tyrode-Puffer (TB). Diese Lösung sollte innerhalb des Tages verwendet werden.
5. Alle Lösungen mit Spritzenfilter vor der Verwendung.
6. Bereiten Sie die Aufschlussgerät (2), ein Schaben des Behälters zwei einander gegen Bürsten aus Silikonelastomer, von denen einer drehbar durch einen Elektromotor gebildet. Die Aufschlussgerät ist eine Sonderanfertigung. Einzelheiten zur Verdauung Vorrichtung sind in Fig. 8; Bilder der Vorrichtung sind in den Fig. 2C und 2D. Das Gewebe Kammer mit 70% Ethanol und Wasser waschen.

2. Erhebung und Verarbeitung der myokardialen Proben

1. Gießen Sie 40 ml cardiplegic (CP)-Lösung in einem 50 ml-Tube und speichern sie in Eis für den Transport von der Probe operative Zimmer zur Zellisolierung Labor.
2. Sammeln Sie die ventrikuläre Herzmuskelprobe aus dem operativen Raum sofort nach der Exzision, waschen Sie es mit eiskaltemCP-Lösung und speichern sie in der Röhre. Verwenden endokardialen Proben aus dem oberen Zwischenkammerscheidewand bei Operationen am offenen Herzen, Gewichtung> 100 mg ausgeschnitten.
3. Schnelle Übertragung von der Probe an das Labor Bereich; Start der Verarbeitung von Proben innerhalb von 10 min von der Probe Exzision.
4. Während man die Probe in eiskaltem CP-Puffer, entfernen Sie vorsichtig die fibrotischen endokardialen Schicht mit einer feinen Schere unter einem Stereomikroskop; danach, schneiden Sie den myokardialen Gewebe in kleine Stücke (2-3 mm lang). Je nach Gewebeprobe, Größe, schneiden Sie einen Gesamtbetrag von ventrikulären Myokard zwischen 100 mg und 1 g für jede Isolation.
5. Nach Abschluss der Gewebewolf, übertragen Sie die myokardiale Brocken in der Aufschlussgerät, mit sauberen eiskalt CP Lösung. Vermeiden Füllen des gesamten Volumens zwischen den beiden Silizium Bürsten (3-4 ml) mit myokardialen Brocken mit nicht mehr als 1 g der gesamten Gewebes.

3. Waschen und Verdauung der myokardialen Chunks

1. Achterner die Brocken in die Schaben Kammer der Verdauung Gerät übertragen, ändern Sie die CP-Puffer in der Kammer mit kaltem Ca ^{2 +-freien} Puffer Dissoziation (DB).
2. Den Aufschluss Vorrichtung in einem thermostatischen Bad, um die Kammer in Kontakt mit dem erhitzten Wasser in der Wanne (Abbildung 1). Stellen Sie das Bad auf 37,5 ° C und schalten Sie ihn ein, um die Temperatur des Gewebes Kammer langsam erhöhen. Schalten Sie den Motor des Aufschlussgerät, Einstellung der Rotationsgeschwindigkeit auf 1 Umdrehung / Sekunde.
3. Führen Sie 3 Waschzyklen mit der DB, die Änderung der Lösung in der Kammer mit sauberen DB alle 8 min. Die DB erwärmt (37 ° C) und Sauerstoff, bevor sie in Kontakt mit der Herzstücke gesättigt.
4. Vorbereitung Enzympuffer 1 (EB1) durch Zugabe von 250 U / ml Collagenase Typ V und 4 U / ml Protease Typ XXIV DB Lösung. Bereiten Enzympuffer 2 (EB2) durch Zugabe von 250 U / ml Kollagenase Typ V an die DB-Lösung. Warm (37 ° C) und oxygenatE EB1 und EB2.
5. Führen zwei Zyklen von 12 min Verdau in der Drehvorrichtung Verdauung mit 100% Sauerstoff angereicherten EB1 (bei 37 ° C). Bei jedem Zyklus werden ~ 3 ml EB1. Entfernen Sie die Lösung mit einer Pipette Aspiration und entsorgen Sie sie nach jedem Zyklus.
6. Bereiten 6 15-ml-Röhrchen für Zellsammlung und ~ 80 ml kaltem (4 ° C) KB Lösung zur Elution der Puffer.
7. Durchführen einer ersten 15 min Verdau Zyklus mit 3 ml 100% mit Sauerstoff angereichert EB2 bei 37 ° C. Nach der Verdauung Zyklus, sammeln die Lösung, die die ersten getrennt Muskelzellen in einer 15 ml Tube und verdünnt das Zellsuspension mit 12 ml kaltem KB Lösung. Bewahren Sie das Flachrohr bei Raumtemperatur.
8. Verdünnt das verbleibende EB2 Lösung mit einer gleichen Menge von DB, um die Konzentration von Kollagenase V für die folgenden Zyklen Verdauung halbieren.
9. Ausführen anderer 5 12 min Verdau Zyklen mit 3 ml EB2 bei 37 ° C; nachdem jedes von ihnen zu sammeln von Myozyten-enthaltenden Puffer in einem 15 ml konischen Röhrchen undverdünnen Sie es mit 12 ml Lösung KB. 6 speichern die Zelle, die Röhrchen bei Raumtemperatur für 30 min.

4. Zell Resuspension und Ca ^{2 +} réadaptation

1. 1 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA) in 20 ml Ca ^{2 +-freien} Tyrode-Puffer (TB). Filtern Sie die Lösung.
2. Zentrifugieren Sie die sechs myocyte enthält konische Röhrchen bei 100 xg für 5 min auf Muskelzellen zu begleichen erzwingen. Entfernen des Überstandes und Resuspendieren der Zellen in jedem Röhrchen mit einer variablen Menge (1-3 ml, abhängig von der Ausbeute) BSA enthält TB bei RT.
3. Ca ^{2 +-Konzentration} schrittweise erhöhen, in der Zelle, die Puffer durch Zugabe von kleinen Portionen von 100 mmol / l CaCl _2-Lösung. In den ersten und zweiten Schritten von Ca ^{2 +-Konzentration} bis zu 50 &mgr; mol / l und 100 mmol / L bzw. angehoben. Folgende Ca ^{2 +-Zugabe} Schritte alle 5 min durchgeführt und die Konzentration von 100 &mgr; mol / L bei jedem Schritt t angehobenoa endgültige Konzentration von 0,9 mmol / L.
4. Bewerten Sie die Ausbeute des Isolierungsverfahren. Übertragen Sie 0,5 ml myocyte haltigen Lösung auf die Glasbodenkammer eines Mikroskops. Bewerten 15 Mikroskopfelder bei 10-facher Vergrößerung und Ziel berechnen den Anteil der gesunden Muskelzellen (zB stabförmige Zellen mit klaren Rillen und keine signifikanten Einschlüsse, Abbildung 2). Die erwartete Rendite liegt bei etwa 20%.

5. Funktionale Bewertung von isolierten Kardiomyozyten.

Das folgende Protokoll ist ein Beispiel für menschlichen Kardiomyozyten funktionelle Beurteilung einschließlich simultane Messungen von Aktionspotentialen und intrazelluläre ^{Ca2 +-Flüsse.}

1. Bereiten Pipettenlösung (PS) für die Patch-Clamp-Experimente in perforierten Patch-Konfiguration. Die Lösung kann bei -20 ° C für bis zu 3 Monate aufbewahrt werden.
2. In 1,8 mmol / l CaCl ₂ Ca ^{2 +-freien} Tyrode-Puffer (TB). Use diese Lösung für Superfusion der Herzmuskelzellen während der Patch-Clamp-/ Fluoreszenzexperimente.
3. 1 ml der Zellsuspension in ein 1,5-ml-Röhrchen und fügen 10 mmol / L Fluoforte und 10 ul Antriebsladung Konzentrat. Inkubation 30 min bei RT. Danach stellen Sie den Schlauch in vertikale Position und die Zelle verlassen, um für 5 min zu regeln; Resuspendieren der Zellen in Ca ^{2 +} TB enthält.
4. Übertragen 0,25 ml der Zellsuspension in ein kleines (0,5 ml), montiert temperaturgesteuerten Mikroskop-Aufzeichnungskammer, durch die Schwerkraft mit einem beheizten microperfusor System bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,3 ml / min superfundiert (Temperatur: 37 ± 0,5 ° C).
5. Verwendung einer Pipettenziehvorrichtung, herzustellen Patch-Clamp-Pipetten mit einem Spitzendurchmesser von 3 bis 5 &mgr; m und einem Widerstand von 3 bis 4,5 M, wenn sie mit PS gefüllt.
6. In Amphotericin B zu einer Charge von PS (250 pg / ml) und verwenden Sie es, um die Elektroden zu füllen.
7. Wählen Sie eine stabförmige Zelle mit klaren Schichten, frei von Einschlüssen, form die Giga-Dichtung und warten Sie 5 bis 10 Minuten, bis der Zugriff Widerstand unter 20 MOhm.
8. Elicit Aktionspotentiale in der Stromzange Modus mit kurzen Pulsen (<3 ms) bei unterschiedlichen Frequenzen der Stimulation (0,2 Hz, 0,5 Hz und 1 Hz, 1 min bei jeder Frequenz). Während der Aufzeichnungsphase, schalten Hellfeldbeleuchtung bei 492 ± 3 nm und erkennen Fluoforte Fluoreszenz bei 505-520 nm auf. Erwerben Fluoreszenz und Membranpotential Signale mit Digidata 1440A und pClamp 10.0 Software. Wiederholen Sie die Aufnahmesequenz mehrmals, wenn nötig; allerdings halten die Gesamtaufnahmezeit von unter 15 min für jede Zelle.

Ergebnisse

Das oben beschriebene Verfahren wurde verwendet, um die funktionellen Störungen von Kardiomyozyten aus der Scheidewand des Patienten mit hypertropher Kardiomyopathie (HCM) die Myektomie Operation unterzog isoliert charakterisieren, verglichen mit nicht andernfalls nicht hypertrophe chirurgischen Patienten ^21. Die in diesem Abschnitt enthalten sind, aus diesem Werkstück ²¹ ab und sind hier als ein Beispiel, wie diese Technik verwendet, um die Änderungen der Herzmuskelzellfunktion bei Herzerkranku...

Diskussion

Wir haben beschrieben und validiert, eine Methode, um praktikable Muskelzellen von chirurgischen Proben menschlichen Myokard zu isolieren. Ausgehend vom zuvor beschriebenen Protokolle, die erfolgreich an isolierten Zellen von Vorhof chirurgischen Proben, die Technik benutzt hatte, um eine Trennung von einzelnen tragfähige Muskelzellen von erkrankten Myokard entwickelt und fein abgestimmt. Frühe Berichte zeigten, dass Isolierung einzelner Kardiomyozyten aus Brocken von atriale und ventrikuläre Gewebe selektiv beeintr?...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791
Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4*7H2O)	Sigma-Aldrich	M1880
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Adenosine	Sigma-Aldrich	A9251
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	P5958
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S7907
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6297
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Sigma-Aldrich	237205
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	B0753
Sodium hydroxide(NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045
L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate	Sigma-Aldrich	49601
Pyruvic acid	Sigma-Aldrich	107360
3-Hydroxybutyric acid	Sigma-Aldrich	166898
Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP)	Sigma-Aldrich	A8937
Creatine	Sigma-Aldrich	C0780
Succinic Acid	Sigma-Aldrich	S3674
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E0396
Albumin from bovine serum	Sigma-Aldrich	A0281
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V	Sigma-Aldrich	C9263
Proteinase, Bacterial, Type XXIV	Sigma-Aldrich	P8038
Calcium chloride solution, ~1 M in H2O	Sigma-Aldrich	21115
Calcium chloride 0.1 M solution	Sigma-Aldrich	53704
Potassium methanesulfonate	Sigma-Aldrich	83000
FluoForte Reagent	Enzo Life Sciences	ENZ-52015
Powerload concentrate, 100X	Life Technologies	P10020
Perfusion Fast-Step System	Warner Instruments	VC-77SP
Amphotericin B solubilized	Sigma-Aldrich	A9528
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier	Molecular Devices
Digidata 1440A	Molecular Devices
pClamp10.0	Molecular Devices
Digestion Device	CUSTOM	CUSTOM	The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Figure 1C-1D and in Figure7. We can provide further details if requested.
Silicone elastomer for the digestion device's brushes	Dow Corning	SYLGARD® 184
Variable speed rotating motor for the digestion device	Crouzet	Crouzet 178-4765
Mold for brushes casting	N.A.	N.A.	The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods.