والقلوي حرق الإصابات نموذج من القرنية اتساع الأوعية الدموية في ماوس

Summary

اتساع الأوعية الدموية (NV) من القرنية يمكن أن يعقد الأمراض البصرية متعددة. الاستفادة من وجود والقلوي الحرق نموذج الإصابة التي تسيطر عليها، ومستوى قياس الكمي من NV القرنية يمكن أن تنتج عن دراسة الآلية من NV القرنية وتقييم العلاجات المحتملة لاضطرابات التوعية المستحدثة.

Abstract

في ظل ظروف طبيعية، والقرنية هي اوعائي، وهذه الشفافية أمر ضروري للحفاظ على البصر جيدة. اتساع الأوعية الدموية (NV) من القرنية، والتي يمكن أن يكون سببها الصدمة، القرنية أو الأمراض المعدية، ينهار ما يسمى "شرف عائية 'القرنية ويشكل أساس الأمراض البصرية المتعددة التي قد تؤدي إلى العمى. على الرغم من أن هناك العديد من الخيارات العلاجية المتاحة، والحاجة الطبية الأساسية المقدمة من الأمراض التوعية المستحدثة القرنية لا تزال غير الملباة. من أجل تطوير علاجات آمنة وفعالة، وهادفة، لا بد من نموذج يمكن الاعتماد عليها من NV القرنية والتدخل الدوائي. هنا، نحن تصف إصابة القلويات الحرق نموذج اتساع الأوعية الدموية القرنية في الماوس. يوفر هذا البروتوكول طريقة لتطبيق إصابة القلويات حرق تسيطر على القرنية، وإدارة مجمع الدوائية المصالح، وتصور النتيجة. هذا الأسلوب يمكن أن تكون أجهزة قياسالتل لدراسة آليات والفرص أمام التدخل في NV القرنية واضطرابات التوعية المستحدثة الأخرى.

Introduction

العمى القرنية هو رابع سبب الأكثر شيوعا من العمى، مسؤولة عن ما يقرب من 4٪ من جميع الحالات ^1. اتساع الأوعية الدموية القرنية (NV) تلعب دورا هاما في كثير من هذه الأمراض، بما في ذلك التهاب القرنية بالهربس (أهم الأمراض المعدية المسببة للعمى في الغرب) والتراخوما (السبب الرئيسي للعمى في جميع أنحاء العالم المعدية) ^2. وتشمل العلاجات الحالية المنشطات، والأدوية المضادة للالتهابات (المسكنات)، والعلاجات المضادة للVEGF، والسيكلوسبورين A وكذلك التقنيات الجراحية التقليدية أو بالليزر ^3. ومع ذلك، فإن الطبيعة المنهكة بشدة من الأمراض NV مقرها القرنية، وقلة المرافق الجراحية قادرة على معالجة NV القرنية، وعدم وجود خيار الدوائية أداء قويا بقيادة مائدة مستديرة الخبراء مؤخرا أن نخلص إلى أن، على الرغم من العلاجات موجودة، والحاجة الطبية الأساسية قدم من قبل هذه الأمراض لا تزال غير الملباة ^4.

القرنية البشريةيتكون من 5 طبقات، 3 طبقات الخلوية (الظهارية، اللحمية والبطانة) و2 واجهة (بومان الغشاء وغشاء ديسميه). وهو يعمل كحاجز الميكانيكية والسطحية للعين الانكسار. طبيعته شفافة هو نتيجة لتوازن دقيق لمكوناته وجزء لا يتجزأ من وظيفة مناسبة لها ^5. عادة اوعائي، يتلقى القرنية الدم من microvessels على طول الحافة الخارجية والتي يتم تغذيتها من الهدبية والشرايين العيون. يحدث القرنية NV عندما حافزا يشجع الأوعية الدموية من هذه السفن مما يسمح لها أن تنمو نحو مركز القرنية، وبالتالي تحد من الرؤية ^6. ويشمل الأوعية الدموية القرنية hemangiogenesis وlymphangiogenesis، مما يؤدي في نشوب الأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية من الممرات الأوعية الدموية الحوفي نحو مركز القرنية. وهذا يؤدي إلى انهيار القرنية "امتياز عائية"، زيادة في عتامة القرنية والتليف، اختلال القرنية لاyers، وذمة ^7. مشغلات دقيقة من NV القرنية عديدة، بدءا من الاستجابة للأمراض المعدية مثل التراخوما إلى حالة يسببها كيميائيا تسبب الأدوية التقليدية، والمواد الكيميائية الصناعية، أو عوامل الحرب الكيميائية حتى.

الآليات الجزيئية لهذه العملية ليست، حتى الآن، تتميز بشكل كامل؛ ومع ذلك، فقد تم تحديد عدد قليل من اللاعبين الرئيسيين. في ظل ظروف طبيعية القرنية تمتلك فريد 'امتياز عائية' التي تحتفظ بها مجموعة زائدة من العوامل المضادة للعائية (مثل ذوبان VEGF-R1) ^8. ومع ذلك، واستجابة لحافز خارجي (مثل إصابة)، سيكون هناك upregulation المحلية من العوامل المؤيدة للعائية (مثل VEGF-A). هذه النصائح ميزان العوامل المؤيدة والمضادة للعائية الذي يكمن وراء امتياز عائية القرنية، ويؤدي إلى وhemangiogenesis، lymphangeogenesis، والتهاب، وبالتالي التسبب في أمراض القرنية وحتى العمى ^9.

<ع الطبقة = "jove_content"> ونظرا للم تلب الحاجة الطبية لهذه الأمراض المنهكة للغاية، فإنه من مصلحة إلى الميدان لديهم نموذج حيواني موثوقة من NV القرنية. نحن هنا تقديم مثل هذا النموذج: تسيطر إصابة القلويات الحرق. وقد استخدمت نماذج مختلفة لافتة للإصابة على أساس استخدام فلتر حلقات رقة منذ 1970s ^10. في عام 1989، وتتميز مجموعة من أطباء العيون كلية الطب بجامعة هارفارد نموذجا مستوى القرنية اصابة القلوي حرق المركزية في أرنب على أساس تمرغ قطعة من ورق الترشيح دائرية مع هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) وتطبيقه على القرنية في مجموعة محددة من تركيزات ^11. منذ ذلك الحين، وقد تم تكييف هذه التقنية لاستخدامها في ^12-14 الماوس. في الآونة الأخيرة، ودرس في المختبر وانغ الآثار العلاجية للdeacetylase هيستون (HDAC) مثبط ساها في التسبب في NV القرنية باستخدام الماوس القرنية القلوي حرق إصابة نموذج ^15. تم بناء منهجية الماوس القرنية نموذج إصابة القلويات حرق المقدمة هناأساسا على العمل قبل ورقتين أخرى ^14،16.

Protocol

ملاحظة: بروتوكول التالية ونتائج ممثلة استخدام مثبط HDAC ساها باعتبارها مركب سبيل المثال. ومع ذلك، وهذا البروتوكول هو بأي حال من الأحوال تقتصر على استخدام ساها، وينصح كأسلوب عام لاختبار آثار المركبات القابلة للذوبان على اتساع الأوعية الدموية القرنية. سوف تحتاج إلى تعديلات طفيفة يتم للحصول على درجة من التخفيف وكذلك تواتر ومدة التطبيق. بالإضافة إلى ذلك، سوف المركبات القابلة للذوبان في الماء بسهولة تكون قادرة على أن تدار في غياب DMSO.

بيان الأخلاقية: يجب فقط أن يتم تنفيذ جميع التجارب على الحيوانات وفقا للقانون واللوائح الوطنية المؤسسية. تمت الموافقة على هذا البروتوكول للاستخدام من قبل جامعة تولين المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة.

1. إعداد مواد (في ترتيب الاستخدام)

1. قطع قطعة من ورق الترشيح السليلوز (11 ميكرون) إلى 2 ملم الدوائر.
2. إعداد محلول هيدروكسيد الصوديوم 1 M من قبلحل 20 غرام من هيدروكسيد الصوديوم في 500 مل المقطر H ₂ O. تخزين في درجة حرارة الغرفة. تنبيه: حلول هيدروكسيد الصوديوم هي تآكل ويمكن أن يسبب حروق القلويات.
3. إعداد كوكتيل مخدر عن طريق تمييع 10 مل من 100 ملغ / مل الكيتامين و 2.5 مل من 20 ملغ / مل في زيلازين 37.5 مل من برنامج تلفزيوني 1X لتركيز النهائي من 20 ملغ / مل الكيتامين و 4 ملغ / مل زيلازين.
4. إعداد محلول 0.5٪ من بروباراكايين هيدروكلوريد (لتسكين موضعي) عن طريق إذابة 500 ملغ من هيدروكلوريد بروباراكايين في 100 مل من برنامج تلفزيوني تصفيتها.
5. إعداد برنامج تلفزيوني 1X عن طريق إذابة 8 ز كلوريد الصوديوم، 0.2 غرام من بوكل، 1.44 ز نا ₂ هبو _4، و 0.23 غرام من ناه ₂ ص ₄ في 900 مل من H ₂ O. المقطر ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4. تجلب الحل إلى الحجم النهائي من 1،000 مل مع المقطر H ₂ O ومرشح لضمان العقم.
6. إعداد 1،000 خ حلول المخزون من ساها في ~ 100 ملم في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) عن طريق إذابة 26.4 ملغ من ساها في 1 مل من DMSO. تمييع ل1X (~ 10 ميكرومتر)الحل في برنامج تلفزيوني لتصفية كل استخدام. تخزين الحل السهم عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. تنبيه: DMSO هو السم المعروف والمغير.
7. إعداد محلول 4٪ من بارافورمالدهيد (PFA) لتثبيت. تحت غطاء الكيميائية، ويحل 4 غرام من PFA في 90 مل من برنامج تلفزيوني. جلب الخليط إلى 65 درجة مئوية ويعاير إلى الرقم الهيدروجيني من 7.4. مرة واحدة وقد حل PFA، وجلب الحل إلى الحجم النهائي من 100 مل. تخزين عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. تنبيه: PFA هو المعروف أن الحساسية المسببة للسرطان، والسامة.
8. إعداد عازلة تمنع 1X عن طريق تمييع 5 مل من مصل الماعز و 500 من المجاهدين تريتون X-100 في 94.5 مل من برنامج تلفزيوني.
9. إعداد 1X العازلة الغسيل عن طريق تمييع 500 من المجاهدين تريتون X-100 في 99.5 مل من برنامج تلفزيوني.

2. القلويات حرق الإصابات ومجمع العلاج

1. بلل قطعة مستديرة من ورق الترشيح، ~ 2 مم في القطر، في حل من هيدروكسيد الصوديوم M 1.
2. تخدير الفأر مع حقنة من 100 ملغ / كغ الكيتامين و 5 ملغ / كغ زيلازين، ذوي الخوذات البيضاءالتراث الثقافى المعنوى هو ~ 100 ميكرولتر من مخدر كوكتيل من الخطوة 1.3 لكل 25 غرام الماوس. التخدير يجب أن تأخذ ~ 1-2 دقيقة لتعيين بوصة عمق التخدير قد يحددها معسر بلطف أخمص القدمين أو ذيل الحيوان، إذا التخدير كافية وينبغي أن يكون هناك أي رد. ملاحظة: يجب توخي الحذر لضمان الماوس لا تستسلم للتخدير يسببها انخفاض حرارة الجسم.
3. باستخدام شافطة، وتطبيق موضعيا قطرة من 0.5٪ بروباراكايين هيدروكلوريد على سطح القرنية لتسكين المحلية.
4. باستخدام ملقط معقم، والتقاط قطعة من ورق الترشيح هيدروكسيد الصوديوم غارقة. إذا لاحظت الزائدة هيدروكسيد الصوديوم أو التشبث يقطر من ورقة الترشيح، اضغط لفترة وجيزة ورقة الترشيح غارقة على قطعة جافة من ورق الترشيح لامتصاص الزائد. وضع قطعة من ورق الترشيح هيدروكسيد الصوديوم غارقة في القرنية المركزية. اتركه لمدة 30 ثانية لتوليد حرق القلويات الحادة من ~ 2 × 2 مم ² في المنطقة. الميكروسكوب الجراحي مفيد في وضع صحيح ورقة الترشيح. ملاحظة: عين واحدة فقط من ليالي الماوسيكون اصيب hould معها مع الآخر بمثابة السيطرة.
5. إزالة ورقة الترشيح. باستخدام حقنة 10 مل، مسح بلطف العين مع 10 مل من برنامج تلفزيوني 1X مرتين ليغسل المتبقية 1 M هيدروكسيد الصوديوم.
6. تطبق على الفور قطرة من 1X ساها الحل تعمل (أو السيطرة على السيارة التي تتألف من برنامج تلفزيوني المخفف DMSO لا تحتوي على ساها) موضعيا على القرنية. تكرار 3x/day التطبيق لمدة 14 يوما. ملاحظة: خلال هذه الفترة لا ينصح مرهم مضاد حيوي موضعي لأنها قد تتداخل مع تطور الإصابة وتسليم المجمع. استخدام المضادات الحيوية حل السائل، مثل 3٪ جنتاميسين الحل، بدلا من ذلك.
7. الانتقال مباشرة إلى التقييم السريري (بروتوكول 3 أدناه) أو التضحية الماوس واستأصل العينين لالقرنية مسطحة جبل (البروتوكول 4 أدناه) أو التقليدية البارافين / الأنسجة المجمدة.

3. التقييم السريري

1. إجراء فحص اليومي من الفئران بطريقة أعمى تحت المجهر الجراحي ويسجل جorneal NV على أساس عتامة القرنية، NV، وحجم السفينة. استخدام اثنين على الأقل من المراقبين وتسجيل النتيجة النهائية وهذا هو المتوسط ​​من الاثنين.
   1. يسجل عتامة القرنية على مقياس من 0-4. 0 = واضحة تماما؛ 1 = ضبابي قليلا، قزحية والتلميذ مرئية بسهولة؛ 2 = مبهمة قليلا، قزحية والتلميذ لا يزال كشفها؛ 3 = مبهمة، والتلاميذ بالكاد يمكن كشفها؛ و4 = مبهمة تماما مع أي رأي للتلميذ.
   2. يسجل NV على مقياس من 0-3. 0 = لا neovessels؛ 1 = neovessels في حوف القرنية؛ 2 = neovessels تمتد حوف القرنية والاقتراب من مركز القرنية؛ 3 = neovessels تمتد وسط القرنية.
   3. يسجل حجم السفينة على مقياس من 0-3. 0 = لا neovessels؛ 1 = neovessels كشفها تحت المجهر الجراحي؛ 2 = neovessels رؤيتها بسهولة تحت المجهر الجراحي؛ 3 = neovessels ينظر اليه بسهولة دون المجهر.
2. باستخدام كاميرا رقمية، والتقاط الصور ممثل العين في 7 أيام و 14 يوما.

4.القرنية تلطيخ وشقة الجبال

1. إصلاح العين منزوعة النواة في PFA 4٪ لمدة 1 ساعة على الأقل في 4 درجات مئوية.
2. نقل العين إلى برنامج تلفزيوني 1X واستخدام الملقط لإزالة الأنسجة الزائدة بعناية.
3. مع المعونة من الميكروسكوب الجراحي، واستخدام إبرة (قياس 18) أو الجزئي سكين لخرم المنطقة المحيطة بالقرنية من العين (ملاحظة: هذا يجب إصدار السائل من العين).
   1. من ثقب المحرز في القسم 4.3.1 استخدام زوج من مقص جراحي لقطع الجزء الأمامي من العين (القرنية) من الجزء الخلفي.
4. نقل القرنية مرة أخرى في PFA 4٪ بين عشية وضحاها لتثبيت في 4 درجات مئوية.
5. تجاهل PFA 4٪ (تنبيه: PFA خطرة ويجب التخلص منها وفقا للأنظمة المؤسسية) وشطف القرنية ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X لإزالة أي PFA المتبقية.
6. احتضان في عرقلة العازلة 1X لا يقل عن 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة لpermeabilize الأنسجة ومنع ملزم غير محدد من الأجسام المضادة الأولية.
   1. تطبيق الأجسام المضادة الأولية في 1X العازلة حظر، في التخفيف 100-500 أضعاف. (مثل الفئران لمكافحة فأر PECAM-1-للكشف عن الأوعية الدموية في 1:100، أرنب المضادة للماوس-LYVE-1 للكشف عن الأوعية اللمفاوية في 1:500، و / أو anti-mouse-F4/80 الفئران للكشف عن الضامة في 1:100). احتضان عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
   2. يغسل ست مرات مع 1X العازلة الغسيل لمدة 1 ساعة في كل مرة في درجة حرارة الغرفة لإزالة الأجسام المضادة الأولية غير منضم بالكامل.
   3. تطبيق الضد الثانوية في 1X العازلة حظر على 500-1،000 التخفيف أضعاف. (على سبيل المثال 488 نانومتر الفلورسنت الموسومة الماعز المضادة للمفتش الجرذان في 1:800 أو الفلورسنت 594 نانومتر الموسومة الماعز المضادة للأرنب مفتش في 1:800). احتضان عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
   4. يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة كل لإزالة الأجسام المضادة الثانوية بالكامل غير منضم.
7. نقل القرنية في برنامج تلفزيوني 1X الطازجة و، بمساعدة الميكروسكوب الجراحي، وجعل بعناية أربعة شقوق من المحيط نحو المائةإيه. وهذا ينبغي تقسيم القرنية إلى أربعة أجزاء متساوية في الحجم تقريبا (الشكل الناتج ينبغي أن ننظر بدلا مثل فراشة) والسماح لها الاستلقاء على الشريحة.
8. جبل مع تصاعد المناسبة المتوسطة للتصوير الفلورسنت. للحصول على أفضل النتائج، يجب أن يمكن تصوير العينات فورا وأخذ الصور الرقمية، ولكن يمكن تخزينها لعدة أسابيع محمية من الضوء في 4 درجات مئوية.

النتائج

بعد إصابة القلويات الحرق، يحدث NV القرنية في التنبؤ بها، تعتمد على الوقت المناسب. الشكل 1 يوضح الفرق صارخ سواء في اتساع الأوعية الدموية وعتامة القرنية بين حيوان غير المعالجة (الشكل 1A) وحيوان تعامل مع مثبط HDAC ساها (الشكل 1B ) في نقطة زمنية لمدة 7...

Discussion

بروتوكول المعروضة هنا النتائج في مستويات استنساخه من hemangiogenesis، lymphangiogenesis، والتهاب، مما يجعله نظام مثالي لدراسة هذه (المترابطة) العمليات الثلاث. في حين تنتج هذه الطريقة NV القرنية مركزية، العديد من الطرق التي تم تطويرها لتتسبب في المزيد من توجه NV، وهي خياطة القرنية وز?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Syringe	BD	309659
18 Guage Needle	BD	305918
10 mL Syringe	BD	306575
25 Guage Needle	BD	305916
Anti-F4/80 (rat anti-mouse)	AbD Serotech	MCA497RT
Anti-LYVE-1 (rabbit anti-mouse)	Abcam	ab14917
Anti-PECAM-1 (rat anti-mouse)	BD	553370
Anti-IgG Alexa488 (goat anti-rat)	Invitrogen	A11006
Anti-IgG Alexa594 (goat anti-rabbit)	Invitrogen	A11012
Camera	Tucsen	TCC 5.0 ICE
Coverslips	Fisher	12-548-B
DMSO	Sigma	D4540-1L	Caution: Mutagenic, Toxic
Forceps (Blunt), Iris	WPI	15915
Forceps (Sharp), Dumont #4	WPI	500340
KCl	Fisher	P217-500
Ketamine Solution	MedVet	RXKETAMINE	Controlled substance, proper license required for use.
Light Source for Microscope	AmScope	LED-14M-YA
Microscope (Stereo 7X-45X)	AmScope	SM-1B
Mounting Medium, Vectashield	Vector	H-1000
NaCl	Fisher	S271-10
NaH2PO4	Fisher	S397-500
NaOH	Fisher	S318-1	Caution: Corrosive
Paraformaldehyde		P6148-500G	Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic
Proparacaine Hydrochloride	Sigma	P4554-1G
Scissors (5mm blade), Vanas	WPI	14003
Goat Serum	MPBio	92939249
Microscope Slides	Fisher	12-550-15
Triton X-100	Sigma	T8787-100ML
Whatman Grade 1 Filter Paper	Whatman	1001-6508
Xylazine Solution	MedVet	RXANASED-20