Um ferimento Modelo Alkali queima de córnea neovascularização no Rato

Resumo

A neovascularização (NV) da córnea pode complicar múltiplas patologias visuais. Utilizando um modelo controlado lesão alcalino-queima, um nível quantificável da NV córnea pode ser produzido para o estudo mecanicista da NV córnea e avaliação de potenciais terapias para doenças neovascular.

Resumo

Sob condições normais, a córnea é avascular, e esta transparência é essencial para manter uma boa acuidade visual. Neovascularização (NV) da córnea, o que pode ser causado por trauma, ceratoplastia ou doença infecciosa, decompõe o chamado 'privilégio angiogénico' da córnea e forma a base de várias patologias visuais que podem mesmo conduzir à cegueira. Embora existam várias opções de tratamento disponíveis, a necessidade médica fundamentais apresentados por patologias neovascular córnea permanece inacabado. A fim de desenvolver terapias seguras, eficazes e direcionados, é necessário um modelo confiável de NV córnea e intervenção farmacológica. Aqui, descrevemos um modelo de neovascularização corneana lesão álcali-queimadura no mouse. Este protocolo fornece um método para a aplicação de uma lesão alcalino-queima controlada para a córnea, a administração de um composto farmacológico de interesse, e a visualização do resultado. Este método poderia ser instrumentaltal para o estudo dos mecanismos e oportunidades de intervenção em NV córnea e outros distúrbios neovascular.

Introdução

Cegueira da córnea é a quarta causa mais comum de cegueira, responsável por cerca de 4% de todos os casos de ^1. Neovascularização da córnea (NV) desempenha um papel importante em muitas destas patologias, incluindo a ceratite herpética (a principal causa infecciosa de cegueira no Ocidente) e tracoma (a principal causa de cegueira no mundo inteiro infeccioso) ^2. As terapias atuais incluem esteróides, medicamentos anti-inflamatórios não-esteróides (AINE), terapias anti-VEGF e ciclosporina A, bem como as técnicas cirúrgicas convencionais ou a laser ^3. No entanto, a natureza altamente debilitante de patologias NV base da córnea, a escassez de instalações cirúrgicas capazes de tratar NV córnea, ea falta de uma opção farmacológica fortemente a realização de uma mesa redonda liderada especialista recente a concluir que, apesar das terapias existentes, a necessidade médica fundamentais apresentado por estas patologias permanece insatisfeita ^4.

A córnea humanaé composto por 5 camadas, 3 camadas celulares (epitelial, estroma e endotélio) e 2 de interface (membrana de Bowman e membrana Descemet). Ela funciona como uma barreira mecânica e a superfície de refracção para o olho. A sua natureza transparente é a conseqüência de um delicado equilíbrio de seus componentes, e é parte integrante da sua função própria ^5. Normalmente avascular, a córnea recebe sangue microvasos que correm ao longo do seu bordo exterior, que são alimentados a partir da ciliar e artérias oftálmicas. Corneal NV ocorre quando um estimulo promove a angiogénese dos vasos, permitindo-lhes crescer em direcção ao centro da córnea e assim limitar a visão ^6. Angiogênese corneana inclui hemangiogenesis e lymphangiogenesis, o que resultará no crescimento interno dos vasos sanguíneos e vasos linfáticos da arcada vascular do limbo em direção ao centro da córnea. Isto leva a uma quebra de córnea "privilégio angiogênico", um aumento na opacidade da córnea e fibrose, rompimento da córnea laYERS, edema e ^7. Os gatilhos precisas de NV córnea são inúmeras, que vão desde uma resposta a doenças infecciosas, como o tracoma a um estado induzido quimicamente causado medicamentos tradicionais, produtos químicos industriais, ou até mesmo agentes de guerra química.

Os mecanismos moleculares deste processo não são, ainda, totalmente caracterizado; no entanto, alguns jogadores-chave foram identificados. Sob condições normais, a córnea possui um único 'privilégio angiogénico "mantida por um conjunto redundante de factores anti-angiogénicos (tais como solúveis de VEGF-R1) ^8. No entanto, em resposta a um estímulo externo (por exemplo, uma lesão), não haverá uma regulação positiva locais de factores pró-angiogénicos (por exemplo, VEGF-D). Este dicas o equilíbrio de fatores pró e anti-angiogênicos que subjaz privilégio angiogênico da córnea, e leva a hemangiogenesis, lymphangeogenesis e inflamação, portanto, causando patologia da córnea e até cegueira ^9.

Dada a necessidade médica não atendida desta patologia altamente debilitante, é de interesse para o campo para ter um modelo animal confiável de NV córnea. Aqui apresentamos um modelo desse tipo: controlado lesão álcali-queimadura. Vários modelos olho-lesão com base em uso de anéis de papel de filtro são usados ​​desde 1970 ^10. Em 1989, um grupo de oftalmologistas Harvard Medical School caracterizado um modelo padrão de lesão da córnea alcalino-queimadura central em coelhos com base no embebendo um pedaço de papel de filtro circular com hidróxido de sódio (NaOH) e aplicando-a à córnea a uma gama específica de concentrações ^11. Desde então esta técnica tem sido adaptada para uso no rato ^12-14. Recentemente, o laboratório de Wang estudou os efeitos terapêuticos da histona deacetilase (HDAC) SAHA na patogênese da NV córnea utilizando um modelo de lesão da córnea alcalino-burn rato ^15. A metodologia do modelo de lesão da córnea do rato alcalino-burn aqui apresentado foi construídoprincipalmente no trabalho prévio de dois outros jornais ^14,16.

Protocolo

Nota: O seguinte protocolo e os resultados representativos utilizar o inibidor HDAC SAHA como um composto de exemplo. No entanto, este protocolo é de modo algum limitado ao uso de SAHA, e é recomendada como um método geral para testar os efeitos de compostos solúveis em neovascularização córnea. Pequenas modificações terão de ser feitas para o grau de diluição, assim como a frequência e duração da aplicação. Além disso, os compostos que são facilmente solúveis em água poderá ser administrada na ausência de DMSO.

Declaração de ética: Todos os experimentos com animais só deve ser realizado em conformidade com a legislação nacional e os regulamentos institucionais. Este protocolo foi aprovado para uso pela Universidade de Tulane Institutional Animal Care e do Comitê Use.

1. Elaboração de Materiais (em ordem de utilização)

1. Cortar um pedaço de papel de filtro de celulose (11 mm) em 2 milímetros círculos.
2. Prepara-se uma solução 1 M de NaOH pordissolvendo 20 g de NaOH em ​​500 ml de água destilada H ₂ O. Armazenar à temperatura ambiente. CUIDADO: soluções de NaOH são corrosivos e podem causar alcalinos-queimaduras.
3. Preparar um cocktail anestésico por diluição de 10 ml de 100 mg / ml de cetamina e 2,5 ml de 20 mg / ml de xilazina em 37,5 ml de 1x PBS para uma concentração final de 20 mg / ml de cetamina e 4 mg / ml de xilazina.
4. Prepara-se uma solução de 0,5% de cloridrato de proparacaína (para analgesia tópica) por dissolução de 500 mg de cloridrato de proparacaína, em 100 ml de PBS filtrado.
5. Prepare 1x PBS por dissolução de 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na ₂ HPO _4, e 0,23 g de NaH ₂ PO _4, em 900 ml de _H2O destilada Ajustar o pH para 7,4. Levar a solução para um volume final de 1000 ml com _H2O destilada e filtro para garantir a esterilidade.
6. Preparar 1000 x soluções de estoque de SAHA em ~ 100 mM em dimetil-sulfóxido (DMSO) por dissolução de 26,4 mg de SAHA em 1 ml de DMSO. Dilui-se a um 1x (~ 10 mM)solução filtrada em PBS por cada utilização. Armazene a solução de reserva, a -20 ° C durante até um mês. CUIDADO: DMSO é uma toxina conhecida e mutagênico.
7. Prepara-se uma solução de 4% de paraformaldeído (PFA) para fixação. Dentro de uma câmara química, dissolver 4 g de PFA em 90 ml de PBS. Levar a mistura até 65 ° C e a titulação para um pH de 7,4. Uma vez que o PFA tem dissolvido, levar a solução a um volume final de 100 ml. Armazenar a 4 ° C por até um mês. CUIDADO: PFA é um conhecido por ser alergênico, cancerígeno e tóxico.
8. Preparar tampão de bloqueio por diluição 1x 5 ml de soro de cabra e de 500 ul de Triton X-100 em 94,5 ml de PBS.
9. Preparar tampão de lavagem 1x diluindo 500 ul de Triton X-100 em 99,5 ml de PBS.

2. Alkali-Burn Tratamento de Lesões e Composto

1. Molhe um pedaço redondo de papel de filtro, ~ 2 mm de diâmetro, em uma solução de NaOH 1 M.
2. Anestesiar o rato com uma injeção de 100 mg / kg de ketamina e 5 mg / kg de xilazina, which é ~ 100 l do cocktail anestésico do passo de 1,3 por 25 g mouse. A anestesia deve tomar ~ 1-2 min para definir polegadas de profundidade da anestesia pode ser determinado comprimindo suavemente o dedo do pé ou da cauda do animal, se a anestesia for suficiente deve haver nenhuma resposta. Nota: Cuidados devem ser tomados para garantir o mouse não sucumbir à hipotermia induzida anestesia.
3. A utilização de um conta-gotas, aplicar topicamente uma gota de cloridrato de proparacaína a 0,5% sobre a superfície da córnea para analgesia local.
4. Utilizando uma pinça estéril, pegar um pedaço de papel de filtro embebido NaOH. Se você notar excesso de NaOH ou agarrando-se a pingar do papel de filtro, toque brevemente o papel de filtro embebido em um pedaço de papel de filtro seco para absorver o excesso. Coloque o pedaço de papel de filtro embebido NAOH na córnea central. Deixá-lo por 30 segundos para gerar um álcali-queimadura aguda de ~ 2 x 2 mm ² de área. Um microscópio cirúrgico é útil para colocar adequadamente o papel de filtro. Nota: Apenas um olho do rato should ser feridos com o outro serve como um controlo.
5. Remover o papel de filtro. Usando uma seringa de 10 ml, lavar cuidadosamente o olho com 10 ml de PBS 1x duas vezes para lavar o resíduo de NaOH 1 M.
6. Imediatamente aplicar uma gota de solução de trabalho de 1 x SAHA (ou um controlo de veículo que consiste em PBS diluídas contendo DMSO sem SAHA) topicamente para a córnea. Repita 3x/dia pedido de 14 dias. Nota: durante este período uma pomada antibiótica tópica não é recomendado, pois pode interferir com o desenvolvimento da lesão e da entrega do composto. Usar uma solução de antibiótico líquido, solução de gentamicina, tal como 3%, em vez disso.
7. Vá diretamente para Avaliação Clínica (Protocolo 3 abaixo) ou sacrificar o mouse e enuclear os olhos por córnea plana de montagem (Protocolo 4 abaixo) ou parafina / histologia congelado convencional.

3. Avaliação Clínica

1. Executar um exame diário dos ratinhos de forma cega sob o microscópio cirúrgico e marcar corneal NV baseado na opacidade da córnea, NV, e tamanho do vaso. Use pelo menos dois observadores e gravar um escore final que é a média dos dois.
   1. Pontuação opacidade da córnea em uma escala de 0-4. 0 = completamente claras; 1 = um pouco obscuro, íris ea pupila facilmente visível; 2 = ligeiramente opacos, íris ea pupila ainda detectável; 3 = opacos, alunos dificilmente detectáveis; e 4 = totalmente opacos, sem vista do aluno.
   2. Pontuação NV numa escala de 0-3. 0 = sem neovasos; 1 = neovasos no limbo da córnea; 2 = neovasos que medem o limbo da córnea e se aproximando do centro da córnea; 3 = neovasos abrangendo o centro da córnea.
   3. Pontuação tamanho do vaso em uma escala de 0-3. 0 = sem neovasos; 1 = neovasos detectáveis ​​ao microscópio cirúrgico; 2 = neovasos facilmente vistos ao microscópio cirúrgico; 3 = neovasos facilmente visto sem o microscópio.
2. Usando uma câmera digital, tirar fotos representativas do olho em 7 dias e 14 dias.

4.Corneal Coloração e planas Mounts

1. Fix olho enucleado em PFA a 4% durante pelo menos 1 hora a 4 ° C.
2. Transfira o olho para 1x PBS e utilize uma pinça para remover cuidadosamente o excesso de tecido.
3. Com o auxílio de um microscópio cirúrgico, usar uma agulha (18 gauge) ou micro-faca para perfurar a região pericorneal do olho (Atenção: este deve liberar líquido do olho).
   1. A partir da perfuração feita na secção 4.3.1 usar um par de tesouras cirúrgicas para cortar a porção anterior do olho (córnea) a partir da porção posterior.
4. Transferir a córnea para trás em PFA a 4% para a fixação durante a noite a 4 ° C.
5. Descarte a 4% PFA (ATENÇÃO: PFA é perigoso e deve ser eliminado de acordo com as normas institucionais) e enxaguar a córnea três vezes com PBS 1x de remover qualquer PFA residual.
6. Incubar em 1x tampão de bloqueio durante, pelo menos, 2 horas à temperatura ambiente, para permeabilizar o tecido e impedir a ligação inespecífica do anticorpo primário.
   1. Aplicar o anticorpo primário em tampão de bloqueio 1x, a uma diluição de dobragem 100-500. (Por exemplo, rato anti-mouse-PECAM-1 para a detecção de vasos sanguíneos a 1:100, coelho anti-rato-lyve-1 para a detecção de vasos linfáticos em 1:500, e / ou anti-mouse-F4/80 rato para a detecção de macrófagos a 1:100). Incubar a 4 ° C durante a noite.
   2. Lavar seis vezes com 1x tampão de lavagem durante 1 hora de cada vez, à temperatura ambiente para remover totalmente o anticorpo primário não ligado.
   3. Aplicar um anticorpo secundário em 1x tampão de bloqueamento, a uma diluição de dobragem 500-1.000. (Por exemplo, uma lâmpada fluorescente de 488 nm com etiquetas de cabra anti-rato-IgG em 1:800 ou fluorescente 594 nm com etiquetas de cabra anti-coelho-IgG de 1:800). Incubar a 4 ° C durante a noite.
   4. Lavar três vezes com 1x PBS, durante 1 h cada, à temperatura ambiente para remover completamente o anticorpo secundário não ligado.
7. Transferir a córnea em fresco 1x PBS e, com o auxílio de um microscópio cirúrgico, cuidadosamente fazer quatro incisões da periferia para o center. Isso deve dividir a córnea em quatro quadrantes de tamanho aproximadamente igual (a forma resultante deve ser um pouco como uma borboleta) e deixe-o deitado em um slide.
8. Monte com um apropriado meio de montagem para a imagem latente fluorescente. Para melhores resultados, as amostras devem ser fotografada imediatamente e fotografias digitais feita, mas pode ser conservada durante várias semanas, ao abrigo da luz a 4 ° C.

Resultados

Após lesão alcalino-queimadura, NV córnea ocorre em, dependente do tempo de forma previsível. Figura 1 demonstra a diferença gritante tanto na neovascularização e opacidade da córnea entre um animal não tratado (Figura 1A) e de um animal tratado com o inibidor de HDAC SAHA (Figura 1B ) no ponto de tempo de 7 dias.

As Figuras 2A e 2B mostram uma montagem plana da córnea de um olho de controlo não t...

Discussão

O protocolo aqui apresentado resulta em níveis reprodutíveis de hemangiogenesis, lymphangiogenesis e inflamação, tornando-se um sistema ideal para estudar estes três processos (inter-relacionadas). Enquanto este método produz NV córnea centralizado, vários métodos que foram desenvolvidos para causar mais direcionado NV, ou seja, a sutura da córnea ¹⁷ e implantados do fator de crescimento expressando pelotas ^18, também pode ser do seu interesse. Nosso protocolo é projetado para uso no ra...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Syringe	BD	309659
18 Guage Needle	BD	305918
10 mL Syringe	BD	306575
25 Guage Needle	BD	305916
Anti-F4/80 (rat anti-mouse)	AbD Serotech	MCA497RT
Anti-LYVE-1 (rabbit anti-mouse)	Abcam	ab14917
Anti-PECAM-1 (rat anti-mouse)	BD	553370
Anti-IgG Alexa488 (goat anti-rat)	Invitrogen	A11006
Anti-IgG Alexa594 (goat anti-rabbit)	Invitrogen	A11012
Camera	Tucsen	TCC 5.0 ICE
Coverslips	Fisher	12-548-B
DMSO	Sigma	D4540-1L	Caution: Mutagenic, Toxic
Forceps (Blunt), Iris	WPI	15915
Forceps (Sharp), Dumont #4	WPI	500340
KCl	Fisher	P217-500
Ketamine Solution	MedVet	RXKETAMINE	Controlled substance, proper license required for use.
Light Source for Microscope	AmScope	LED-14M-YA
Microscope (Stereo 7X-45X)	AmScope	SM-1B
Mounting Medium, Vectashield	Vector	H-1000
NaCl	Fisher	S271-10
NaH2PO4	Fisher	S397-500
NaOH	Fisher	S318-1	Caution: Corrosive
Paraformaldehyde		P6148-500G	Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic
Proparacaine Hydrochloride	Sigma	P4554-1G
Scissors (5mm blade), Vanas	WPI	14003
Goat Serum	MPBio	92939249
Microscope Slides	Fisher	12-550-15
Triton X-100	Sigma	T8787-100ML
Whatman Grade 1 Filter Paper	Whatman	1001-6508
Xylazine Solution	MedVet	RXANASED-20