마우스의 각막 신생 혈관의 알칼리 화상 상해 모델

요약

각막의 혈관 신생 (NV)는 여러 시각 병리를 복잡하게 할 수 있습니다. 제어, 알칼리 화상을 입지 모델을 활용, 각막 NV의 정량화 수준은 신생 혈관 질환에 대한 잠재적 인 치료의 각막 NV 및 평가의 기계 론적 연구를 위해 생성 될 수있다.

초록

정상적인 조건 하에서, 각막은 무 혈관이며,이 투명도가 양호한 시력을 유지하는데 필수적이다. 외상, 각막 또는 감염성 질병에 의해 야기 될 수있는 각막의 혈관 신생 (NV)은 각막의 소위 '혈관 신생 특권'분해 심지어 실명을 초래할 수있는 다수의 카메라 병리 기초를 형성한다. 사용할 수있는 여러 가지 치료 방법이 있지만, 각막 신생 혈관 병변에 의해 제공되는 기본적인 의료 필요 충족 남아있다. 안전하고, 효과적이며 타겟 요법을 개발하기 위하여, 각막 NV 및 약리학 적 개입의 안정적인 모델이 요구된다. 여기서, 우리는 마우스에서 알칼리 화상을 입지 각막 혈관 신생 모델을 설명한다. 이 프로토콜은 각막, 또한 약리학 화합물을 투여하고, 그 결과의 시각화를 제어 알칼리 화상 손상의 애플리케이션에 대한 방법을 제공한다. 이 방법은 계장 증명할 수탈 각막 NV 및 기타 신생 혈관 질환에 개입 메커니즘 기회를 공부.

서문

각막 실명 모든 경우 ^(1)의 약 4 %에 대한 책임이 실명의 네 번째 가장 흔한 원인이다. 각막 신생 혈관 (NV)가 포진 각막염 (웨스트에서 실명의 주요 감염 원인)와 트라코마 (전세계 전염성 실명의 주요 원인) ^2를 포함하여 이러한 병리의 많은에 중요한 역할을한다. 현재 치료는 스테로이드, 비 스테로이드 성 항 염증성 약물 (NSAIDs), 항 VEGF 치료, 및뿐만 아니라 기존의 또는 레이저 수술 기법 ³ 시클로 스포린 (가) 있습니다. 그러나 각막 NV 기반 병리의 심한 쇠약 자연, 수술 각막 NV 치료를 할 수있는 시설, 강력하게 수행하는 약리 옵션의 부족의 소수는, 현존하는 치료에도 불구하고, 기본적인 의료 필요를 그 결론을 내릴 수있는 최근의 전문가 원탁 회의를 주도 이러한 병리 제시는 ⁴ 충족 남아있다.

인간의 각막5 층, 3 층 세포 (상피, 각막 내피 세포)와 2 인터페이스 (보우만 막과 데스 메 막)으로 구성되어 있습니다. 그것은 눈을위한 기계적인 장벽과 굴절 표면으로 작동합니다. 그것의 투명한 자연의 구성 요소의 미묘한 균형의 결과이며 적절한 기능 ^5에 필수적이다. 일반적으로 무 혈관, 각막은 섬모와 안과 동맥에서 공급되는 바깥 쪽 가장자리를 따라 실행 미세 혈관에서 혈액을 받는다. 자극이 그들을 각막의 중심을 향해 성장하고, 따라서 비전 ^6을 제한 할 수 있도록 이러한 혈관의 혈관 신생을 촉진 할 때 각막 NV가 발생합니다. 각막 신생 혈관이 각막의 중심을 향해 윤부 혈관 아케이드에서 혈관과 림프 혈관의 증식을 초래할하는 hemangiogenesis과 림프관을 포함한다. 이것은 각막 "혈관 특권", 각막 혼탁 및 섬유증의 증가, 각막 라의 중단의 고장에 이르게yers를, 부종 ^7. 각막 NV의 정확한 트리거는 기존의 의약품, 산업용 화학 물질, 또는 화학 요원 전쟁의 원인이 전염성 질병에 대한 응답에서 이러한 결막염과 같​​은 화학적으로 유도 된 상태에 이르기까지, 수많은 있습니다.

이 과정의 분자 메커니즘은 아직 완전히 특징으로하지 않습니다; 그러나, 몇 가지 주요 선수가 확인되었습니다. 정상적인 조건에서 각막 (예 : 수용성 VEGF-R1과 같은) 항 혈관 신생 인자 ^(8)의 중복 배열에 의해 유지되는 고유 한 '혈관 신생 특권'을 가지고 있습니다. 그러나, (예컨대 부상 등) 외부 자극에 응답하여, 친 혈관 생성 인자 (예를 들어 VEGF-A)의 로컬 상향 조절이있을 것이다. 이 팁 각막의 혈관 신생 권한을 기초, 따라서 각막 병리, 심지어 실명 ⁹ 일으키는 hemangiogenesis, lymphangeogenesis, 염증에 이르게 프로 및 항 혈관 신생 인자의 균형.

이 매우 쇠약 병리의 충족 의료 필요 감안할 때, 그것은 각막 NV의 신뢰할 수있는 동물 모델을 가지고 현장에 관심입니다. 제어 알칼리 화상을 입지 : 여기에서 우리는 같은 모델을 제시한다. 필터 종이 반지를 사용하여 기반의 다양한 눈 부상 모델은 1970 년대 ¹⁰ 년부터 사용되어왔다. 1989 년에, 하버드 의과 대학의 안과의 그룹은 수산화 나트륨 (NaOH를) 원형 필터 종이를 담글 및 특정 범위의 각막에 적용을 기반으로 토끼 각막 알칼리 화상 손상의 표준 모델을 특성화 농도 ^11. 그 이후로,이 기술은 마우스 ^12-14에서 사용하기 위해 적응되어있다. 최근, 왕 연구소는 마우스 각막 알칼리 화상을 입지 모델 ^(15)를 사용하여 각막 NV의 병인에서 히스톤 탈 아세틸 화 효소 (HDAC) 억제제 SAHA의 치료 효과를 연구했다. 여기에 제시된 마우스 각막 알칼리 화상을 입지 모델의 방법론은 내장 된주로 두 가지 다른 논문 ^{(14, 16)의} 사전 작업에.

프로토콜

참고 : 다음 프로토콜과 대표적인 결과는 예를 들어 화합물로 HDAC 억제제 SAHA를 사용합니다. 그러나이 프로토콜은 SAHA의 사용에 한정되는 것은 아니다, 각막 신생 혈관에 수용성 화합물의 효과를 테스트하는 일반적인 방법으로서 추천된다. 약간의 수정은 희석의 정도뿐만 아니라 주파수와 응용 프로그램의 기간 동안 할 필요가있을 것이다. 또한, 물에 쉽게 용해되는 화합물은 DMSO의 부재로 투여 될 수있을 것입니다.

윤리 정책 : 모든 동물 실험은 국가의 법률과 제도 규정에 따라 수행되어야한다. 이 프로토콜은 툴레 인 대학 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 사용이 승인되었다.

1. (사용 순으로) 재료의 제조

1. 2mm 원에 셀룰로오스 종이 필터 (11 μM)의 조각을 잘라.
2. 로 NaOH를 1 M 용액을 준비500 ㎖의 증류수 H ₂ O.에서의 NaOH 20g을 용해 상온에서 보관. 주의 : 수산화 나트륨 용액은 부식성 알칼리 화상을 입을 수 있습니다.
3. 최종 20 ㎎ / ㎖ 마취제의 농도와 4 ㎎ / ㎖ 자일 라진에 1X PBS의 37.5 ㎖에 20 ㎎ / ㎖ 자일 라진의 10 ~ 100 ㎎ / ㎖ 케타민 ㎖ 및 2.5 ㎖에 희석하여 마취 칵테일을 준비합니다.
4. 여과 PBS 100 ㎖의 proparacaine 염산염 500mg을 용해하여 (국소 마취를 위해) proparacaine 염산염의 0.5 % 용액을 준비한다.
5. 8g의 NaCl, 0.2 g의 KCl, 1.44 g 나 ₂ HPO _{4 및} 증류 H ₂ O. 900 ml 중의 NaH ₂ PO ₄ 0.23 g을 용해하여 1X PBS를 준비 7.4 pH로 조정합니다. 멸균을 위해 증류수 H ₂ O 필터 및 1000 ㎖의 최종 부피로 용액을 가져온다.
6. DMSO의 1 ml의 SAHA의 26.4 mg의 용해하여 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 ~ 100 ㎜에서 SAHA의 1,000 X 스톡 용액을 준비한다. 1X로 희석 (~ 10 μM)각 사용에 대한 필터링 된 PBS 용액. 최대 한 달 동안 -20 ° C에서 원액을 저장합니다. 주의 : DMSO 알려진 독소와 돌연변이입니다.
7. 고정 용 파라 포름 알데히드 (PFA)의 4 % 용액을 준비합니다. 화학 후드, PBS 90 ㎖에 PFA 4 g을 용해. 65 ° C에 혼합물을 가지고, 7.4의 pH를 적정한다. PFA가 용해되면, 100 ㎖의 최종 부피로 용액을 가져온다. 최대 한 달 동안 4 ° C에 보관하십시오. 주의 : PFA는, 극성 발암 성, 독성 것으로 알려져.
8. PBS의 94.5 ㎖에 염소 혈청 5 ㎖ 및 트리톤 X-100의 500 UL를 희석하여 1X 차단 버퍼를 준비합니다.
9. PBS의 99.5 ㎖의 트리톤 (Triton) X-100의 500 UL를 희석하여 1X 세척 버퍼를 준비합니다.

2. 상해 및 화합물 처리에게 알칼리 굽기

1. 1 M의 NaOH 용액에, 직경 여과지의 원형 조각, 1 ~ 2 밀리미터를 적시십시오.
2. 뭐, 100 ㎎ / ㎏의 케타민 (ketamine)과 5 ㎎ / ㎏ 자일 라진 주사로 마우스를 마취무형 문화 유산은 ~ 25g 마우스 당 1.3 단계에서 마취 칵테일의 100 μL이다. 마취는 마취는 응답이 없어야합니다 충분한 지, 부드럽게 동물의 발가락이나 꼬리를 곤란에 의해 결정될 수있다 ~ 마취의 깊이 안으로 설정 1 ~ 2 분 정도 소요됩니다. 참고 : 관리는 마우스가 마취 유도 저체온증에 굴복하지 않도록주의해야한다.
3. 스포이드를 사용하여 국소 지방 진통제 위해 각막 표면에 0.5 % proparacaine 염산염의 저하를 적용한다.
4. 멸균 집게를 사용하여, NaOH를 적신 여과지의 조각을 선택합니다. 당신이 초과 된 NaOH에 집착하거나 여과지에서 떨어지는 통지하는 경우, 간단히 과잉을 흡수하는 필터 종이의 건조 조각에 적신 종이 필터를 누릅니다. 중심 각막에 NAOH 적신 여과지의 조각을 놓습니다. 지역에서 ~ 2 × 2mm ^2의 급성 알칼리 화상을 생성하기 위해 30 초를 남겨주세요. 수술 현미경 제대로 종이 필터를 배치에 도움이됩니다. 참고 : 마우스의의 하나의 눈을해야할 것은 다른 컨트롤로 봉사와 부상을 입을 수.
5. 필터 용지를 제거합니다. 10 ML의 주사기를 사용하여 부드럽게 잔여 1 M NaOH를 씻어 두 번 1X PBS 10 mL로 눈을 세척하십시오.
6. 즉시 1X SAHA 작업 용액 (또는 PBS로 구성된 차량 제어가 더 SAHA를 포함하지 DMSO를 희석) 국소 적 각막에 한 방울을 적용합니다. 14 일 동안 프로그램 3x/day를 반복합니다. 참고 : 부상의 개발과 화합물의 전달을 방해 할 수 있으므로이 기간 동안 국소 항생제 연고는 사용하지 않는 것이 좋습니다. 액체 항생제 용액과 같은 3 % 겐타 마이신 용액을 대신 사용합니다.
7. 임상 평가 (아래 프로토콜 3)로 직접 이동하거나 마우스를 희생 (아래 프로토콜 4) 또는 기존의 파라핀 / 냉동 조직 검사 각막 평면 마운트의 눈을 명백히하다.

3. 임상 평가

1. 수술 현미경으로 눈을 멀게 방식으로 마우스의 일일 검사를 수행하고 C 점수orneal NV는 각막 혼탁, NV, 및 선박의​​ 크기에 따라. 적어도 두 관찰자를 사용하고이 평균이다 최종 점수를 기록한다.
   1. 0-4의 규모에 각막 혼탁 점수. 0 = 완전 지우기; 1 = 약간 불투명, 홍채와 동공을 쉽게 볼 수; 2 = 약간 불투명, 홍채와 동공 여전히 감지; 거의 감지 3 = 불투명, 학생; 동공없이 볼 수있는 완전히 불투명 4 =.
   2. 0-3의 규모에 NV 점수. 0 = neovessels; 각막 윤부에서 1 = neovessels; 각막 윤부에 걸쳐 각막 중심 접근 2 = neovessels; 각막 중심에 걸친 3 = neovessels.
   3. 0-3의 규모에 선박의 크기를 점수. 0 = neovessels; 수술 현미경으로 검출 1 = neovessels; 쉽게 수술 현미경으로 본 2 = neovessels; 쉽게 현미경없이 볼 3 = neovessels.
2. 디지털 카메라를 사용하여, 7 일, 14 일에 눈을 대표하는 이미지를 가지고.

4.각막 염색 및 평면 마운트

1. 4 ℃에서 최소 1 시간 동안 4 % PFA의 탈핵 눈 수정
2. PBS를 1 배에서주의 깊게 초과 조직을 제거하는 집게를 사용하여 눈을 전송합니다.
3. 수술 현미경의 도움으로 (이 눈에서 유체를 해제해야합니다주의) 눈의 pericorneal 지역을 관통하는 바늘 (18 게이지) 또는 마이크로 칼을 사용합니다.
   1. 4.3.1에서 만든 천공의 뒤 부분에서 눈 (각막)의 앞쪽 부분을 절단하는 수술 가위를 사용합니다.
4. 4 ℃에서 하룻밤 고정에 다시 4 % PFA로 각막을 전송
5. (: PFA는 위험 및 기관 규정에 따라서 처리 할 것주의)와 잔여 PFA를 제거하는 1X PBS로 각막을 세 번 씻어 4 % PFA를 폐기하십시오.
6. 조직을 투과하고 차 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위해, 실온에서 적어도 2 시간 동안 1X 블로킹 완충액 부화.
   1. 100 ~ 500 배 희석시, 1X 차단 버퍼에 차 항체를 적용합니다. 1:100에서 혈관을 검출하기위한 (예를 들어 쥐의 항 - 마우스-PECAM-1, 토끼 항 - 마우스 LYVE-1 식세포를 검출 1:500에서 림프관을 검출 및 / 또는 래트 anti-mouse-F4/80위한 1:100에서). 4 ° C에서 하룻밤 배양한다.
   2. 완전히 언 바운드 일차 항체를 제거하기 위해 실온에서 1 시간 동안 1X 세척 버퍼마다 여섯 번 씻으십시오.
   3. 1X는 500 ~ 1,000 배 희석에 버퍼를 차단에 차 항체를 적용합니다. (예를 들어, 488 nm의 형광은 1:800에서 염소 항 - 쥐 IgG의 태그 또는 594 nm의 형광은 1:800에서 염소 항 - 토끼 IgG의 태그). 4 ° C에서 하룻밤 배양한다.
   4. 완전히 언 바운드 차 항체를 제거하기 위해 실온에서 1 시간마다 1X PBS로 3 회 세척한다.
7. 신선한 1X PBS로 각막을 전송하고, 수술 현미경의 도움으로 조심스럽게 %를 향해 주변에서 4 절개을어. 이 (결과 모양이 아니라 나비처럼한다) 약 동일한 크기의 네 개의 사분면으로 각막을 나누어 슬라이드에 평평하게 거짓말을 할 수 있도록해야합니다.
8. 형광 이미징을위한 설치 매체 적절한으로 마운트합니다. 최상의 결과를 위해, 샘플은 즉시 군데해야하며, 디지털 사진 촬영,하지만 4 ℃에서 빛으로부터 보호 몇 주 동안 저장 될 수있다

결과

알칼리 화상 부상 후 각막 NV는 예측 가능한 시간에 의존하는 방식으로 발생합니다. 1 처리되지 않은 동물 (그림 1A)와 HDAC 억제제 SAHA (그림 1B로 치료 동물 사이에 신생 혈관 및 각막 혼탁 모두에서 뚜렷한 차이를 보여줍니다 그림 ) 7 일간 시점에서.

도 2a 및도 2b는 기본 PECAM-1과 LYVE-1 염색 및 보조 알렉사 플 루어 4...

토론

여기에 제시된 프로토콜은 이러한 세 가지 (상호) 과정을 연구하는 이상적인 시스템 만들기, hemangiogenesis, 림프관, 염증의 재현 수준의 결과. 이 방법은 중앙 각막 NV, 펠렛 ^(18)을 표현하는 성장 인자를 각막 ^(17), 즉 봉합 더 감독 NV을 유발하기 위해 개발하고 이식 된 여러 가지 방법을 생성하는 동안, 또한 관심이있을 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 또한 더 큰 포유 동물에 대한 아?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Syringe	BD	309659
18 Guage Needle	BD	305918
10 mL Syringe	BD	306575
25 Guage Needle	BD	305916
Anti-F4/80 (rat anti-mouse)	AbD Serotech	MCA497RT
Anti-LYVE-1 (rabbit anti-mouse)	Abcam	ab14917
Anti-PECAM-1 (rat anti-mouse)	BD	553370
Anti-IgG Alexa488 (goat anti-rat)	Invitrogen	A11006
Anti-IgG Alexa594 (goat anti-rabbit)	Invitrogen	A11012
Camera	Tucsen	TCC 5.0 ICE
Coverslips	Fisher	12-548-B
DMSO	Sigma	D4540-1L	Caution: Mutagenic, Toxic
Forceps (Blunt), Iris	WPI	15915
Forceps (Sharp), Dumont #4	WPI	500340
KCl	Fisher	P217-500
Ketamine Solution	MedVet	RXKETAMINE	Controlled substance, proper license required for use.
Light Source for Microscope	AmScope	LED-14M-YA
Microscope (Stereo 7X-45X)	AmScope	SM-1B
Mounting Medium, Vectashield	Vector	H-1000
NaCl	Fisher	S271-10
NaH2PO4	Fisher	S397-500
NaOH	Fisher	S318-1	Caution: Corrosive
Paraformaldehyde		P6148-500G	Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic
Proparacaine Hydrochloride	Sigma	P4554-1G
Scissors (5mm blade), Vanas	WPI	14003
Goat Serum	MPBio	92939249
Microscope Slides	Fisher	12-550-15
Triton X-100	Sigma	T8787-100ML
Whatman Grade 1 Filter Paper	Whatman	1001-6508
Xylazine Solution	MedVet	RXANASED-20