פגיעה דגם אלקלי לשרוף של הקרנית neovascularization בעכבר

Summary

Neovascularization (NV) של הקרנית יכול לסבך פתולוגיות חזותיות מרובות. ניצול מודל פציעה מבוקרת, אלקלי צריבה, רמת כימות של NV בקרנית יכולה להיות מיוצרת למחקר מכניסטית של NV והערכה של קרנית של טיפולי פוטנציאל להפרעות neovascular.

Abstract

בתנאים רגילים, הקרנית היא avascular, והשקיפות הזאת היא חיונית לשמירה על חדות ראייה טובה. Neovascularization (NV) של הקרנית, אשר יכול להיגרם על ידי טראומה, keratoplasty או מחלות זיהומיות, מפרק את 'זכות angiogenic' מה שנקרא של הקרנית ומהווה את הבסיס של פתולוגיות חזותיות מרובות שאף עלול להוביל לעיוורון. למרות שיש כמה אפשרויות טיפול זמינות, הצורך הרפואי המהותי שהוצג על ידי פתולוגיות neovascular קרנית נותר לא מסופק. על מנת לפתח טיפולים בטוחים, יעילים, וממוקד, נדרש מודל אמין של NV בקרנית והתערבות תרופתית. כאן, אנו מתארים מודל neovascularization קרנית פציעת אלקלי כווייה בעכבר. פרוטוקול זה מספק שיטה ליישום של פציעת אלקלי כווייה מבוקרת לקרנית, המנהלה של מתחם תרופתי של ריבית, ויזואליזציה של התוצאה. שיטה זו יכולה להוכיח instrumenטל לחקר המנגנונים וההזדמנויות להתערבות בNV בקרנית והפרעות neovascular אחרות.

Introduction

עיוורון של קרנית הוא הסיבה הרביעית הנפוצה ביותר של עיוורון, אחראית לכ -4% מכל מקרי ^1. neovascularization קרנית (NV) משחק תפקיד משמעותי בהרבה של מחלות אלו, כוללים קרנית herpetic (הסיבה זיהומית המובילה לעיוורון בעולם המערבי) וגרענתי (הסיבה המובילה לעיוורון בעולם זיהומיות) ^2. טיפולים שוטפים כוללים סטרואידים, תרופות נוגדות דלקת לא סטרואידיות (NSAIDs), טיפולים אנטי VEGF, וציקלוספורין, כמו גם טכניקות כירורגיות קונבנציונליות או לייזר ^3. עם זאת, האופי קשה מתיש של פתולוגיות NV מבוסס הקרנית, המחסור במתקנים כירורגית מסוגלים לטפל NV בקרנית, וחוסר אפשרות תרופתית חזק ביצוע הוביל שולחן עגול מומחה האחרון למסקנה כי, למרות הטיפולים הקיימים, הצורך הרפואי המהותי שהוצג על ידי פתולוגיות אלה נותר ללא מענה ^4.

הקרנית האנושיתמורכב 5 שכבות, 3 שכבות סלולריות (אפיתל, סטרומה ואנדותל) וממשק 2 (קרום באומן וקרום Descemet). הוא מתפקד כמחסום מכאני ופני שטח שבירה לעין. הטבע השקוף שלה הוא התוצאה של איזון עדין של מרכיביו, והוא חלק בלתי נפרד מהתפקוד הנכון שלה ^5. בדרך כלל avascular, הקרנית מקבלת דם מmicrovessels רץ לאורך הקצה החיצוני שלה, אשר מוזנים מהריסים ועורקי עיניים. קרנית NV מתרחש כאשר גירוי מקדם אנגיוגנזה של הכלים האלה מאפשר להם לצמוח לכיוון המרכז של הקרנית ובכך להגביל את הראייה ^6. אנגיוגנזה בקרנית כוללת hemangiogenesis וlymphangiogenesis, אשר תוצאת ingrowth של כלי דם וכלי הלימפה מארקייד כלי דם limbal לכיוון המרכז של הקרנית. זה מוביל להתמוטטות של "זכות angiogenic" קרנית, גידול באטימות וסיסטיק קרנית, שיבוש לה קרניyers, ובצקת ^7. הגורמים המדויקים של NV בקרנית הם רבים, החל מתגובה למחלה זיהומית כגון גרענת למצב כימי שגרם גרמו לתרופות מסורתיות, כימיקלים תעשייתיים, או חומרי לחימה כימיים אפילו.

המנגנונים המולקולריים של תהליך זה אינם, עדיין, מאופיין במלואו; עם זאת, כמה שחקני מפתח זוהו. בתנאים רגילים הקרנית בעל "זכות angiogenic" ייחודית ומתוחזק על ידי מערך יתיר של גורמים אנטי angiogenic (כגון VEGF-R1 מסיס) ^8. עם זאת, בתגובה לגירוי חיצוני (כגון פציעה), יהיה גברת ביטוי מקומית של גורמים פרו angiogenic (למשל VEGF-A). טיפים זה האיזון של גורמים פרו ואנטי angiogenic שבבסיס זכות angiogenic של הקרנית, ומוביל לhemangiogenesis, lymphangeogenesis, ודלקת, ולכן גורם לפתולוגיה בקרנית ואפילו עיוורון ^9.

<כיתת p = "jove_content"> בהתחשב בצורך הרפואי קיים לפתולוגיה המתישה מאוד, יש בו עניין לשדה יש ​​מודל חיה אמין של NV בקרנית. כאן אנו מציגים מודל כזה: פציעת אלקלי כווייה מבוקרת. מודלים עין פציעה שונים המבוססים על שימוש בטבעות נייר סינון שימשו מאז 1970s ^10. ב1989, קבוצה של רופאי עיניים בית הספר לרפואה של הרווארד מאופיין מודל סטנדרטי של פציעת אלקלי כווייה בקרנית מרכזית בארנב המבוסס על השריית פיסת נייר סינון עגול עם נתרן הידרוקסידי (NaOH) וליישם אותו לקרנית בטווח מסוים של ריכוזים ^11. מאז, טכניקה זו הותאמה לשימוש ^ב12-14 העכבר. לאחרונה, המעבדה וואנג חקרה את ההשפעות הטיפוליות של deacetylase היסטון (HDAC) מעכב סח"ה בפתוגנזה של NV בקרנית תוך שימוש במודל עכבר של קרנית אלקלי לשרוף פציעה ^15. המתודולוגיה של מודל עכבר קרנית אלקלי לשרוף פציעה שהוצג כאן נבנתהבעיקר על עבודתו המוקדמת של שני עיתונים אחרים ^14,16.

Protocol

הערה: הפרוטוקול הבא ותוצאות נציג להשתמש במעכבי HDAC סח"ה כתרכובת ירושלים. עם זאת, פרוטוקול זה הוא בשום אופן לא מוגבל לשימוש של סאהה, והוא מומלץ כשיטת כללית כדי לבחון את ההשפעה של תרכובות מסיסים בneovascularization קרנית. שינויים קלים יצטרכו להתבצע למידת הדילול כמו גם תדירות ומשך זמן של יישום. בנוסף, תרכובות כי הם בקלות מסיסה במים יוכלו להינתן בהעדר DMSO.

הצהרה אתית: יש לבצע את כל הניסויים בבעלי החיים רק בציות לחוק הלאומי ותקנות מוסדיות. פרוטוקול זה אושר לשימוש על ידי אוניברסיטת טוליין מוסדית טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש.

1. הכנת החומרים (לפי סדר שימוש)

1. חותכי פיסת נייר תאית מסנן (11 מיקרומטר) לתוך 2 עיגולי מ"מ.
2. הכן פתרון M 1 של NaOH ידיהמסת 20 גרם של NaOH ב500 מיליליטר H ₂ O. מזוקק לאחסן בטמפרטורת חדר. זהירות: פתרונות NaOH הם מאכל ויכולים לגרום לכוויות אלקלי.
3. הכן קוקטייל הרדמה על ידי דילול 10 מיליליטר של 100 מ"ג / מיליליטר קטמין ו2.5 מיליליטר של 20 מ"ג / מיליליטר בxylazine 37.5 מיליליטר של 1x PBS לריכוז סופי של 20 מ"ג / מיליליטר קטמין ו -4 מ"ג / מיליליטר xylazine.
4. הכן פתרון 0.5% מhydrochloride proparacaine (לשיכוך כאבים אקטואליים) על ידי המסת 500 מ"ג hydrochloride proparacaine בשל PBS המסונן 100 מיליליטר.
5. הכן PBS 1x ידי המסת 8 גרם NaCl, 0.2 גרם של KCl, 1.44 גרם Na ₂ HPO _4, ו0.23 גרם לאא ₂ PO ₄ ב900 מיליליטר של מזוקקי H ₂ O. התאם ל7.4-pH. תביא את הפתרון לנפח סופי של 1,000 מיליליטר עם מזוקקי H ₂ O וסינון על מנת להבטיח סטריליות.
6. הכן פתרונות מניות 1,000 x של סח"ה ב ~ 100 מ"מ בsulfoxide דימתיל (DMSO) על ידי המסת 26.4 מ"ג סח"ה ב 1 מיליליטר של DMSO. מדולל ל1x (~ 10 מיקרומטר)פתרון ב-PBS המסונן לכל שימוש. אחסן את פתרון המניות ב -20 ° C עד חודש אחד. זהירות: DMSO הוא רעלן וmutagen ידועים.
7. הכן פתרון 4% מparaformaldehyde (PFA) לקיבעון. מתחת למכסת מנוע כימי, לפזר 4 גרם של PFA ב90 מיליליטר של PBS. להביא את התערובת ל65 מעלות צלזיוס ולכייל לpH של 7.4. ברגע שPFA נמס, להביא את הפתרון לנפח סופי של 100 מיליליטר. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש. זהירות: PFA הוא ידוע להיות אלרגניים, מסרטנים, ורעיל.
8. הכן מאגר חסימת 1x ידי דילול 5 מיליליטר של סרום עז ו500 ul של טריטון X-100 ל94.5 מיליליטר של PBS.
9. הכן כביסה חיץ 1x ידי דילול 500 ul של טריטון X-100 ל99.5 מיליליטר של PBS.

2. אלקלי לשרוף טיפול פציעה ומתחם

1. משרים חתיכה עגולה של נייר סינון, ~ 2 מ"מ בקוטר, בתמיסה של 1 M NaOH.
2. להרדים את העכבר עם זריקה של 100 מ"ג / קילוגרם קטמין ו5 מ"ג / קילוגרם xylazine, WHich הוא ~ של קוקטייל ההרדמה 100 μl מצעד 1.3 ל25 עכבר גרם. הרדמה צריכה לקחת ~ דקות 1-2 להגדיר פנימה עומק של הרדמה עשוי להיקבע על ידי בעדינות צובט את הבוהן או זנב של החיה, אם ההרדמה היא מספיק לא צריכה להיות שום תגובה. הערה: יש להקפיד על מנת להבטיח את העכבר לא להיכנע להיפותרמיה הנגרמת על הרדמה.
3. באמצעות הטפטפת, מריחה יחול ירידה של .0.5% hydrochloride proparacaine אל פני השטח של הקרנית לשיכוך כאבים מקומיים.
4. בעזרת מלקחיים סטריליות, להרים פיסת נייר סינון NaOH ספוג. אם אתה מבחין NaOH העודף נצמד לאו נוטף מנייר הסינון, לחץ לחיצה קצרה על נייר הסינון הספוג בפיסת נייר סינון יבשה כדי לספוג את העודף. מניחים את פיסת נייר סינון NaOH ספוג על הקרנית המרכזית. תשאיר את זה במשך 30 שניות כדי ליצור אלקלי צריבה חריפה של ~ 2 x 2 מ"מ ² באזור. מיקרוסקופ ניתוחי מועיל בהצבת נייר הסינון כראוי. הערה: רק עין אחת של של העכברhould להיפגע עם האחר משמש כבקרה.
5. הסר את נייר הסינון. באמצעות מזרק 10 מיליליטר, בעדינות לשטוף את העין עם 10 מיליליטר של 1x PBS פעמיים כדי לשטוף שיורי M NaOH 1.
6. מייד תחול ירידה של פתרון 1x סח"ה עובד (או שליטה ברכב בהיקף של PBS בדילול DMSO המכיל לא סח"ה) למריחה לקרנית. חזור 3x/day בקשה ל14 ימים. הערה: בתקופה זו משחה אנטיביוטית מקומית אינה מומלצת מכיוון שהוא עלול להפריע להתפתחות של הפגיעה והמסירה של המתחם. השתמש בתמיסה נוזלית לאנטיביוטיקה, כגון 3% פתרון גנטמיצין, במקום.
7. המשך ישיר להערכה קלינית (פרוטוקול 3 להלן) או להקריב את העכבר וenucleate העיניים להר שטוח של קרנית (4 פרוטוקול להלן) או פרפין / היסטולוגיה הקפואה קונבנציונלית.

3. הערכה קלינית

1. לבצע בדיקה יומית של העכברים בצורה עיוורה תחת מיקרוסקופ ניתוחי ולהבקיע גorneal NV מבוסס על אטימות של קרנית, NV, וגודל כלי. השתמש לפחות שני משקיפים ולהקליט את ציון סופי שהוא הממוצע של שתיים.
   1. ציון אטימות של קרנית בסולם של 0-4. 0 = ברור לחלוטין; 1 = מעט מעורפלת, קשתית ואישון עין בקלות; 2 = מעט אטומה, קשתית ואישון עדיין לזיהוי; 3 = אטומים, תלמידים כמעט לא מורגש; ו4 = לגמרי אטום ללא מבט של התלמיד.
   2. ציון NV בסולם של 0-3. 0 = אין neovessels; 1 = neovessels בימבוס הקרנית; 2 = neovessels פורש ימבוס הקרנית ומתקרבת למרכז קרני; 3 = neovessels פורש המרכז קרני.
   3. ציון גודל כלי דם בסולם של 0-3. 0 = אין neovessels; 1 = neovessels לזיהוי תחת מיקרוסקופ הניתוחי; 2 = neovessels לראות בקלות תחת מיקרוסקופ הניתוחי; 3 = neovessels לראות בקלות בלי מיקרוסקופ.
2. שימוש במצלמה דיגיטלית, קחו את תמונות נציג של העין ב7 ימים ו14 ימים.

4.הכתמה קרנית וMounts שטוח

1. תקן את העין enucleated PFA 4% במשך שעה לפחות 1 ב 4 ° C.
2. העבר את העין ל1X PBS ולהשתמש במלקחיים כדי להסיר את הרקמה עודפת בזהירות.
3. בעזרת מיקרוסקופ ניתוחי, להשתמש במחט (18 מד) או מיקרו סכין כדי לנקב את אזור pericorneal של העין (שים לב: זה צריך לשחרר את הנוזלים מהעין).
   1. מהניקוב נעשה בסעיף 4.3.1 להשתמש במספריים כירורגית לחתוך את החלק הקדמי של העין (קרנית) מהחלק האחורי.
4. העבר את הקרנית חזרה לPFA 4% לקיבעון לילה בשעה 4 ° C.
5. מחק את PFA 4% (זהירות: PFA הוא מסוכן וחייב להיות מסולק בהתאם לתקנות מוסדיות) ולשטוף את הקרנית שלוש פעמים עם 1x PBS להסיר כל PFA שיורית.
6. דגירה במאגר 1x חסימה לפחות 2 שעות בטמפרטורת חדר כדי permeabilize הרקמות ולמנוע ספציפי מחייב של הנוגדן הראשוני.
   1. החל נוגדן ראשוני בחיץ חסימת 1x, בדילול של פי 100-500. (לדוגמא: עכברוש אנטי עכבר PECAM-1 לאיתור כלי דם ב1:100, ארנב נגד עכבר LYVE-1 לאיתור כלי הלימפה ב1:500, ו / או anti-mouse-F4/80 חולדה לאיתור מקרופאגים ב1:100). דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   2. שטוף שש פעמים עם חיץ הכביסה 1x עבור שעה 1 בכל פעם בטמפרטורת חדר כדי להסיר נוגדן ראשוני מאוגד באופן מלא.
   3. החל משני נוגדנים ב1x חיץ החסימה בדילול של פי 500-1,000. (למשל ניאון 488 ננומטר מתויג העז אנטי עכברוש IgG ב1:800 או ניאון 594 ננומטר מתויג העז נגד הארנב IgG-ב1:800). דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   4. לשטוף שלוש פעמים עם 1X PBS עבור שעה 1 כל אחד בטמפרטורת חדר כדי להסיר משני נוגדנים מאוגדים באופן מלא.
7. העבר את הקרנית לטרי 1x PBS, ובעזרת מיקרוסקופ ניתוחי, לעשות ארבעה חתכים בזהירות מפריפריה לכיוון אגורהאה. זה צריך לחלק את הקרנית לארבעה רבעים של גודל שווה בערך (צורה וכתוצאה מכך צריכה להיראות ולא כמו פרפר) ולאפשר לו לשכב על שקופיות.
8. הר עם הרכבה בינונית מתאים לדימות פלואורסצנטי. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, צריכים להיות צילמו דגימות באופן מיידי ותצלומים דיגיטליים שצולמו, אך הוא עשוי להיות מאוחסן במשך מספר שבועות המוגנים מפני אור ב 4 ° C.

תוצאות

לאחר פציעת אלקלי צריבה, NV הקרנית מתרחש באופן צפוי, תלוי זמן. איור 1 מדגים את ההבדל הבולט הן בneovascularization ואטימות של קרנית בין בעלי חיים שלא טופלו (איור 1 א) ושל בעלי חיים שטופלו במעכבי HDAC סח"ה (איור 1 ב ) בנקודת הזמן של 7 ימים.

Discussion

הפרוטוקול המובא כאן תוצאות ברמות שחזור של hemangiogenesis, lymphangiogenesis, ודלקת, מה שהופך את מערכת אידיאלית ללמוד שלושת התהליכים הללו (קשורים). בעוד ששיטה זו מייצרת NV קרנית מרכזי, מספר שיטות שפותחו כדי לגרום NV יותר מכוון, כלומר תפירה של הקרנית ¹⁷ ומושתלות צמיחת פקטור המבטא כד...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringe	BD	309659
18 G Needle	BD	305918
10 ml Syringe	BD	306575
25 G Needle	BD	305916
Anti-F4/80 (rat anti-mouse)	AbD Serotech	MCA497RT
Anti-LYVE-1 (rabbit anti-mouse)	Abcam	ab14917
Anti-PECAM-1 (rat anti-mouse)	BD	553370
Anti-IgG Alexa 488 (goat anti-rat)	Invitrogen	A11006
Anti-IgG Alexa 594 (goat anti-rabbit)	Invitrogen	A11012
Camera	Tucsen	TCC 5.0 ICE
Coverslips	Fisher	12-548-B
DMSO	Sigma	D4540-1L	Caution: Mutagenic, Toxic
Forceps (Blunt), Iris	WPI	15915
Forceps (Sharp), Dumont #4	WPI	500340
KCl	Fisher	P217-500
Ketamine Solution	MedVet	RXKETAMINE	Controlled substance, proper license required for use.
Light Source for Microscope	AmScope	LED-14M-YA
Microscope (Stereo 7X-45X)	AmScope	SM-1B
Mounting Medium, VECTASHIELD	Vector	H-1000
NaCl	Fisher	S271-10
NaH2PO4	Fisher	S397-500
NaOH	Fisher	S318-1	Caution: Corrosive
Paraformaldehyde		P6148-500G	Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic
Proparacaine Hydrochloride	Sigma	P4554-1G
Scissors (5 mm blade), Vanas	WPI	14003
Goat Serum	MPBio	92939249
Microscope Slides	Fisher	12-550-15
Triton X-100	Sigma	T8787-100ML
Whatman Grade 1 Filter Paper	Whatman	1001-6508
Xylazine Solution	MedVet	RXANASED-20