Eine Alkali-brennen Verletzungsmodell der Hornhaut Neovaskularisation bei der Maus

Zusammenfassung

Neovaskularisation (NV) der Hornhaut können mehrere optische Pathologien erschweren. Mit Hilfe eines kontrollierten, alkali Verbrennungen Modell kann ein quantifizierbarer Höhe der Hornhaut NV für mechanistische Studie der Hornhaut NV und Bewertung von möglichen Therapien für neovaskulären Erkrankungen hergestellt werden.

Zusammenfassung

Unter normalen Bedingungen ist die Hornhaut avaskulären, und diese Transparenz ist wichtig für die Erhaltung der Sehschärfe. Neovaskularisation (NV) der Hornhaut, die durch Trauma, Keratoplastik oder ansteckende Krankheit verursacht werden kann, bricht die so genannte "angiogenen Privileg" der Hornhaut und bildet die Grundlage für mehrere visuelle Pathologien, die bis zur Erblindung führen kann. Obwohl es mehrere Behandlungsmöglichkeiten zur Verfügung, bleibt das grundlegende medizinische Notwendigkeit durch Hornhaut neovaskulären Erkrankungen vorgestellt ungedeckten. Um eine sichere, effektive und zielgerichtete Therapien zu entwickeln, ist ein zuverlässiges Modell der Hornhaut NV und pharmakologische Intervention erforderlich. Hier beschreiben wir ein alkali Verbrennungen corneale Neovaskularisierung Modell in der Maus. Dieses Protokoll liefert ein Verfahren für die Anwendung eines kontrollierten alkali Verbrennungen der Hornhaut, die Verabreichung einer pharmakologischen Verbindung von Interesse, und die Visualisierung des Ergebnisses. Diese Methode könnte sich als Instrumentalisierungtal für die Untersuchung der Mechanismen und Interventionsmöglichkeiten in der Hornhaut NV und anderen neovaskulären Erkrankungen.

Einleitung

Hornhautblindheit ist die vierthäufigste Ursache für Erblindung, für ca. 4% aller Fälle ¹ verantwortlich. Hornhaut-Neovaskularisation (NV) spielt eine bedeutende Rolle in vielen dieser Erkrankungen, einschließlich Herpes-Keratitis (der führende infektiöse Ursache für Erblindung im Westen) und Trachom (die häufigste Ursache für Blindheit weltweit Infektions) ^2. Aktuelle Therapien umfassen Steroide, nichtsteroidale entzündungshemmende Medikamente (NSAIDs), Anti-VEGF-Therapien und Cyclosporin A als auch konventionelle oder Laseroperationstechniken ^3. , Die stark schwächende Natur der Hornhaut NV basierend Pathologien, der Mangel an chirurgischen Einrichtungen in der Lage, die Behandlung von Hornhaut NV, und das Fehlen einer dringend, pharmakologische Option führte jedoch eine aktuelle Expertenrunde zu dem Schluss, dass trotz der vorhandenen Therapien, die grundlegende medizinische Bedarf von diesen Pathologien vorgestellt bleibt unerfüllte ^4.

Der menschlichen Hornhautbesteht aus 5 Schichten, drei Zellschichten (Epithel-, Stroma und Endothel) und 2-Schnittstelle (Bowman-Membran und Descemet-Membran). Es fungiert als mechanische Barriere und Brechungsfläche für das Auge. Sein transparentes Natur ist die Folge einer empfindlichen Balance ihrer Bestandteile und ist integraler Bestandteil seiner richtigen Funktion ^5. Normalerweise avaskuläre, erhält der Hornhaut Blut von Mikrogefäßen entlang der Außenkante, die aus der Augenheilkunde und ciliary Arterien gespeist ausgeführt werden. Hornhaut NV tritt auf, wenn ein Stimulus Angiogenese fördert dieser Behälter so dass sie in Richtung der Mitte der Hornhaut zu wachsen und somit Vision ⁶ begrenzen. Hornhaut-Angiogenese und Lymphangiogenese hemangiogenesis enthält, die in das Einwachsen von Blutgefäßen und Lymphgefäßen aus dem Limbus Gefäßarkade in Richtung der Mitte der Hornhaut führen. Dies führt zu einem Zusammenbruch der Hornhaut "angiogenen Privileg", eine Erhöhung der Hornhauttrübung und Fibrose, Störung der Hornhaut laAnwälten, ⁷ und Ödeme. Die genauen Auslöser von Hornhaut NV zahlreich sind, die von einer Reaktion auf Infektionskrankheiten, wie Bindehautentzündung zu einer chemisch induzierten Zustand verursacht traditionellen Arzneimitteln, Industriechemikalien, oder auch chemische Kampfstoffe.

Die molekularen Mechanismen, die an diesem Verfahren sind nicht, wie noch vollständig charakterisiert; aber ein paar wichtige Spieler sind identifiziert worden. Unter normalen Bedingungen ist die Hornhaut besitzt eine einzigartige "angiogenen Privileg durch eine redundante Anordnung von anti-angiogenen Faktoren (wie lösliche VEGF-R1) ⁸ gehalten. Als Reaktion auf einen externen Stimulus (z. B. einer Verletzung), es wird eine lokale Hochregulation von pro-angiogenen Faktoren (z. B. VEGF-A). Diese Tipps das Gleichgewicht der pro-und anti-angiogenen Faktoren, die angiogene Privileg der Hornhaut zu Grunde liegt, und führt zu hemangiogenesis, lymphangeogenesis und Entzündung, daher verursacht Hornhautpathologie und sogar Blindheit ^9.

Angesichts der nicht gedeckten medizinischen Bedarf dieser stark beeinträchtigende Krankheit, von Interesse für den Bereich ist es, eine zuverlässige Tiermodell der Hornhaut NV haben. Hier präsentieren wir ein solches Modell: kontrollierte alkaliBrandVerletzungen. Verschiedene Augenverletzung Modelle, die auf Verwendung von Filterpapier Ringe sind seit 1970 ¹⁰ verwendet worden. 1989, dadurch gekennzeichnet, eine Gruppe der Harvard Medical School Ophthalmologen ein Standardmodell eines zentralen Hornhautalkalibrandverletzung bei Kaninchen anhand von Einweichen ein Stück Papierrundfilter mit Natriumhydroxid (NaOH) und es auf die Hornhaut in einem bestimmten Bereich von Konzentrationen ^11. Seitdem hat sich diese Technik für die Verwendung in der Maus ^12-14 angepasst. Vor kurzem untersuchte das Labor Wang die therapeutische Wirkung des Histon-Deacetylase (HDAC)-Inhibitor SAHA in der Pathogenese der Hornhaut NV mit einer Maus Hornhautalkali Verbrennungen Modell ^15. Die Methodik der Maus Hornhautalkali Verbrennungen hier vorgestellten Modell gebaut wurdevor allem auf die Arbeit von zwei anderen Papieren ^14,16.

Protokoll

Hinweis: Das folgende Protokoll und repräsentative Ergebnisse verwenden Sie den HDAC-Inhibitor SAHA als Beispiel Verbindung. Jedoch ist dieses Protokoll keineswegs auf die Verwendung von SAHA beschränkt und wird als allgemeines Verfahren, um die Wirkungen von löslichen Verbindungen auf corneale Neovaskularisierung zu testen empfohlen. Geringfügige Änderungen müssen für Verdünnungsgrad sowie Häufigkeit und Dauer der Anwendung vorgenommen werden. Darüber hinaus werden Verbindungen, die in Wasser leicht löslich sind, in der Lage, in Abwesenheit von DMSO verabreicht werden.

Ethische Erklärung: Alle Tierversuche sollten nur in Übereinstimmung mit dem nationalen Recht und institutionelle Bestimmungen durchgeführt werden. Dieses Protokoll wurde für die Nutzung durch Tulane University Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.

1. Herstellung von Materialien (in der Reihenfolge der Verwendung)

1. Schneiden Sie ein Stück von Cellulose-Filterpapier (11 um) in 2 mm Kreisen.
2. Vorbereitung einer 1 M Lösung von NaOH durchAuflösen von 20 g NaOH in 500 ml destilliertem H ₂ O. Lagern bei Raumtemperatur. ACHTUNG: NaOH-Lösungen sind ätzend und kann alkali Verbrennungen verursachen.
3. Vorbereitung eines Narkose Cocktail durch Verdünnen von 10 ml 100 mg / ml Ketamin und 2,5 ml 20 mg / ml Xylazin in 37,5 ml 1x PBS zu einer Endkonzentration von 20 mg / ml Ketamin und 4 mg / ml Xylazin.
4. Vorbereitung einer 0,5% igen Lösung von Proparacain-Hydrochlorid (für die topische Analgetika) durch Auflösen von 500 mg Proparacain-Hydrochlorid in 100 ml PBS filtriert.
5. Vorbereitung 1x PBS durch Lösen von 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na ₂ HPO _{4 und} 0,23 g NaH ₂ PO ₄ in 900 ml destilliertem H ₂ O. Passen auf 7,4 pH-Wert. Die Lösung auf ein Endvolumen von 1000 ml mit destilliertem H ₂ O und filtriert, um Sterilität zu gewährleisten.
6. Bereiten 1.000 x Stammlösungen von SAHA bei ~ 100 mM in Dimethylsulfoxid (DMSO) durch Auflösen von 26,4 mg SAHA in 1 ml DMSO. Verdünnen, um eine 1x (~ 10 pM)Lösung filtriert PBS für jeden Einsatz. Bewahren Sie die Stammlösung bei -20 ° C bis zu einem Monat. ACHTUNG: DMSO ist eine bekannte Toxin und mutagen.
7. Vorbereitung einer Lösung von 4% Paraformaldehyd (PFA) zum Fixieren. Unter einer chemischen Haube löst 4 g des PFA in 90 ml PBS. Das Gemisch wird auf 65 ° C und titriert auf einen pH von 7,4. Sobald die PFA gelöst hat, wird die Lösung auf ein Endvolumen von 100 ml. Lagern bei 4 ° C bis zu einem Monat. ACHTUNG: PFA ist eine bekannte allergen, krebserregend und giftig.
8. Vorbereitung 1x Blockierpuffer durch Verdünnen von 5 ml Ziegenserum und 500 &mgr; l Triton X-100 in 94,5 ml PBS.
9. Vorbereitung 1x Waschpuffer durch Verdünnen von 500 ul Triton X-100 in 99,5 ml PBS.

2. Alkali-und Brandverletzungen Compound Behandlung

1. Einweichen eines runden Filterpapiers, ~ 2 mm im Durchmesser, in einer Lösung von 1 M NaOH.
2. Betäuben die Maus bei einer Injektion von 100 mg / kg Ketamin und 5 mg / kg Xylazin, whICH ist ~ 100 ul des Narkosecocktail aus Schritt 1.3 pro 25 g Maus. Anästhesie sollten, ~ 1-2 min bis cm Tiefe der Narkose gesetzt kann durch leichtes Kneifen der Zehen oder der Schwanz des Tieres ermittelt werden kann, wenn der Anästhesie reicht es sollte keine Antwort sein. Hinweis: Es sollte darauf geachtet werden, die Maus nicht auf die Anästhesie induzierte Hypothermie erliegen werden.
3. Mit einer Pipette, topisch einen Rückgang von 0,5% Proparacain Hydrochlorid gelten für die Hornhautoberfläche für lokale Analgesie.
4. Mit einer sterilen Pinzette, nehmen Sie ein Stück von NaOH getränkten Filterpapier. Wenn Sie bemerken, überschüssige NaOH klammerte sich an oder tropft aus dem Filterpapier, kurz tippen Sie auf die getränkten Filterpapier auf einem trockenen Stück Filterpapier, um das überschüssige absorbieren. Legen Sie das Stück von NaOH getränkten Filterpapier auf der zentralen Hornhaut. Lassen Sie es für 30 Sekunden, um einen spitzen Alkaliverbrauch von ca. 2 x 2 mm ² Fläche erzeugen. Ein Operationsmikroskop ist hilfreich bei der Platzierung richtig das Filterpapier. Hinweis: Nur ein Auge der Maus sollte mit der andere dient als Kontroll verletzt werden.
5. Entfernen Sie das Filterpapier. Mit einem 10-ml-Spritze vorsichtig spülen Sie das Auge mit 10 ml 1x PBS zweimal weg zu waschen Rest 1 M NaOH.
6. Einen Tropfen 1x SAHA-Arbeitslösung (oder eine Fahrzeugsteuerung bestehend aus PBS DMSO, die keine SAHA) topisch auf die Hornhaut unmittelbar gelten. Wiederholen Anwendung 3 mal pro Tag für 14 Tage. Hinweis: in diesem Zeitraum eine topische antibiotische Salbe wird nicht empfohlen, da es mit der Entwicklung der Verletzung und der Abgabe der Verbindung stören. Verwenden eines flüssigen Antibiotika-Lösung, wie 3% Gentamycin-Lösung, statt.
7. Direkt in die Klinische Assessment (Protokoll Nr. 3 unten) oder opfern die Maus und entkernen die Augen für die Hornhaut flachen Halterung (Protokoll Nr. 4 unten) oder herkömmlichen Paraffin / gefroren Histologie.

3. Klinische Bewertung

1. Führen Sie eine tägliche Prüfung der Mäuse im Blind unter einem Operationsmikroskop und Punkte corneal NV auf Basis von Hornhauttrübung, NV, und der Behältergröße. Verwenden Sie mindestens zwei Beobachter und nehmen Sie eine Endnote, die der Durchschnitt der beiden ist.
   1. Ergebnis Hornhauttrübung auf einer Skala von 0-4. 0 = völlig klar; 1 = leicht trüb, Iris und Pupille gut sichtbar; 2 = leicht trübe, Iris und Pupille noch nachweisbar; 3 = undurchsichtig, Schülerinnen und Schüler kaum nachweisbar; und 4 = völlig undurchsichtig, ohne Blick auf die Pupille.
   2. NV Note auf einer Skala von 0-3. 0 = keine neovessels; 1 = neovessels am Hornhautrand; 2 = neovessels überspannt den Hornhautrand und nähert sich der Hornhautmitte; 3 = neovessels überspannt den Hornhautmitte.
   3. Ergebnis Schiffsgröße auf einer Skala von 0-3. 0 = keine neovessels; 1 = neovessels unter Operationsmikroskop nachweisbar; 2 = neovessels leicht unter Operationsmikroskop gesehen; 3 = neovessels einfach und ohne Mikroskop gesehen.
2. Mit einer Digitalkamera nehmen sie repräsentative Bilder des Auges an 7 Tagen und 14 Tagen.

4.Hornhaut-Färbung und Flat-Halterungen

1. Fix entkernten Augen in 4% PFA für mindestens 1 h bei 4 ° C.
2. Bringen Sie den Blick auf PBS und 1x verwenden Pinzette vorsichtig entfernen überschüssiges Gewebe.
3. Mit Hilfe eines Operationsmikroskops, mit einer Nadel (18 Gauge) oder Mikro-Messer, um das pericorneale Bereich des Auges zu perforieren (Anmerkung: Dies sollte Flüssigkeit aus dem Auge freigeben).
   1. Aus der Perforation in Abschnitt 4.3.1 der Verwendung eines Paars von chirurgischen Schere, um den vorderen Teil des Auges (Kornea) vom hinteren Abschnitt zu schneiden.
4. Übertragen Sie die Hornhaut wieder in 4% PFA zur Fixierung über Nacht bei 4 ° C
5. Entsorgen Sie die 4% PFA (ACHTUNG: PFA ist gefährlich und müssen in Einklang mit den institutionellen Vorschriften entsorgt werden) und spülen Sie die Hornhaut dreimal mit 1x PBS, um restliche PFA entfernen.
6. Inkubieren 1x Blockierungspuffer für mindestens 2 h bei Raumtemperatur, um das Gewebe zu permeabilisieren und nicht-spezifische Bindung zu verhindern, der den primären Antikörper.
   1. Primären Antikörper in 1x Blocking-Puffer bei einer 100-500 fache Verdünnung. (Z. B. Ratten-Anti-Maus-PECAM-1 zum Detektieren von Blutgefäßen bei 1:100 Kaninchen-anti-Maus-LYVE-1 zum Erfassen Lymphgefäße an 1:500, und / oder Ratte anti-mouse-F4/80 zum Erfassen Makrophagen bei 1:100). Inkubation bei 4 ° C über Nacht.
   2. Wasche sechsmal mit 1x Waschpuffer für 1 Stunde jeweils bei Raumtemperatur, um ungebundenen primären Antikörper vollständig zu entfernen.
   3. Tragen Sie einen sekundären Antikörper in 1x Blocking-Puffer in einem 500-1000 fachen Verdünnung. (Z. B. eine 488 nm fluoreszierenden markierten Ziege-anti-Ratte-IgG bei 1:800 oder 594 nm Fluoreszenz-markierten Ziege-anti-Kaninchen-IgG bei 1:800). Inkubation bei 4 ° C über Nacht.
   4. Dreimaliges Waschen mit 1 × PBS für jeweils 1 h bei Raumtemperatur, um ungebundenen sekundären Antikörper vollständig zu entfernen.
7. Übertragen Sie die Hornhaut in frischen 1x PBS und mit Hilfe eines Operationsmikroskops, sorgfältig zu vier Schnitte von der Peripherie in Richtung Prozentäh. Dies sollte die Hornhaut in vier Quadranten von ungefähr gleicher Größe aufteilen (die resultierende Form eher wie ein Schmetterling anschauen) und lassen Sie es auf einer Folie flach liegen.
8. Montieren Sie mit einem Montage geeignete Medium für Fluoreszenz-Bildgebung. Für beste Ergebnisse sollten die Proben sofort abgebildet und digitale Fotografien gemacht werden, sondern kann mehrere Wochen vor Licht bei 4 ° C gelagert werden geschützt

Ergebnisse

Nach alkaliBrandVerletzung tritt Hornhaut NV auf eine zuverlässige, zeitabhängig. Abbildung 1 zeigt den krassen Unterschied sowohl in der Gefäßneubildung und Hornhauttrübung zwischen einem unbehandelten Tier (Abbildung 1A) und einem Tier mit dem HDAC-Inhibitor SAHA (Abbildung 1B behandelt ) bei der 7-tägigen Zeitpunkt.

2A und 2B zeigen eine Hornhaut flachen Halterung einer unbehandelten Kontrollauge mi...

Diskussion

Die hier vorgestellte Protokoll ergibt reproduzierbare Ebenen der hemangiogenesis, Lymphangiogenese und Entzündungen, so dass es ein ideales System, um diese drei (miteinander) Prozesse zu studieren. Während diese Methode produziert zentralen Hornhaut NV, mehrere Methoden, die entwickelt wurden, um mehr gerichtet NV, nämlich das Nähen der Hornhaut verursachen und ¹⁷ Wachstumsfaktor-exprimierenden Pellets ¹⁸ implantiert, könnten ebenfalls von Interesse sein. Unser Protokoll ist für den Einsatz...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Syringe	BD	309659
18 Guage Needle	BD	305918
10 mL Syringe	BD	306575
25 Guage Needle	BD	305916
Anti-F4/80 (rat anti-mouse)	AbD Serotech	MCA497RT
Anti-LYVE-1 (rabbit anti-mouse)	Abcam	ab14917
Anti-PECAM-1 (rat anti-mouse)	BD	553370
Anti-IgG Alexa488 (goat anti-rat)	Invitrogen	A11006
Anti-IgG Alexa594 (goat anti-rabbit)	Invitrogen	A11012
Camera	Tucsen	TCC 5.0 ICE
Coverslips	Fisher	12-548-B
DMSO	Sigma	D4540-1L	Caution: Mutagenic, Toxic
Forceps (Blunt), Iris	WPI	15915
Forceps (Sharp), Dumont #4	WPI	500340
KCl	Fisher	P217-500
Ketamine Solution	MedVet	RXKETAMINE	Controlled substance, proper license required for use.
Light Source for Microscope	AmScope	LED-14M-YA
Microscope (Stereo 7X-45X)	AmScope	SM-1B
Mounting Medium, Vectashield	Vector	H-1000
NaCl	Fisher	S271-10
NaH2PO4	Fisher	S397-500
NaOH	Fisher	S318-1	Caution: Corrosive
Paraformaldehyde		P6148-500G	Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic
Proparacaine Hydrochloride	Sigma	P4554-1G
Scissors (5mm blade), Vanas	WPI	14003
Goat Serum	MPBio	92939249
Microscope Slides	Fisher	12-550-15
Triton X-100	Sigma	T8787-100ML
Whatman Grade 1 Filter Paper	Whatman	1001-6508
Xylazine Solution	MedVet	RXANASED-20