Un Injury Modello alcali-burn di neovascolarizzazione corneale nel mouse

Riepilogo

Neovascolarizzazione (NV) della cornea può complicare molteplici patologie visive. Utilizzando un modello di lesione alcali-un'ustione controllata, un livello quantificabile di NV corneale può essere prodotta per lo studio meccanicistico di NV corneale e valutazione di potenziali terapie per i disordini neovascolare.

Abstract

In condizioni normali, la cornea è avascolare, e questa trasparenza è essenziale per mantenere una buona acuità visiva. Neovascolarizzazione (NV), della cornea, che può essere causata da traumi, cheratoplastica o malattie infettive, rompe il cosiddetto 'privilegio angiogenica' della cornea e costituisce la base di molteplici patologie visive che possono anche portare alla cecità. Anche se ci sono diverse opzioni terapeutiche disponibili, la necessità medica fondamentale presentata da patologie corneali neovascolare rimane insoddisfatto. Per sviluppare sicuri, efficaci e mirate terapie, è necessario un modello affidabile di NV corneale e intervento farmacologico. Qui, descriviamo un modello di neovascolarizzazione corneale lesioni alcali-burn nel topo. Questo protocollo fornisce un metodo per l'applicazione di una lesione alcali un'ustione controllata alla cornea, la somministrazione di un composto di interesse farmacologico e la visualizzazione del risultato. Questo metodo potrebbe rivelarsi strumentazioneTal per studiare i meccanismi e le opportunità di intervento in NV corneale e altri disturbi neovascolare.

Introduzione

Cecità corneale è la quarta causa più comune di cecità, responsabile di circa il 4% di tutti i casi ^1. Neovascolarizzazione corneale (NV) svolge un ruolo significativo in molte di queste patologie, tra cui cheratite erpetica (la causa infettiva di cecità in Occidente) e il tracoma (la principale causa di cecità contagiosa in tutto il mondo) ^2. Terapie attuali includono steroidi, farmaci anti-infiammatori non steroidei (FANS), terapie anti-VEGF, e ciclosporina A, nonché tecniche chirurgiche convenzionali o laser ^3. Tuttavia, la natura gravemente invalidante delle patologie NV basato corneali, la scarsità di strutture chirurgiche in grado di trattare NV corneale, e la mancanza di un'opzione farmacologica fortemente l'esecuzione ha condotto una tavola rotonda di esperti recente a concludere che, nonostante le terapie esistenti, la necessità medica fondamentale presentano tali patologie rimane insoddisfatta ^4.

La cornea umanasi compone di 5 strati, 3 strati cellulari (epiteliale, stromali ed endoteliali) e 2 di interfaccia (membrana di Bowman e la membrana Descemet). Esso funziona come barriera meccanica e la superficie di rifrazione per l'occhio. La sua natura trasparente è la conseguenza di un delicato equilibrio dei suoi componenti ed è solidale alla propria funzione ^5. Normalmente avascolare, la cornea riceve il sangue da microvasi che corre lungo il bordo esterno che sono alimentati dalla ciliare e arterie oftalmiche. Corneale NV si verifica quando uno stimolo promuove l'angiogenesi di questi vasi permettendo loro di crescere verso il centro della cornea e limitano visione ⁶ così. Angiogenesi corneale comprende hemangiogenesis e linfoangiogenesi, che determinano la crescita interna dei vasi sanguigni e dei vasi linfatici dal porticato vascolare limbare verso il centro della cornea. Questo porta ad una ripartizione dei corneale "privilegio angiogenico", un aumento di opacità corneale e fibrosi, distruzione della cornea layers, ed edema ^7. I trigger precise di NV corneale sono numerosi, che vanno da una risposta alle malattie infettive, come il tracoma ad uno stato indotto chimicamente causato medicine tradizionali, prodotti chimici industriali, o agenti di guerra anche chimici.

I meccanismi molecolari di questo processo non sono, ancora, completamente caratterizzati; tuttavia, sono stati identificati alcuni giocatori chiave. In condizioni normali la cornea possiede un unico 'privilegio angiogenica' mantenuto da un insieme ridondante di fattori anti-angiogenici (come solubile VEGF-R1) ^8. Tuttavia, in risposta ad uno stimolo esterno (come una ferita), ci sarà un upregulation locale di fattori pro-angiogenici (ad esempio VEGF-A). Questo punte l'equilibrio di fattori pro-e anti-angiogenici che sta alla base privilegio angiogenico della cornea, e porta a hemangiogenesis, lymphangeogenesis, e l'infiammazione, provocando quindi la patologia corneale e persino la cecità ^9.

Data l'esigenza medica insoddisfatta di questa patologia altamente invalidante, è di interesse per il campo per avere un modello animale affidabile di NV corneale. Qui vi presentiamo un tale modello: controllato lesioni alcali-burn. Vari modelli eye-pregiudizio basati sull'utilizzo di anelli di carta da filtro sono stati utilizzati dal 1970 ^10. Nel 1989, un gruppo di oftalmologi Harvard Medical School caratterizzato un modello standard di una lesione corneale alcali-burn centrale nel coniglio basato su imbevendo un pezzo di carta da filtro circolare con idrossido di sodio (NaOH) e la sua applicazione alla cornea ad una specifica gamma di concentrazioni ^11. Da allora, questa tecnica è stata adattata per l'uso nel ^12-14 mouse. Recentemente, il laboratorio Wang ha studiato gli effetti terapeutici della istone deacetilasi (HDAC) SAHA nella patogenesi della NV cornea usando un mouse corneale alcali-burn modello di lesione ^15. La metodologia del modello di lesione corneale alcali-burn del mouse qui presentato è stato costruitoprincipalmente sul lavoro prima di altre due carte ^14,16.

Protocollo

Nota: Il seguente protocollo e risultati rappresentativi utilizzano l'inibitore HDAC SAHA come un composto ad esempio. Tuttavia, questo protocollo è affatto limitato all'uso di SAHA, ed è raccomandato come metodo generale per testare gli effetti dei composti solubili sulla neovascolarizzazione corneale. Dovranno essere realizzati per il grado di diluizione nonché la frequenza e la durata di applicazione modifiche secondarie. Inoltre, i composti che sono facilmente solubili in acqua potranno essere somministrato in assenza di DMSO.

Dichiarazione etica: Tutti gli esperimenti sugli animali devono essere eseguite solo in conformità con il diritto nazionale e norme istituzionali. Questo protocollo è stato approvato per l'uso da Tulane University Institutional Animal Care ed uso comitato.

1. Preparazione dei Materiali (in ordine di utilizzo)

1. Tagliare un pezzo di carta da filtro di cellulosa (11 micron) in 2 cerchi mm.
2. Preparare una soluzione 1 M di NaOH dasciogliendo 20 g di NaOH in 500 ml di acqua distillata H ₂ O. Conservare a temperatura ambiente. ATTENZIONE: Le soluzioni di NaOH sono corrosivi e possono causare alcali-ustioni.
3. Preparare un cocktail anestetico diluendo 10 ml di 100 mg / ml di ketamina e 2,5 ml di 20 mg / xilazina ml in 37,5 ml di PBS 1x per una concentrazione finale di 20 mg / ml di ketamina e 4 mg / ml xilazina.
4. Preparare una soluzione allo 0,5% di proparacaine cloridrato (per analgesia topica) sciogliendo 500 mg di proparacaine cloridrato in 100 ml di filtrato PBS.
5. Preparare 1x PBS sciogliendo 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na ₂ HPO _4, e 0,23 g di NaH ₂ PO ₄ in 900 ml di H ₂ O distillata O. Regolare 7.4 pH. Portare la soluzione ad un volume finale di 1000 ml di H ₂ O distillata e filtro per assicurare la sterilità.
6. Preparare 1.000 x soluzioni madre di SAHA a ~ 100 mM in dimetilsolfossido (DMSO) sciogliendo 26,4 mg di SAHA in 1 ml di DMSO. Diluire a 1x (~ 10 micron)soluzione filtrata in PBS per ogni uso. Conservare la soluzione di riserva a -20 ° C per un massimo di un mese. ATTENZIONE: DMSO è una tossina e agente mutageno conosciuto.
7. Preparare una soluzione al 4% di paraformaldeide (PFA) per il fissaggio. Sotto cappa chimica, sciogliere 4 g di PFA in 90 ml di PBS. Portare la miscela a 65 ° C e titolare di un pH di 7,4. Una volta che il PFA è dissolta, portare la soluzione al volume finale di 100 ml. Conservare a 4 ° C per un massimo di un mese. ATTENZIONE: PFA è un noto come allergeniche, cancerogene e tossiche.
8. Preparare tampone di bloccaggio 1x diluendo 5 ml di siero di capra e 500 ul di Triton X-100 in 94,5 ml di PBS.
9. Preparare 1x tampone di lavaggio diluendo 500 ul di Triton X-100 in 99,5 ml di PBS.

2. Alcali-Burn Trattamento Lesioni & Compound

1. Immergere un pezzo rotondo di carta da filtro, ~ 2 mm di diametro, in una soluzione di 1 M NaOH.
2. Anestetizzare il mouse con un'iniezione di 100 mg / kg di ketamina e 5 mg / kg xilazina, which è ~ 100 ml di cocktail anestetico dal punto 1.3 a 25 g mouse. Anestesia dovrebbe prendere ~ 1-2 minuti per impostare in profondità dell'anestesia può essere determinato dal pizzicando delicatamente la punta o la coda dell'animale, se l'anestesia è sufficiente ci dovrebbe essere alcuna risposta. Nota: Si deve prestare attenzione a garantire il mouse non soccombere ad anestesia ipotermia indotta.
3. Utilizzando un contagocce, per via topica applicare un calo del 0,5% proparacaina cloridrato alla superficie corneale per l'analgesia locale.
4. Utilizzando pinze sterili, prendere un pezzo di carta da filtro imbevuta NaOH. Se si nota eccesso NaOH aggrappato alla o gocciolamento dalla carta da filtro, brevemente toccare la carta da filtro imbevuta su un pezzo di carta da filtro asciutto per assorbire l'eccesso. Posizionare il pezzo di carta da filtro imbevuta NAOH sulla cornea centrale. Lasciare per 30 sec per generare un acuto alcali-burn di ~ 2 x 2 mm ² in zona. Un microscopio chirurgico è utile per posizionare correttamente la carta da filtro. Nota: solo un occhio del mouse should essere ferito con l'altro serve come controllo.
5. Rimuovere la carta da filtro. Usando una siringa da 10 ml, lavare delicatamente l'occhio con 10 ml di 1x PBS due volte per lavare via residuale 1 M NaOH.
6. Immediatamente applicare una goccia di soluzione di lavoro 1x SAHA (o un controllo del veicolo costituito da PBS diluito DMSO contenente nessun SAHA) topicamente alla cornea. Ripetere l'applicazione 3x/giorno per 14 giorni. Nota: durante questo periodo un unguento antibiotico topico non è raccomandato in quanto potrebbe interferire con lo sviluppo della lesione e la consegna del composto. Utilizzare una soluzione di antibiotico liquido, come 3% di soluzione di gentamicina, invece.
7. Procedere direttamente alla valutazione clinica (protocollo 3 di seguito) o sacrificare il mouse e enucleare gli occhi corneale piatto mount (protocollo 4 di seguito) o convenzionale paraffina / istologia congelato.

3. La valutazione clinica

1. Eseguire un esame quotidiano dei topi in cieco sotto un microscopio operatorio e di segnare corneal NV basa su opacità corneale, NV, e le dimensioni dell'imbarcazione. Utilizzare almeno due osservatori e registrare un punteggio finale che è la media dei due.
   1. Punteggio opacità corneale su una scala di 0-4. 0 = completamente chiari; 1 = leggermente velato, iride e la pupilla facilmente visibile; 2 = un po 'opachi, iride e la pupilla ancora rilevabile; 3 = opachi, gli alunni difficilmente rilevabili; e 4 = completamente opachi senza vista della pupilla.
   2. Punteggio NV su una scala di 0-3. 0 = nessun neovasi; 1 = neovasi al limbus corneale; 2 = neovasi che attraversa il limbus corneale e si avvicina al centro della cornea; 3 = neovasi che attraversa il centro della cornea.
   3. Punteggio dimensioni delle navi su una scala 0-3. 0 = nessun neovasi; 1 = neovasi rilevabili al microscopio chirurgico; 2 = neovasi facilmente visibili sotto il microscopio chirurgico; 3 = neovasi facilmente visto senza il microscopio.
2. Utilizzo di una fotocamera digitale, prendere immagini rappresentative dell'occhio a 7 giorni e 14 giorni.

4.Corneale colorazione e piatti Monti

1. Fissare occhio enucleato nel 4% PFA per almeno 1 ora a 4 ° C.
2. Trasferire l'occhio a 1x PBS e utilizzare pinze per rimuovere con attenzione il tessuto in eccesso.
3. Con l'aiuto di un microscopio chirurgico, utilizzare un ago (18 gauge) o micro-coltello per perforare la regione pericorneal dell'occhio (nota: questo dovrebbe rilasciare liquido dall'occhio).
   1. Dalla perforazione fatta nella sezione 4.3.1 usare un paio di forbici chirurgiche per tagliare la porzione anteriore dell'occhio (cornea) dalla porzione posteriore.
4. Trasferire la cornea indietro nel 4% PFA per la fissazione notte a 4 ° C.
5. Eliminare il 4% PFA (ATTENZIONE: PFA è pericoloso e deve essere smaltita in conformità alle norme istituzionali) e sciacquare la cornea tre volte con PBS 1x per rimuovere ogni residuo PFA.
6. Incubare in 1x tampone bloccante per almeno 2 ore a temperatura ambiente per permeabilize tessuto e prevenire il legame non specifico dell'anticorpo primario.
   1. Applicare l'anticorpo primario in 1x tampone di blocco, in una piega diluizione 100-500. (Es ratto anti-topo-PECAM-1 per la rilevazione vasi sanguigni a 1:100, coniglio anti-topo-LYVE-1 per la rilevazione vasi linfatici a 1:500, e / o ratto anti-mouse-F4/80 per rilevare macrofagi a 1:100.) Incubare a 4 ° C per una notte.
   2. Lavare sei volte con 1x tampone di lavaggio per 1 ora ogni volta a temperatura ambiente per rimuovere completamente anticorpo primario non legato.
   3. Applicare un anticorpo secondario in 1x tampone di bloccaggio in una piega diluizione 500-1000. (Ad esempio una fluorescente 488 nm etichettato capra anti-topo IgG a 1:800 o fluorescente 594 nm etichettato capra anti-coniglio-IgG a 1:800). Incubare a 4 ° C per una notte.
   4. Lavare tre volte con PBS 1x per 1 ora ciascuno a temperatura ambiente per rimuovere completamente anticorpo secondario legato.
7. Trasferire la cornea in fresco 1x PBS e, con l'aiuto di un microscopio operatorio, fare attenzione quattro incisioni dalla periferia verso il centoER. Questo dovrebbe dividere la cornea in quattro quadranti di circa uguali dimensioni (la forma risultante dovrebbe apparire piuttosto come una farfalla) e permettono di sdraiarsi su un vetrino.
8. Montare con un adeguato mezzo di montaggio per l'imaging fluorescente. Per ottenere i migliori risultati, i campioni devono essere ripreso immediatamente e fotografie digitali scattate, ma possono essere conservati per diverse settimane al riparo dalla luce a 4 ° C.

Risultati

Dopo pregiudizio alcali-ustione, NV corneale si verifica in un modo dipendente dal tempo prevedibile. La Figura 1 mostra la netta differenza sia nella neovascolarizzazione e opacità corneale tra un animale non trattato (Figura 1A) e un animale trattato con l'inibitore HDAC SAHA (Figura 1B ) nel punto di 7 giorni.

Figure 2A e 2B mostrano un piatto monte corneale di un occhio controllo non trattato con pr...

Discussione

Il protocollo presentato qui si traduce in livelli riproducibili di hemangiogenesis, linfoangiogenesi, e l'infiammazione, che lo rende un sistema ideale per studiare questi tre processi (correlati). Mentre questo metodo produce NV corneale centralizzata, diversi metodi che sono stati sviluppati per causare più diretto NV, cioè la sutura della cornea ¹⁷ e impiantati fattore di crescita esprimendo pellet ^18, potrebbe anche essere di interesse. Il nostro protocollo è stato progettato per l'...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringe	BD	309659
18 G Needle	BD	305918
10 ml Syringe	BD	306575
25 G Needle	BD	305916
Anti-F4/80 (rat anti-mouse)	AbD Serotech	MCA497RT
Anti-LYVE-1 (rabbit anti-mouse)	Abcam	ab14917
Anti-PECAM-1 (rat anti-mouse)	BD	553370
Anti-IgG Alexa 488 (goat anti-rat)	Invitrogen	A11006
Anti-IgG Alexa 594 (goat anti-rabbit)	Invitrogen	A11012
Camera	Tucsen	TCC 5.0 ICE
Coverslips	Fisher	12-548-B
DMSO	Sigma	D4540-1L	Caution: Mutagenic, Toxic
Forceps (Blunt), Iris	WPI	15915
Forceps (Sharp), Dumont #4	WPI	500340
KCl	Fisher	P217-500
Ketamine Solution	MedVet	RXKETAMINE	Controlled substance, proper license required for use.
Light Source for Microscope	AmScope	LED-14M-YA
Microscope (Stereo 7X-45X)	AmScope	SM-1B
Mounting Medium, VECTASHIELD	Vector	H-1000
NaCl	Fisher	S271-10
NaH2PO4	Fisher	S397-500
NaOH	Fisher	S318-1	Caution: Corrosive
Paraformaldehyde		P6148-500G	Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic
Proparacaine Hydrochloride	Sigma	P4554-1G
Scissors (5 mm blade), Vanas	WPI	14003
Goat Serum	MPBio	92939249
Microscope Slides	Fisher	12-550-15
Triton X-100	Sigma	T8787-100ML
Whatman Grade 1 Filter Paper	Whatman	1001-6508
Xylazine Solution	MedVet	RXANASED-20