Una Lesión álcalis quemar modelo de neovascularización corneal en el ratón

Resumen

La neovascularización (NV) de la córnea puede complicar múltiples patologías visuales. Utilizando un modelo de lesión de álcali-quema controlada, un nivel cuantificable de NV corneal puede ser producido para el estudio mecanicista de la NV corneal y la evaluación de posibles terapias para trastornos neovasculares.

Resumen

En condiciones normales, la córnea es avascular, y esta transparencia es esencial para mantener una buena agudeza visual. La neovascularización (NV) de la córnea, que puede ser causada por un traumatismo, queratoplastia o enfermedad infecciosa, se rompe el llamado "privilegio angiogénico 'de la córnea y constituye la base de múltiples patologías visuales que pueden incluso conducir a la ceguera. Aunque hay varias opciones de tratamiento disponibles, la necesidad médica fundamental presentado por patologías corneales neovasculares permanece insatisfecha. Con el fin de desarrollar terapias seguras, eficaces y selectivos, se requiere un modelo fiable de NV de la córnea y la intervención farmacológica. Aquí se describe un modelo de neovascularización corneal lesiones álcalis quemadura en el ratón. Este protocolo proporciona un método para la aplicación de una lesión alcalino-quema controlada a la córnea, la administración de un compuesto farmacológico de interés, y la visualización del resultado. Este método podría ser instrumentalTal para el estudio de los mecanismos y oportunidades para la intervención en NV corneal y otros trastornos neovasculares.

Introducción

Ceguera corneal es la cuarta causa más común de ceguera, responsable de aproximadamente el 4% de todos los casos ^1. La neovascularización corneal (NV) desempeña un papel importante en muchas de estas patologías, incluyendo la queratitis herpética (la principal causa infecciosa de ceguera en Occidente) y el tracoma (la causa principal de ceguera en todo el mundo infecciosa) ^2. Las terapias actuales incluyen esteroides, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINEs), las terapias anti-VEGF, y ciclosporina A, así como las técnicas quirúrgicas convencionales o láser ^3. Sin embargo, la naturaleza gravemente debilitante de patologías NV basado corneales, la escasez de instalaciones quirúrgicas capaces de tratar NV corneal, y la falta de una opción farmacológica encarecidamente realizar encabezó una mesa redonda de expertos reciente a la conclusión de que, a pesar de las terapias existentes, la necesidad médica fundamental presentado por estas patologías permanece insatisfecha ^4.

La córnea humanaconsta de 5 capas, 3 capas celulares (epitelial, del estroma y el endotelio) y 2 interfaz (membrana de Bowman y la membrana de Descemet). Funciona como una barrera mecánica y la superficie de refracción para el ojo. Su naturaleza transparente es la consecuencia de un delicado equilibrio de sus componentes, y es parte integral de su función adecuada ^5. Normalmente avascular, la córnea recibe sangre de microvasos que se ejecutan a lo largo de su borde exterior que se alimenta desde la ciliar y las arterias oftálmicas. Corneal NV se produce cuando un estímulo promueve la angiogénesis de estos vasos permitiendo que crezcan hacia el centro de la córnea y por lo tanto limitar la visión ^6. Angiogénesis corneal incluye hemangiogenesis y linfangiogénesis, que resultan en el crecimiento hacia el interior de los vasos sanguíneos y los vasos linfáticos de la arcada vascular del limbo hacia el centro de la córnea. Esto conduce a un desglose de la córnea "privilegio angiogénico", un aumento en la opacidad de la córnea y la fibrosis, la alteración de la córnea Layers, y edema ^7. Los disparadores precisos de NV corneal son numerosos, que van desde una respuesta a las enfermedades infecciosas como el tracoma en un estado inducido químicamente causado medicinas tradicionales, productos químicos industriales, o incluso agentes de guerra química.

Los mecanismos moleculares de este proceso no son, por ahora, completamente caracterizados; sin embargo, se han identificado algunos jugadores clave. En condiciones normales la córnea posee un 'privilegio angiogénico' única mantenida por una matriz redundante de factores anti-angiogénicos (tales como solubles de VEGF-R1) ^8. Sin embargo, en respuesta a un estímulo externo (tal como una lesión), habrá una regulación por incremento local de factores pro-angiogénicos (por ejemplo, VEGF-A). Esto inclina la balanza de factores pro y anti-angiogénicos que subyace privilegio angiogénico de la córnea, y conduce a hemangiogenesis, lymphangeogenesis, y la inflamación, por lo tanto, causando la patología de la córnea e incluso ceguera ^9.

Debido a la necesidad médica no satisfecha de esta patología altamente debilitante, es de interés para el campo para tener un modelo animal fiable de NV corneal. Aquí se presenta un modelo de este tipo: control de lesiones álcalis quemadura. Se han utilizado diversos modelos de ojo de lesiones basado en el uso de anillos de papel de filtro desde 1970 ^10. En 1989, un grupo de oftalmólogos Escuela de Medicina de Harvard caracteriza un modelo estándar de una lesión alcalino-quemadura de la córnea central en conejo basado en remojo un pedazo de papel de filtro circular con hidróxido de sodio (NaOH) y su aplicación a la córnea en un rango específico de concentraciones ^11. Desde entonces, esta técnica se ha adaptado para su uso en el ^12-14 ratón. Recientemente, el laboratorio de Wang estudió los efectos terapéuticos de la histona deacetilasa (HDAC) inhibidor de SAHA en la patogénesis de NV de la córnea utilizando un modelo de lesión de la córnea del ratón alcalino-quemadura ^15. La metodología del modelo de lesión de la córnea del ratón alcalino-quemadura presentado aquí fue construidoprincipalmente en el trabajo previo de otros dos trabajos ^14,16.

Protocolo

Nota: El siguiente protocolo y resultados representativos utilizan el inhibidor de HDAC SAHA como un compuesto de ejemplo. Sin embargo, este protocolo es de ningún modo limitada al uso de SAHA, y se recomienda como un método general para poner a prueba los efectos de los compuestos solubles en neovascularización de la córnea. Tendrá que ser hecha por el grado de dilución, así como la frecuencia y la duración de la aplicación modificaciones menores. Adicionalmente, los compuestos que son fácilmente solubles en agua podrán ser administrado en ausencia de DMSO.

Declaración de Ética: Todos los experimentos con animales no se deben efectuar de conformidad con la legislación nacional y los reglamentos institucionales. Este protocolo fue aprobado para su uso por la Universidad de Tulane Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión.

1. Preparación de los materiales (por orden de utilización)

1. Corte un pedazo de papel de filtro de celulosa (11 m) en 2 círculos mm.
2. Preparar una solución 1 M de NaOH pordisolviendo 20 g de NaOH en 500 ml de agua destilada H ₂ O. Guarde a temperatura ambiente. PRECAUCIÓN: soluciones de NaOH es corrosivo y puede causar quemaduras alcalinos.
3. Preparar un cóctel anestésico mediante la dilución de 10 ml de 100 mg / ml de ketamina y 2,5 ml de 20 mg / ml de xilazina en 37,5 ml de 1 x PBS para una concentración final de 20 mg / ml de ketamina y 4 mg / ml de xilazina.
4. Preparar una solución de 0,5% de clorhidrato de proparacaína (para la analgesia tópica) mediante la disolución de 500 mg de clorhidrato de proparacaína en 100 ml de PBS filtrada.
5. Preparar PBS 1x disolviendo 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na ₂ HPO _4, y 0,23 g de NaH ₂ PO ₄ en 900 ml de _H2O destilada Ajuste a pH 7,4. Poner la solución en un volumen final de 1000 ml con _H2O destilada y se filtra para garantizar la esterilidad.
6. Preparar 1.000 x soluciones madre de SAHA en ~ 100 mM en dimetil sulfóxido (DMSO) disolviendo 26,4 mg de SAHA en 1 ml de DMSO. Diluir a una 1x (~ 10 M)solución en PBS filtrada para cada uso. La solución madre, a -20 ° C durante un máximo de un mes. PRECAUCIÓN: DMSO es una toxina y mutágeno conocido.
7. Preparar una solución de 4% de paraformaldehído (PFA) para la fijación. Bajo una campana química, disolver 4 g del PFA en 90 ml de PBS. Llevar la mezcla a 65 ° C y valorar, a un pH de 7,4. Una vez que el PFA se ha disuelto, llevar la solución a un volumen final de 100 ml. Almacenar a 4 ° C durante un máximo de un mes. PRECAUCIÓN: PFA es una sabe que es alergénica, carcinogénico y tóxico.
8. Preparar tampón de bloqueo 1x diluyendo 5 ml de suero de cabra y 500 ul de Triton X-100 en 94,5 ml de PBS.
9. Preparar tampón de lavado 1x mediante la dilución de 500 ul de Triton X-100 en 99,5 ml de PBS.

2. Álcali-Tratamiento de Quemaduras Lesiones Compuesto

1. Remojar una pieza circular de papel de filtro, ~ 2 mm de diámetro, en una solución de 1 M de NaOH.
2. Se anestesia el ratón con una inyección de 100 mg / kg de ketamina y 5 mg / kg de xilazina, WHich es de ~ 100 l del cóctel anestésico desde el paso 1.3 por cada 25 g de ratón. La anestesia debe tomar ~ 1-2 min a establecer pulg Profundidad de la anestesia puede ser determinada por pellizcar suavemente la punta o la cola del animal, si la anestesia es suficiente no debe haber ninguna respuesta. Nota: Se debe tener cuidado para asegurar el ratón no sucumbe a la anestesia hipotermia inducida.
3. Con un gotero, aplique tópicamente una caída del 0,5% de clorhidrato de proparacaína a la superficie de la córnea para la analgesia local.
4. Usando una pinza estéril, tome un pedazo de papel de filtro empapado NaOH. Si usted nota un exceso de NaOH se aferran a goteo o del papel de filtro, toque brevemente el papel de filtro empapado en un pedazo de papel de filtro seco para absorber el exceso. Coloque la pieza de papel de filtro empapado NAOH en la córnea central. Déjelo por 30 segundos para generar un álcali-quemadura aguda de ~ 2 x 2 mm ² de superficie. Un microscopio quirúrgico es útil en colocar correctamente el papel de filtro. Nota: Sólo un ojo de la s del ratónhould lesionarse con el otro que sirve como control.
5. Retire el papel de filtro. Usando una jeringa de 10 ml, limpiar suavemente el ojo con 10 ml de 1x PBS dos veces para lavar residual de 1 M de NaOH.
6. Inmediatamente aplique una gota de solución de trabajo 1x SAHA (o un control de vehículo que consiste en DMSO de PBS diluido que no contiene SAHA) tópicamente a la córnea. Repita 3 veces al día la aplicación durante 14 días. Nota: durante este período no se recomienda un ungüento antibiótico tópico ya que puede interferir con el desarrollo de la lesión y la entrega del compuesto. Use una solución de antibiótico líquido, solución de gentamicina tales como el 3%, en lugar.
7. Proceder directamente a la Evaluación Clínica (Protocolo 3 a continuación) o sacrificar el ratón y enucleación de los ojos durante la córnea plana mount (Protocolo 4 abajo) o parafina / histología congelado convencional.

3. Evaluación clínica

1. Realizar un examen diario de los ratones de una manera ciega con un microscopio quirúrgico y anotar corneal NV basa en la opacidad corneal, NV, y el tamaño del buque. Utilice por lo menos dos observadores y registrar una puntuación final que es el promedio de los dos.
   1. Puntuación opacidad de la córnea en una escala de 0-4. 0 = totalmente claras; 1 = poco nebuloso, iris y la pupila fácilmente visible; 2 = ligeramente opacos, el iris y la pupila aún detectable; 3 = opacos, los alumnos casi no detectables; y 4 = completamente opacos, sin vistas de la pupila.
   2. Puntuación NV en una escala de 0-3. 0 = sin neovasos; 1 = neovasos en el limbo de la córnea; 2 = neovasos que atraviesan el limbo corneal y se acercan al centro de la córnea; 3 = neovasos que atraviesan el centro de la córnea.
   3. Puntuación tamaño del vaso en una escala de 0-3. 0 = sin neovasos; 1 = neovasos detectables al microscopio quirúrgico; 2 = neovasos fácilmente visibles con microscopio quirúrgico; 3 = neovasos fácilmente visibles sin el microscopio.
2. El uso de una cámara digital, tomar imágenes representativas de los ojos a los 7 días y 14 días.

4.Corneal Coloración y monturas Piso

1. Fijar ojo enucleado en el 4% PFA durante al menos 1 hora a 4 ° C.
2. Transferir el ojo a 1x PBS y utilizar pinzas para quitar con cuidado el exceso de tejido.
3. Con la ayuda de un microscopio quirúrgico, el uso de una aguja (calibre 18) o micro-cuchillo para perforar la región pericorneal del ojo (nota: este debe liberar líquido del ojo).
   1. A partir de la perforación realizada en la sección 4.3.1 usar un par de tijeras quirúrgicas para cortar la parte anterior del ojo (córnea) de la porción posterior.
4. Transfiera la córnea de nuevo en PFA al 4% para la fijación de la noche a 4 ° C.
5. Deseche el 4% PFA (PRECAUCIÓN: PFA es peligrosa y debe ser eliminado de acuerdo con las normas institucionales) y enjuagar la córnea tres veces con 1x PBS para eliminar cualquier PFA residual.
6. Incubar en tampón de bloqueo 1x durante al menos 2 horas a temperatura ambiente para permeabilizar el tejido y evitar la unión no específica del anticuerpo primario.
   1. Aplicar el anticuerpo primario en tampón de bloqueo 1x, a una dilución de plegado 100-500. (Por ejemplo, de rata anti-ratón-PECAM-1 para la detección de los vasos sanguíneos a 1:100, de conejo anti-ratón-LYVE-1 para detectar los vasos linfáticos a 1:500, y / o anti-mouse-F4/80 de rata para la detección de macrófagos a 1:100). Incubar a 4 ° C durante la noche.
   2. Lave seis veces con 1x tampón de lavado durante 1 hora cada vez a temperatura ambiente para eliminar por completo el anticuerpo primario no unido.
   3. Aplicar un anticuerpo secundario en 1x tampón de bloqueo a una dilución veces 500-1.000. (Por ejemplo, un fluorescente 488 nm etiquetados de cabra anti-rata-IgG a 1:800 o un fluorescente 594 nm etiquetados de cabra anti-IgG de conejo a 1:800). Incubar a 4 ° C durante la noche.
   4. Lavar tres veces con 1x PBS durante 1 hr cada uno a temperatura ambiente para eliminar totalmente el anticuerpo secundario no unido.
7. Transferencia de la córnea en 1x PBS fresco y, con la ayuda de un microscopio quirúrgico, hacer cuidadosamente cuatro incisiones desde la periferia hacia el cientoer. Esto debería dividir la córnea en cuatro cuadrantes de aproximadamente el mismo tamaño (la forma resultante debería ser más bien como una mariposa) y deje que se acueste en una diapositiva.
8. Montar con un medio apropiado para el montaje de imagen fluorescente. Para obtener los mejores resultados, las muestras deben ser reflejados inmediatamente y fotografías digitales tomadas, sino que se pueden almacenar durante varias semanas protegidos de la luz a 4 ° C.

Resultados

Después de la lesión alcalino-quemadura, NV córnea se produce en una, de la manera dependiente del tiempo predecible. La Figura 1 demuestra la gran diferencia tanto en la neovascularización y la opacidad de la córnea entre un animal sin tratar (Figura 1A) y un animal tratado con el inhibidor de HDAC SAHA (Figura 1B ) en el punto de tiempo de 7 días.

Las Figuras 2A y 2B demuestran una córnea plana de m...

Discusión

El protocolo que se presenta aquí se traduce en niveles reproducibles de hemangiogenesis, LI, y la inflamación, por lo que es un sistema ideal para estudiar estos tres procesos (interrelacionados). Mientras que este método produce centralizado NV córnea, varios métodos que se han desarrollado para causar más dirigida NV, a saber, la sutura de la córnea ¹⁷ y implantados factor de crecimiento expresando gránulos ^18, también puede ser de interés. Nuestro protocolo está diseñado para su uso...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Syringe	BD	309659
18 Guage Needle	BD	305918
10 mL Syringe	BD	306575
25 Guage Needle	BD	305916
Anti-F4/80 (rat anti-mouse)	AbD Serotech	MCA497RT
Anti-LYVE-1 (rabbit anti-mouse)	Abcam	ab14917
Anti-PECAM-1 (rat anti-mouse)	BD	553370
Anti-IgG Alexa488 (goat anti-rat)	Invitrogen	A11006
Anti-IgG Alexa594 (goat anti-rabbit)	Invitrogen	A11012
Camera	Tucsen	TCC 5.0 ICE
Coverslips	Fisher	12-548-B
DMSO	Sigma	D4540-1L	Caution: Mutagenic, Toxic
Forceps (Blunt), Iris	WPI	15915
Forceps (Sharp), Dumont #4	WPI	500340
KCl	Fisher	P217-500
Ketamine Solution	MedVet	RXKETAMINE	Controlled substance, proper license required for use.
Light Source for Microscope	AmScope	LED-14M-YA
Microscope (Stereo 7X-45X)	AmScope	SM-1B
Mounting Medium, Vectashield	Vector	H-1000
NaCl	Fisher	S271-10
NaH2PO4	Fisher	S397-500
NaOH	Fisher	S318-1	Caution: Corrosive
Paraformaldehyde		P6148-500G	Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic
Proparacaine Hydrochloride	Sigma	P4554-1G
Scissors (5mm blade), Vanas	WPI	14003
Goat Serum	MPBio	92939249
Microscope Slides	Fisher	12-550-15
Triton X-100	Sigma	T8787-100ML
Whatman Grade 1 Filter Paper	Whatman	1001-6508
Xylazine Solution	MedVet	RXANASED-20