عزل وإعداد جدران الخلايا البكتيرية للتحليل التركيبي بواسطة الترا الأداء الكروماتوغرافيا السائلة

Summary

يتكون جدار الخلية البكتيرية من الببتيدوكليكان، وهي شبكة من الخلايا الجزيئية الكلية من خيوط السكر التي يرتبط بها الببتيدات. الترا الأداء الكروماتوغرافيا السائل يوفر دقة عالية والإنتاجية لاكتشافات جديدة من تكوين peptidoglycan. نقدم إجراء لعزل جدران الخلايا (sacculi) وإعدادها للتحليل لاحقا عبر UPLC.

Abstract

جدار الخلية البكتيرية أمر بالغ الأهمية لتحديد شكل الخلية أثناء النمو والانقسام، ويحافظ على السلامة الميكانيكية للخلايا في مواجهة الضغوط turgor عدة أجواء في الحجم. عبر الأشكال والأحجام المتنوعة للمملكة البكتيرية ، يتكون جدار الخلية من peptidoglycan ، وهي شبكة من فروع السكر الجزيئية المتقاطعة بواسطة الببتيدات القصيرة. تكمن الأهمية المركزية ل Peptidoglycan في علم وظائف الأعضاء البكتيرية وراء استخدامه كهدف للمضادات الحيوية وقد حفزت الدراسات الوراثية والهيكلية والبيولوجية للخلايا حول كيفية تجميعها بقوة أثناء النمو والانقسام. ومع ذلك، لا تزال هناك حاجة إلى تحقيقات واسعة النطاق لتوصيف الأنشطة الأنزيمية الرئيسية بشكل كامل في تخليق peptidoglycan والتركيب الكيميائي لجدران الخلايا البكتيرية. يعتبر التصوير الكروماتوغرافي السائل عالي الأداء (HPLC) طريقة تحليلية قوية لقياس الاختلافات في التركيب الكيميائي لجدران البكتيريا التي تزرع في ظل مجموعة متنوعة من الظروف البيئية والجينية ، ولكن إنتاجيتها غالبا ما تكون محدودة. هنا، نقدم إجراء مباشرا لعزل وإعداد جدران الخلايا البكتيرية للتحليلات البيولوجية peptidoglycan عبر HPLC و Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC)، وهو امتداد ل HPLC يستخدم مضخات لتقديم ضغوط عالية للغاية تصل إلى 15000 رطل في الثانية، مقارنة ب 6000 رطل في PSI ل HPLC. في تركيبة مع إعداد جدران الخلايا البكتيرية المعروضة هنا ، فإن حاقنات العينة منخفضة الحجم ، والكاشفات ذات معدلات أخذ العينات العالية ، وحجم العينة الأصغر ، وأوقات التشغيل الأقصر ل UPLC ستمكن من دقة عالية وإنتاجية لاكتشافات جديدة لتكوين peptidoglycan وبيولوجيا الخلايا البكتيرية الأساسية في معظم المختبرات البيولوجية مع إمكانية الوصول إلى جهاز طرد فائق و UPLC.

Introduction

الهدف من الطريقة الموصوفة هنا هو عزل جدران الخلايا البكتيرية السليمة (sacculi) وهضم peptidoglycan (PG) بحيث يمكن استخدام التصوير اللوني السائل فائق الأداء (UPLC) لتوفير معلومات مثل هوية مكونات الموروببتيد وتركيزاتها ، ومتوسط طول خيوط الجليكان ، وجزء من المواد المشاركة في الروابط المتقاطعة بين الخيوط. لمناقشة مفصلة للكيمياء الحيوية PG والأنواع muropeptide، وهناك العديد من الاستعراضات الممتازة التي تصف بنية PG ودورها في العدوى والمقاومة، مورفوجينيسيس، والنمو^1-6. تم تطوير الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) لتحليل PG في البداية من قبل Glauner و Schwarz في الثمانينيات ، وفي الآونة الأخيرة تم تعزيزها وتطبيقها على نطاق واسع في مختبرات ميغيل دي بيدرو وفالد

Protocol

1. تنمو الثقافات البكتيرية في 2.5 مل من وسائل الإعلام بين عشية وضحاها

العودة المخفف الثقافات 1:100 إلى 250 مل من وسائل الإعلام الطازجة وتنمو إلى OD₆₀₀ من 0.7-0.8. إعداد محلول من كبريتات دودسيل الصوديوم 6٪ (SDS) في الماء.

تنبيه: مسحوق SDS خطر - تجنب استنشاق مسحوق SDS؛ ارتداء قناع على الأنف والفم.

2. يوم 1 -- يتم تنفيذ الثقافات البكتيرية Lysing على مدار يوم واحد وبين عشية وضحاها

1. في حين أن الثقافات المخففة تنمو، قم بإعداد حمام ماء مغلي على طبق ساخن في كوب 1 L. مرة واحدة في الماء يغلي، aliquot 6 مل من 6٪ SDS في أنابيب البولي بروبلين 50 مل، إضافة شريط واحد ضجة صغيرة إلى ك

النتائج

باستخدام الإجراء المبين في الشكل 1، يجب أن تتكون العينة النهائية من 200 ميكرولتر على الأقل من محلول واضح تم تصفيته مباشرة في قارورة UPLC (الخطوة 4.4). يعتمد فصل UPLC لمختلف الموروببتيدات في عينة بكتيرية على قابليتها النسبية للذوبان بين مرحلة الهاتف المحمول السائل والمرحلة الثابتة للعمو?...

Discussion

خطوة حاسمة في هذا الإجراء هي الخطوة 3.1 من اليوم الثاني لإعداد العينة. إذا عجلت SDS بين عشية وضحاها، أو إذا تم تخزين العينات في 4٪ SDS لعدة أسابيع في درجة حرارة الغرفة، يجب إعادة الحصول على العينات لمدة ساعة واحدة على الأقل لإعادة إصدار SDS. السبب الشائع لهطول الأمطار SDS هو استخدام وسائل الإعلام م?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pronase E	Amresco	E629
Mutanolysin from Streptomyces	Sigma-Aldrich	M9901
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma-Aldrich	452882	Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle
Orthophosphoric acid	Sigma-Aldrich	79607	Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle
Boric acid	Sigma-Aldrich	31146
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Sodium azide is a poison
Sodium tetraborate	Sigma-Aldrich	221732
Millex 0.22 μm syringe filters	Fisher	SLGVR04NL
pH strips (pH range 0-6)	Fisher	M95863
50 ml polypropylene Falcon tubes	VWR	21008-951
13 mm x 100 mm glass tubes	Kimble Chase	60CM13
12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial	Waters	186000327C
Sodium Dodecyl Sulfate	Ambion	AM9820	SDS powder is hazardous
Instrumentation
Waters Acquity UPLC H-Class system, including:
Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN
Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager
Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column
Acquity UPLC PDA Detector
Waters Fraction Collector III
Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler