Isolamento e preparazione delle pareti cellulari batteriche per l'analisi compositia mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni

Riepilogo

La parete cellulare batterica è composta da peptidoglycan, una rete macromolecolare di fili di zucchero reticolati da peptidi. La cromatografia liquida ad alte prestazioni fornisce alta risoluzione e produttività per nuove scoperte della composizione peptidoglycan. Presentiamo una procedura per l'isolamento delle pareti cellulari (sacculi) e la loro successiva preparazione per l'analisi tramite UPLC.

Abstract

La parete cellulare batterica è fondamentale per la determinazione della forma cellulare durante la crescita e la divisione e mantiene l'integrità meccanica delle cellule di fronte alle pressioni del turgore diverse atmosfere di grandezza. Attraverso le diverse forme e dimensioni del regno batterico, la parete cellulare è composta da peptidoglycan, una rete macromolecolare di fili di zucchero reticolati da brevi peptidi. L'importanza centrale del peptidoglicano per la fisiologia batterica è alla base del suo uso come bersaglio antibiotico e ha motivato studi genetici, strutturali e biologici cellulari su come viene assemblato solidamente durante la crescita e la divisione. Tuttavia, sono ancora necessarie indagini approfondite per caratterizzare pienamente le principali attività enzimatiche nella sintesi del peptidoglycan e nella composizione chimica delle pareti cellulari batteriche. La cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) è un potente metodo analitico per quantificare le differenze nella composizione chimica delle pareti dei batteri coltivati in una varietà di condizioni ambientali e genetiche, ma la sua produttività è spesso limitata. Qui, presentiamo una procedura semplice per l'isolamento e la preparazione delle pareti cellulari batteriche per analisi biologiche del peptidoglycan tramite HPLC e Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), un'estensione di HPLC che utilizza pompe per fornire pressioni ultra-elevate fino a 15.000 psi, rispetto ai 6.000 psi per HPLC. In combinazione con la preparazione delle pareti cellulari batteriche qui presentate, gli iniettori di campioni a basso volume, i rivelatori con alti tassi di campionamento, volumi di campioni più piccoli e tempi di esecuzione più brevi di UPLC consentiranno un'alta risoluzione e produttività per nuove scoperte della composizione peptidoglycan e della biologia delle cellule batteriche fondamentali nella maggior parte dei laboratori biologici con accesso a un ultracentrifugo e UPLC.

Introduzione

L'obiettivo del metodo descritto nel presente documento è quello di isolare le pareti cellulari batteriche intatte (sacculi) e di digerire il peptidoglycan (PG) in modo tale che la cromatografia liquida ultra-performance (UPLC) possa essere utilizzata per fornire informazioni come l'identità dei componenti muropeptidi e le loro concentrazioni, la lunghezza media dei filamenti di glicano e la frazione di materiale coinvolto nei collegamenti incrociati tra i trefoli. Per una discussione dettagliata della biochimica PG e delle specie di muropeptidi, ci sono diverse eccellenti recensioni che descrivono la struttura PG e il suo ruolo in infezione, resistenza, morfogenesi e crescita^1-6. La cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) per l'analisi PG è stata inizialmente sviluppata da Glauner e Schwarz negli anni '80, e più recentemente è stata migliorata e applicata ampiamente nei laboratori di Miguel de Pedro e Waldemar Vollmer. I metodi precedenti utilizzavano l'analisi degli amminoacidi o la cromatografia su carta, tecniche dispendiose in termini di tempo e noiose che non producono valutazioni accurate o complete dei componenti della parete cellulare.

L'analisi UPLC può essere facilmente implementata in qualsiasi laboratorio di ricerca di base che abbia accesso a un ultracentrifugo e UPLC. Il metodo UPLC che presentiamo di seguito isola i sacculi completi, fornendo così informazioni complete e quantitative su tutte le specie chimiche in esso contenute. Questo metodo produce una quantificazione precisa di tutti i muropeptidi in una popolazione di batteri, il tutto entro una corsa UPLC di 20 minuti. L'implementazione di questo metodo comporta solo competenze di laboratorio di base, senza significativi investimenti finanziari nei materiali. Per eseguire i passaggi di questo metodo, i ricercatori devono solo essere esperti nella pipettazione, nella preparazione di tamponi ed enzimi e nella regolazione del pH, rendendolo accessibile a una vasta gamma di discipline scientifiche. La scelta degli enzimi utilizzati in questo protocollo dipende dalle specie di batterio analizzate; il protocollo qui descritto è utile per Escherichia coli, ed è stato generalmente trovato adeguato per isolare i sacculi da altri organismi Gram-negativi. La consultazione con la letteratura è raccomandata quando si applica questo metodo ai batteri Gram-positivi; in queste specie, la purificazione del sacculo è stata tradizionalmente più difficile. In particolare, questo metodo potrebbe essere necessario alterare in termini di scelta enzimatica e lunghezza dei tempi di digestione per adattarsi alle pareti più spesse e ai polimeri accessori come gli acidi teichoici dei batteri Gram-positivi. Il primo enzima in questo protocollo scide la lipoproteina della membrana esterna (come la lipoproteina di Braun, o Lpp) attacca al peptidogicano, rilasciando così tutto tranne il peptide C-terminale di- (o tri-) del Lpp dalla parete cellulare. Questo passaggio è necessario quando si esaminano enterobatteri, ma molti altri batteri Gram-negativi non hanno equivalenti Lpp, e quindi questo passaggio può essere saltato. Un secondo enzima si stacca specificamente dopo il componente dell'acido muramico del peptidoglycan, solubilizzando la subunità disaccaride che forma la specie muropeptide. Per fornire una valutazione accurata dell'architettura del PG, è necessario prestare attenzione a digerire i sacculi per evitare la scissione delle passerelle o di qualsiasi altra parte del gambo peptidico.

Sebbene le composizioni chimiche di peptidoglycan di oltre 100 ceppi di ~40 specie batteriche siano state analizzate dall'HPLC, non sono state eseguite analisi con la tecnologia UPLC. Inoltre, il lavoro precedente ha caratterizzato il peptidoglycan solo da una piccola frazione del dominio batterico, in parte limitato dalla produttività dell'HPLC. Pertanto, la diffusione di questo metodo al maggior numero possibile di ricercatori e l'implementazione su piattaforme UPLC saranno fondamentali per guidare studi fisiologici della grande frazione di specie batteriche il cui peptidoglycan deve ancora essere classificato.

Protocollo

1. Coltivare colture batteriche in 2,5 ml di media durante la notte

Diluire le colture 1:100 in 250 ml di mezzi freschi e crescere fino a₆₀₀ OD di 0,7-0,8. Preparare una soluzione di dodecil solfato di sodio al 6% (SDS) in acqua.

ATTENZIONE: la polvere SDS è pericolosa - evitare di inalare polvere di SDS; indossare una maschera sul naso e sulla bocca.

2. Giorno 1 - Le colture batteriche di lysing vengono eseguite nel corso di un giorno e durante la notte

1. Mentre le colture diluite crescono, impostare un bagno d'acqua bollente su una piastra calda in un becher da 1 L. Una volta che l'acqua è bollente, aliquota 6 ml di SDS 6% in tubi in polipropilene da 50 ml, aggiungere una piccola barra di agitazione a ciascun tubo, fissare i coperchi del tubo a tenuta di dita, posizionare i tubi nel bagnomaria e accendere mescolando a 500 giri/min sulla piastra calda.
2. Raccogliere le colture da 250 ml a 5.000 × g per 10 minuti a temperatura ambiente e rimossare pellet in 3 ml di mezzi o 1 soluzione salina tamponata con fosfato. Le sospensioni a celle a pipetta lenta si trasformano in tubi da 50 ml con SDS bollente al 6% per liscire le cellule (concentrazione finale 4% SDS) mentre i tubi sono immersi nel bagno d'acqua bollente e richiudere i coperchi a tenuta di dita. Le sospensioni cellulari devono essere trasferite rapidamente in SDS bollente una volta rimontesi. Dovrebbero essere evitati bruschi cambiamenti ambientali, in quanto ciò potrebbe causare un'alterazione errata della struttura della parete cellulare.
3. Coprire il bagno d'acqua bollente e lasciare bollire le cellule per 3 ore, controllando periodicamente il livello dell'acqua e riempiendo il bagnomaria quando necessario. Dopo 3 ore, spegnere l'elemento riscaldante della piastra calda e continuare a mescolare durante la notte a 500 giri/min.

3. Giorno 2 - Le digestione enzimatica vengono eseguite nel corso di un giorno

1. Se sds è precipitato nei tubi da 50 ml durante la notte, impostare il bagnomaria a bollire per ulteriori 1-2 ore. Accendere un blocco termico a 60 °C. Preparare uno stock di 1 mg/ml di Pronasi E in Tris-HCl da 10 mM (pH 7,2) + 0,06% con NaCl e attivare la Pronasi E a 60 °C per almeno 30 min.
2. Utilizzare un set di ultracentrifugo a 400.000 × g per far girare campioni per 20 minuti a temperatura ambiente al fine di pellettizzare i grandi polimeri PG e quindi purificarli da altri componenti cellulari. Rimuovere con cura il supernatante, quindi rimescolare ogni pellet in acqua ultrapura a temperatura ambiente. NOTA: Il volume di resuspensione dipende dal volume dei tubi ultracentrifugo utilizzati; utilizzare un volume che riempia i tubi almeno a metà strada ma non superi il volume massimo dei tubi. Ripetere la centrifugazione/lavaggio fino a quando l'acqua non forma bolle durante la resuspensione, indicando che l'SDS è stato completamente rimosso (in genere tre lavaggi). Interrompere il lavaggio del pellet se si forma un precipitato bianco, in quanto ciò indica che i sacculi si stanno raggruppando insieme. Il raggruppamento non è catastrofico, ma i grumi si legano molto fortemente alla plastica e alla vetreria causando una grande perdita di campioni. In questo caso, procedere con il protocollo utilizzando il campione di sacculi raggruppato.
3. Nell'ultima fase di centrifugazione/lavaggio, rimescolare i campioni in 900 μl di 10 mM Tris-HCl (pH 7.2) + 0,06% con NaCl e trasferire a 2 ml tubi precedentemente infilati con fori nelle cime con un piccolo ago. Aggiungere 100 μl di 1 mg/ml di Pronasi E attivata (concentrazione finale di 100 μg/ml) a ciascun campione e incubare a 60 °C per 2 ore. Impostare un blocco di calore diverso su 100 °C.
4. Interrompere la digestione della Pronasi E aggiungendo 200 μl di 6% di SDS a ciascun campione e far bollire i campioni nel blocco termico di 100 °C per 30 minuti. Impostare un blocco termico diverso a 37 °C e fare uno stock di muramidasi (mutanolisina) da 1 mg/ml in tampone fosfato da 50 mM (pH 4.9).
5. Come nel passaggio 3.2, utilizzare un set di ultracentrifugo a 400.000 × g per far girare campioni per 20 minuti a temperatura ambiente e lavare con acqua ultrapura a temperatura ambiente fino a quando L'SDS non viene completamente rimosso (in genere tre lavaggi). Il volume di resuspensione dipende dal volume dei tubi ultracentrifugo utilizzati; utilizzare un volume che riempia i tubi almeno a metà strada ma non superi il volume massimo dei tubi.
6. Nell'ultima fase di centrifugazione/lavaggio, resuspend campioni in 200 μl di tampone di fosfato di sodio da 50 mM (pH 4.9). Questo volume può essere regolato in base alla quantità di peptidoglycan nel campione e può essere dipendente dalle specie. Se in precedenza sono pubblicati rapporti di analisi HPLC per le specie di interesse, questo volume può essere stimato sulla base di queste quantificazioni (una compilazione di studi HPLC PG può essere trovata nelle informazioni supplementari di riferimento⁷). Per altre specie, la preparazione sacculus può essere eseguita fino a questo passaggio e quindi è possibile aggiungere diverse quantità di volumi di resuspensione per replicare i campioni al fine di determinare il volume minimo che consente al PG di rimanere in soluzione (vedi Discussione per ulteriori stime). Se il campione contiene più peptidoglycan, aumentare il volume di resuspensione; se il campione ha poco peptidoglycan, ridurre il volume di resuspensione ad un minimo di 50 μl.
7. Trasferire campioni in tubi da 1,5 ml e aggiungere 1 mg/ml di muramidasi per ottenere una concentrazione finale di 40 μg/ml. Incubare 6-8 ore o durante la notte a 37 °C.

4. Giorno 3 - La preparazione dei campioni per UPLC viene eseguita l'ultimo giorno

1. Accendere un blocco termico a 100 °C. Far bollire i campioni senza SDS per 5 minuti per fermare la digestione della muramisasi. Centrifugare i campioni per 10 min a 16.000 × g a temperatura ambiente, quindi trasferire il supernatante (i muropeptidi sono ora solubili) a tubi di vetro da 13 mm x 100 mm. Cerca di recuperare il più supernatante possibile, avvicinandoti molto al pellet senza disturbarlo.
2. Regolare il pH aggiungendo 500 mM di tampone di borato (pH 9) al campione per una concentrazione finale di tampone di borato da 100 mM. Il tampone di borato è compatibile con l'agente riducente boroidro di sodio. Aggiungere 1-2 granelli di boroidro di sodio per ridurre ogni campione e lasciare che la reazione proceda per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. ATTENZIONE: Il boroidro di sodio è altamente reattivo e pericoloso da maneggiare - evitare il contatto con la pelle (indossare guanti) ed evitare il contatto con gli occhi (indossare occhiali di sicurezza).
3. Regolare i campioni in pH 3-4 (il punto isoelettrico muropeptide è ~3,5) con acido ortofosforico 50% v/v utilizzando incrementi di 20 μl fino a pH 6, come misurato con carta indicatore di pH, quindi utilizzando incrementi di 2 μl. ATTENZIONE: L'acido ortofosforico è corrosivo e pericoloso da maneggiare - evitare il contatto con la pelle (indossare guanti) ed evitare il contatto con gli occhi (indossare occhiali di sicurezza). Il campione deve bollicine in risposta all'aggiunta di acido ortofosforico; quando il campione smette di gorgogliare, questo indica in genere che è stato raggiunto un pH di 6. Se nel campione non si verifica alcun gorgogliamento, ciò può indicare che la quantità di boroidro di sodio aggiunta era troppo piccola. In questo caso, interrompere l'abbassamento del pH, aggiungere con cura uno o due granelli di boroidro di sodio, lasciare reagire per 5-10 minuti, quindi riprendere la regolazione del pH.
4. Filtrare il campione attraverso un filtro siringa da 0,22 μm direttamente in un flaconcino UPLC. Se si è formato un precipitato, riscaldare il tubo con più passaggi attraverso una fiamma prima di filtrare. Se il campione non verrà iniettato nello strumento UPLC entro il giorno, congelare a -20 °C durante la notte. I campioni possono essere conservati fino a un anno a -80 °C. Il campione può essere scongelato passando attraverso una fiamma più volte.
5. Iniettare 10 μl di ogni campione su uno strumento UPLC dotato di una colonna in fase invertita C18 da 1,7 μm e di un rilevatore di assorbanza impostato per monitorare 202-208 nm. Gli esempi vengono inseriti in sequenza, ma le funzionalità di campionamento automatico consentono di elaborare fino a 96 campioni in batch. Utilizzare 50 mM di fosfato di sodio (pH 4,35) + 0,4% v/v azide di sodio per il solvente A e 75 mM fosfato di sodio (pH 4,95) + 15% v/v metanolo per solvente B. NOTA: L'azide di sodio viene aggiunto per compensare l'assorbimento di metanolo di 205 nm per evitare la deriva di base. Impostare il flusso su 0,25 ml/min e utilizzare un gradiente lineare superiore a 25 min per ottenere il 100% di solvente B e l'eluizione sequenziale dei muropeptidi entro 30 min. Se la spettrometria di massa verrà utilizzata per caratterizzare i muropeptidi dopo UPLC, raccogliere frazioni del picco di interesse in un raccoglitore di frazioni e asciugare le frazioni utilizzando un evaporatore centrifugo.

Risultati

Utilizzando la procedura descritta nella figura 1, il campione finale deve essere costituito da almeno 200 μl di soluzione chiara che è stata filtrata direttamente in un flaconcino UPLC (passaggio 4.4). La separazione UPLC dei vari muropeptidi in un campione batterico si basa sulla loro relativa solubilità tra la fase mobile liquida e la fase stazionaria della colonna. Le colonne C18 in fase inversa forniscono una matrice fortemente idrofobica per separare le specie di muropeptidi in base all'idrofobi...

Discussione

Un passaggio critico di questa procedura è il passaggio 3.1 del secondo giorno di preparazione del campione. Se l'SDS è precipitato durante la notte o se i campioni sono stati conservati in SDS al 4% per diverse settimane a temperatura ambiente, i campioni devono essere riboiled per almeno 1 ora per riassolvere l'SDS. Una causa comune per la precipitazione dell'SDS è l'uso di mezzi con sali di potassio, quindi il potassio dovrebbe essere evitato nei mezzi se possibile. Come accennato nella sezione Risultati rappresent...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pronase E	Amresco	E629
Mutanolysin from Streptomyces	Sigma-Aldrich	M9901
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma-Aldrich	452882	Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle
Orthophosphoric acid	Sigma-Aldrich	79607	Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle
Boric acid	Sigma-Aldrich	31146
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Sodium azide is a poison
Sodium tetraborate	Sigma-Aldrich	221732
Millex 0.22 μm syringe filters	Fisher	SLGVR04NL
pH strips (pH range 0-6)	Fisher	M95863
50 ml polypropylene Falcon tubes	VWR	21008-951
13 mm x 100 mm glass tubes	Kimble Chase	60CM13
12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial	Waters	186000327C
Sodium Dodecyl Sulfate	Ambion	AM9820	SDS powder is hazardous
Instrumentation
Waters Acquity UPLC H-Class system, including:
Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN
Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager
Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column
Acquity UPLC PDA Detector
Waters Fraction Collector III
Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler