Ultra Performanslı Sıvı Kromatografisi ile Bileşimsel Analiz için Bakteriyel Hücre Duvarlarının İzolasyonu ve Hazırlanması

Özet

Bakteri hücre duvarı peptidoglikan, peptitler tarafından çaprazlanmış şeker iplikçiklerinden oluşan bir makromoleküler ağdır. Ultra Performanslı Sıvı Kromatografi, peptidoglikan kompozisyonunun yeni keşifleri için yüksek çözünürlük ve verim sağlar. Hücre duvarlarının izolasyonu (sakculi) ve daha sonra UPLC aracılığıyla analize hazırlanmaları için bir prosedür sunuyoruz.

Özet

Bakteri hücre duvarı, büyüme ve bölünme sırasında hücre şeklinin belirlenmesi için kritik öneme sahiptir ve turgor basınçları karşısında hücrelerin mekanik bütünlüğünü korur. Bakteri krallığının çeşitli şekil ve boyutlarında, hücre duvarı kısa peptitlerle birbirine bağlanmış bir makromoleküler şeker iplikçik ağı olan peptidoglikan'dan oluşur. Peptidoglikanın bakteriyel fizyolojiye verdiği merkezi önem, antibiyotik hedefi olarak kullanılmasının altındadır ve büyüme ve bölünme sırasında nasıl sağlam bir şekilde bir araya getirildiğine dair genetik, yapısal ve hücre biyolojik çalışmalarını motive etmektedir. Bununla birlikte, peptidoglikan sentezindeki temel enzimatik faaliyetleri ve bakteri hücre duvarlarının kimyasal bileşimini tam olarak karakterize etmek için hala kapsamlı araştırmalar yapılması gerekmektedir. Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC), çeşitli çevresel ve genetik koşullar altında yetişen bakterilerin duvarlarının kimyasal bileşimindeki farklılıkları ölçmek için güçlü bir analitik yöntemdir, ancak verimi genellikle sınırlıdır. Burada, HPLC ve Ultra Performanslı Sıvı Kromatografisi (UPLC) aracılığıyla peptidoglikan'ın biyolojik analizleri için bakteri hücre duvarlarının izolasyonu ve hazırlanması için basit bir prosedür sunuyoruz, HPLC için 6.000 psi ile karşılaştırıldığında, 15.000 psi'ye kadar ultra yüksek basınç sağlamak için pompaları kullanan HPLC'nin bir uzantısı. Burada sunulan bakteri hücre duvarlarının hazırlanmasıyla birlikte, düşük hacimli numune enjektörleri, yüksek örnekleme oranlarına sahip dedektörler, daha küçük numune hacimleri ve UPLC'nin daha kısa çalışma süreleri, ultrasantrifüje ve UPLC'ye erişimi olan çoğu biyolojik laboratuvarda peptidoglikan bileşiminin ve temel bakteri hücre biyolojisinin yeni keşifleri için yüksek çözünürlük ve verim sağlayacaktır.

Giriş

Burada açıklanan yöntemin amacı, bozulmamış bakteri hücre duvarlarını (sakculi) izole etmek ve peptidoglikan'ı (PG) sindirmektir, böylece Ultra Performanslı Sıvı Kromatografisi (UPLC), muropeptid bileşenlerinin kimliği ve konsantrasyonları, glikan iplikçiklerinin ortalama uzunluğu ve iplikçikler arasındaki çapraz bağlantılarda yer alan malzemenin fraksiyonu gibi bilgileri sağlamak için kullanılabilir. PG biyokimyası ve muropeptid türlerinin ayrıntılı bir tartışması için, PG yapısını ve enfeksiyon, direnç, morfogenez ve büyümedeki rolünü açıklayan birkaç mükemmel inceleme vardır^1-6. PG analizi için Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) ilk olarak 19

Protokol

1. Bir Gecede 2,5 ml Medyada Bakteri Kültürleri Yetiştirin

Kültürleri 1:100'den 250 ml taze ortama geri seyreltin ve_{0.7-0.8'in 600'üne} kadar büyüyün. Suda% 6 sodyum dodecyl sülfat (SDS) çözeltisi hazırlayın.

DİkKAT: SDS tozu tehlikelidir - SDS tozunu solumaktan kaçının; burun ve ağız üzerine maske takın.

2. Gün 1 - Lysing Bakteri Kültürleri Bir Gün ve Gece Boyunca Gerçekleştirilir

1. Seyreltilmiş kültürler büyürken, 1 L beherde sıcak bir tabağa kaynar su banyosu kurun. Su kaynadıktan sonra, 50 ml polipropilen tüplere 6 ml%6 SDS aliquot, her tüpe bir küçük karıştırma çub

Sonuçlar

Şekil 1'deözetlenen yordamı kullanarak, son örnek doğrudan bir UPLC şişesine filtrelenmiş en az 200 μl net çözeltiden oluşmalıdır (adım 4.4). Bakteriyel bir numunedeki çeşitli muropeptitlerin UPLC ayrımı, sıvı mobil faz ile sütunun sabit fazı arasındaki göreceli çözünürlüklerine dayanır. Ters fazlı C18 sütunları, hidrofobiklik ve boyut^8'egöre muropeptid türlerini ayırmak için güçlü bir hidrofobik matris sağlar; polar, düşük moleküler ağırlıklı ...

Tartışmalar

Bu prosedürde kritik bir adım, numune hazırlamanın ikinci gününün 3.1. SDS bir gecede çöktüyse veya numuneler oda sıcaklığında birkaç hafta boyunca% 4 SDS'de saklanmışsa, SDS'yi yeniden analiz etmek için numuneler en az 1 saat boyunca yeniden ayrılmalıdır. SDS yağışının yaygın bir nedeni potasyum tuzları olan ortamın kullanılmasıdır, bu nedenle mümkünse medyada potasyumdan kaçınılmalıdır. Temsili Sonuçlar bölümünde belirtildiği gibi, pH'ı muropeptidlerin izoelektrik noktasına...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pronase E	Amresco	E629
Mutanolysin from Streptomyces	Sigma-Aldrich	M9901
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma-Aldrich	452882	Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle
Orthophosphoric acid	Sigma-Aldrich	79607	Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle
Boric acid	Sigma-Aldrich	31146
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Sodium azide is a poison
Sodium tetraborate	Sigma-Aldrich	221732
Millex 0.22 μm syringe filters	Fisher	SLGVR04NL
pH strips (pH range 0-6)	Fisher	M95863
50 ml polypropylene Falcon tubes	VWR	21008-951
13 mm x 100 mm glass tubes	Kimble Chase	60CM13
12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial	Waters	186000327C
Sodium Dodecyl Sulfate	Ambion	AM9820	SDS powder is hazardous
Instrumentation
Waters Acquity UPLC H-Class system, including:
Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN
Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager
Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column
Acquity UPLC PDA Detector
Waters Fraction Collector III
Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler