Изоляция и подготовка бактериальных клеточных стенок для композиционного анализа с помощью ультра производительности жидкой хроматографии

Резюме

Бактериальная клеточная стенка состоит из пептидогликана, макромолекулярной сети сахарных нитей, скрещенных пептидами. Ультра производительности жидкой хроматографии обеспечивает высокое разрешение и пропускную способность для новых открытий пептидогликан композиции. Мы представляем процедуру изоляции клеточных стенок (саккули) и их последующей подготовки к анализу через UPLC.

Аннотация

Бактериальная клеточная стенка имеет решающее значение для определения формы клеток во время роста и деления, и поддерживает механическую целостность клеток перед лицом тургорного давления нескольких атмосфер в величине. По всей разнообразной формы и размеров бактериального царства, клеточная стенка состоит из пептидоглифа, макромолекулярной сети сахарных нитей, скрещенных короткими пептидами. Центральное значение Peptidoglycan для бактериальной физиологии лежит в основе его использования в качестве цели антибиотиков и мотивировано генетических, структурных и клеточных биологических исследований о том, как он надежно собраны во время роста и деления. Тем не менее, по-прежнему необходимы обширные исследования для полной характеристики ключевых энзиматических действий в синтезе пептидогликана и химического состава стенок бактериальных клеток. Высокой производительности жидкой хроматографии (HPLC) является мощным аналитическим методом для количественной оценки различий в химическом составе стен бактерий, выращенных в различных экологических и генетических условиях, но его пропускная способность часто ограничена. Здесь мы представляем простую процедуру изоляции и подготовки бактериальных клеточных стенок для биологического анализа пептидогликана через HPLC и Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), расширение HPLC, которая использует насосы для доставки сверхвысокого давления до 15000 пси, по сравнению с 6000 пси для HPLC. В сочетании с подготовкой бактериальных клеточных стенок, представленных здесь, малообнакоченные инжекторы образца, детекторы с высокими показателями отбора проб, меньшие объемы выборки и более короткие сроки ведения UPLC позволят получить высокое разрешение и пропускную способность для новых открытий пептидогликанового состава и фундаментальной биологии бактериальных клеток в большинстве биологических лабораторий с доступом к ультрацентрифугу и UPLC.

Введение

Цель метода, описанного в настоящем, заключается в том, чтобы изолировать нетронутыми стенки бактериальных клеток (sacculi) и переварить пептидогликан (PG) таким образом, что Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) может быть использован для предоставления информации, такой как идентичность компонентов муропептида и их концентрации, средняя длина гликановых нитей, и доля материала, участвуют в перекрестных нитей. Для детального обсуждения биохимии PG и видов муропептида, Есть несколько прекрасных обзоров, которые описывают структуру PG и ее роль в инфекции, устойчивость, морфогенез,^{и рост 1-6}. Высокой производительности жидкой хроматографии (HPLC) для анализа PG был первоначально разработан Глаунер и Шварц в 1980-х годах, а в последнее время был расширен и широко применяется в лабораториях Мигель де Педро и Вальдемар Фолльмер. Предыдущие методы использовали аминокислотный анализ или бумажную хроматографию, трудоемкие и утомительные методы, которые не дают точных или полных оценок компонентов клеточной стенки.

Анализ UPLC может быть легко реализован в любой лаборатории фундаментальных исследований, которая имеет доступ к ультрацентрифугу и UPLC. Метод UPLC, который мы представляем ниже, изолирует полный мешок, тем самым предоставляя всеобъемлющую, количественную информацию по всем химическим видам в них. Этот метод дает точную количественную оценку всех муропептидов по всей популяции бактерий, все в течение 20 мин UPLC перспективе. Внедрение этого метода предполагает только базовые лабораторные навыки, без значительных финансовых вложений в материалы. Для того, чтобы выполнить шаги в этом методе, исследователи должны быть квалифицированы только в трубопроводе, подготовка буферов и ферментов, и корректировка рН, что делает его доступным для широкого круга научных дисциплин. Выбор ферментов, используемых в этом протоколе, зависит от анализируемых видов бактерий; протокол, описанный здесь, полезен для кишечной палочки,и, как правило, было установлено, что достаточно для изоляции саккули от других грам-отрицательных организмов. Консультации с литературой рекомендуется при применении этого метода к грамположительных бактерий; в этих видах, sacculus очистки традиционно было сложнее. В частности, этот метод, возможно, придется изменить с точки зрения выбора ферментов и продолжительности времени пищеварения для размещения более толстых стенок и аксессуаров полимеров, таких как тейхойные кислоты грамположительных бактерий. Первый фермент в этом протоколе расщепляет внешний мембранный липопротеин (например, липопротеин Брауна, или Lpp) привязанность к пептиду, тем самым высвобождая все, кроме C-терминального ди- (или три)) пептида Lpp из клеточной стенки. Этот шаг необходим при изучении энтеробактерий, но многие другие грам-отрицательные бактерии не имеют эквивалентов Lpp, и поэтому этот шаг может быть пропущен. Второй фермент специально расщепляется после компонента мурамической кислоты пептидоглыкана, solubilizing disaccharide субъединит, который образует вид муропептида. Чтобы обеспечить точную оценку архитектуры PG, следует позаботиться о переваривании саккули, чтобы предотвратить расщепление кроссбриджей или любой другой части пептидного стебля.

Несмотря на то, что химические составы пептидогликана из более чем 100 штаммов бактериальных видов no40 были проанализированы HPLC, никаких анализов с помощью технологии UPLC не проводилось. Кроме того, предыдущая работа характеризовала пептидогликана лишь из небольшой доли бактериальной области, частично ограниченной пропускной способностью HPLC. Таким образом, распространение этого метода, как многие исследователи, как это возможно, и осуществление на платформах UPLC, будет иметь решающее значение для вождения физиологических исследований большой доли бактериальных видов, чьи пептидогликан до сих пор не классифицированы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Выращивать бактериальные культуры в 2,5 мл средств массовой информации Ночь

Обратно разбавить культур 1:100 в 250 мл свежих средств массовой информации и расти до OD₆₀₀ из 0,7-0,8. Приготовьте раствор 6% додекилового сульфата натрия (SDS) в воде.

ВНИМАНИЕ: SDS порошок опасен - избежать вдыхания порошка SDS; носить маску над носом и ртом.

2. День 1 - Лисинг бактериальных культур осуществляется в течение одного дня и ночи

1. В то время как разбавленные культуры растут, создать кипящую ванну воды на горячей тарелке в стакане 1 л. После того, как вода кипит, aliquot 6 мл 6% SDS в 50 мл полипропилевых трубок, добавить один небольшой бар перемешать к каждой трубке, безопасные крышки трубки для пальцев герметично, место трубки в водяной бане, и включите перемешивания до 500 об / мин на горячей пластине.
2. Урожай 250 мл культур при 5000 × г в течение 10 мин при комнатной температуре и повторного сбора гранул в 3 мл средств массовой информации или 1x фосфат-буферный солевой раствор. Медленно пипетки ячейки суспензии в 50 мл трубок с 6% кипения SDS для осязать клетки (окончательная концентрация 4% SDS), в то время как трубы погружаются в кипящей водяной бане, и повторно крышки для пальцев герметично. Подвески клеток должны быть быстро переданы в кипящий SDS после повторного перерасхода. Резких изменений окружающей среды следует избегать, так как это может привести к ошибочному изменению структуры клеточнойстенки.
3. Обложка кипящей водяной бани и дайте клеткам кипеть в течение 3 часов, проверяя уровень воды периодически и заправки водяной бани, когда это необходимо. Через 3 часа выключите нагревательный элемент горячей пластины и продолжайте шевелиться на ночь при 500 об/мин.

3. День 2 - Энзиматические пищеварения выполняются в течение одного дня

1. Если SDS осаждается в 50 мл трубок на ночь, установите водяной бане кипятить еще 1-2 часа. Включите тепловой блок до 60 градусов по Цельсию. Приготовьте запас Проназе E в 10 мМ Трис-ХКл (рН 7,2) и 0,06% ж/в NaCl и активируйте Pronase E при 60 градусах по Цельсию в течение не менее 30 мин.
2. Используйте ультрацентрифуг, установленный на уровне 400 000 × г, чтобы вращать образцы в течение 20 минут при комнатной температуре, чтобы гранулировать большие полимеры PG и тем самым очистить их от других клеточных компонентов. Удалите супернатант тщательно, а затем повторно каждой гранулы в комнатной температуре ультрачистой воды. ПРИМЕЧАНИЕ: Объем повторного производства зависит от объема используемых ультрацентрифуговых труб; использовать объем, который заполняет трубки по крайней мере на полпути, но не превышает максимальный объем труб. Повторите центрифугу/мытье до тех пор, пока вода не сформирует пузырьки во время повторного ссадины, что указывает на то, что SDS был полностью удален (обычно три моет). Прекратите мыть гранулы, если белый осадок формы, так как это указывает на то, что sacculi слипаются вместе. Clumping не является катастрофическим, но сгустки связывают очень сильно пластика и стеклянной посуды вызывает большие потери образца. В этом случае, приступить к протоколу с использованием слипшиеся sacculi образца.
3. На последнем этапе центрифугации/мытья, повторно поместите образцы в 900 мкл 10 мм Tris-HCl (рН 7,2) и 0,06% ж/в NaCl и перенесите на 2 мл трубок, ранее ткнул с отверстиями в вершинах с небольшой иглой. Добавьте 100 мкл активированного Проназе Е (100 мкг/мл конечной концентрации) к каждому образцу и инкубировать при 60 градусах по Цельсию в течение 2 часов. Установите другой тепловой блок до 100 градусов по Цельсию.
4. Остановите пищеварение Pronase E, добавив 200 мкл 6% SDS к каждому образцу и варите образцы в тепловом блоке 100 градусов по Цельсию в течение 30 минут. Установите другой тепловой блок до 37 градусов по Цельсию и сделайте 1 мг/мл бульона мурамидазы (мутанолизин) в 50 мМ фосфатный буфер (рН 4,9).
5. Как и в шаге 3.2, используйте ультрацентрифуг, установленный на уровне 400 000 × г, чтобы вращать образцы в течение 20 минут при комнатной температуре и мыть с комнатной температурой ультрачистой воды до тех пор, пока SDS полностью не будет удален (обычно три моет). Объем повторного сейсы зависит от объема используемых ультрацентрифуговых труб; использовать объем, который заполняет трубки по крайней мере на полпути, но не превышает максимальный объем труб.
6. На последнем этапе центрифугации/мытья пробы повторного потребления в 200 мкл 50 мм фосфатного буфера натрия (рН 4,9). Этот объем может быть скорректирован в зависимости от количества пептидогликана в образце, и может быть видозависимым. Если есть ранее опубликованные отчеты об анализе HPLC для видов, представляющих интерес, этот том может быть оценен на основе этих количественных данных (компиляция исследований HPLC PG можно найти в дополнительной информации ссылки⁷). Для других видов, sacculus Prep может быть выполнена до этого шага, а затем различные объемы объемов повторного получения могут быть добавлены для репликации образцов для того, чтобы определить минимальный объем, который позволяет PG оставаться в решении (см. Обсуждение для дальнейших оценок). Если образец содержит больше пептидогликана, увеличьте объем повторного незаменимости; если образец имеет мало пептидогликана, уменьшите объем повторного незаменимости до минимума 50 мкл.
7. Перенесите образцы в 1,5 мл трубок и добавьте 1 мг/мл мурамидазы, чтобы дать окончательную концентрацию 40 мкг/мл. Инкубация 6-8 часов или на ночь при 37 градусов по Цельсию.

4. День 3 - Подготовка образцов для UPLC осуществляется в последний день

1. Включите тепловой блок до 100 градусов по Цельсию. Отварить образцы без SDS в течение 5 минут, чтобы остановить пищеварение muramidase. Образцы центрифуг в течение 10 мин при температуре 16 000 × г при комнатной температуре, а затем перенести супернатант (муропептиды теперь растворимы) на 13 мм х 100 мм стеклянные трубки. Попробуйте восстановить как можно больше супернатантов, как это возможно, получить очень близко к гранулы, не нарушая его.
2. Отрегулируйте рН, добавив буфер бората 500 мМ (рН 9) к образцу для окончательной концентрации буфера бората 100 мМ. Буфер бората совместим с борогидридом натрия. Добавьте 1-2 зерна борогидрида натрия, чтобы уменьшить каждый образец и дайте реакции продолжиться, по крайней мере 30 мин при комнатной температуре. ВНИМАНИЕ: Борогидрид натрия очень реактивный и опасный для обработки - избегайте контакта с кожей (перчатки для ношения) и избегайте контакта с глазами (износ защитных очков).
3. Отрегулируйте образцы до рН 3-4 (муропептидная изоэлектрическая точка составляет 3,5 евро) с 50% v/v ортопедической кислотой с использованием 20 йл шагом до рН 6, как измеряется бумагой индикатора рН, затем используя 2 хл шагом. ВНИМАНИЕ: Ортофосфорная кислота коррозионна и опасна для обработки - избегайте контакта с кожей (перчатки) и избегайте контакта с глазами (износ защитных очков). Образец должен пузыриться в ответ на добавление ортофосфорной кислоты; когда образец перестает пузыриться, это обычно указывает на то, что рН 6 был достигнут. Если в образце не происходит восходящей крови, это может свидетельствовать о том, что количество добавленного борогидрида натрия было слишком небольшим. В этом случае прекратите снижение рН, аккуратно добавьте одно-два зерна борогидрида натрия, дайте воспомхить в течение 5-10 мин, затем возобновите регулировку рН.
4. Образец фильтра через фильтр шприца 0,22 мкм непосредственно в флакон UPLC. Если осадок сформировался, нагреть трубку с несколькими проходит через пламя перед фильтрацией. Если образец не будет введен в инструмент UPLC в течение дня, заморозить при -20 градусов по Цельсию на ночь. Образцы могут храниться до года при -80 градусах Цельсия. Образец можно разморозить, пройдя через пламя несколько раз.
5. Ввись 10 мкл каждого образца на прибор UPLC, оснащенный реверсивной фазой C18 1,7 мкм и детектором абсорбтора, установленным для мониторинга 202-208 нм. Образцы вводятся последовательно, но возможности autosampler позволяют обрабатывать до 96 образцов в пакете. Используйте 50 мМ фосфат натрия (рН 4,35) - 0,4% в/в азид натрия для растворителя А и 75 мМ фосфата натрия (рН 4,95) и 15% в/в метанол для растворителя B. ПРИМЕЧАНИЕ: Азаид натрия добавляется для компенсации 205 нм поглощения метанола, чтобы избежать дрейфа базового уровня. Установите поток до 0,25 мл/мин и используйте линейный градиент более 25 мин для достижения 100% растворителя B и последовательного элаута муропептидов в течение 30 мин. Если масс-спектрометрия будет использоваться для характеристики муропептидов после UPLC, собрать фракции пика интереса в сборщике фракций и высушить фракции с помощью центробежного испарителя.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Используя процедуру, изложенную на рисунке 1,окончательная выборка должна состоять по крайней мере из 200 мкл четкого раствора, который был отфильтрован непосредственно в флакон UPLC (шаг 4.4). Разделение UPLC различных муропептидов в бактериальном образце зависит от их относительно...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Важным шагом в этой процедуре является шаг 3.1 второго дня подготовки образца. Если SDS осаждается в одночасье, или если образцы хранились в 4% SDS в течение нескольких недель при комнатной температуре, образцы должны быть reboiled, по крайней мере 1 час, чтобы переокрасить SDS. Распространенной пр?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pronase E	Amresco	E629
Mutanolysin from Streptomyces	Sigma-Aldrich	M9901
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma-Aldrich	452882	Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle
Orthophosphoric acid	Sigma-Aldrich	79607	Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle
Boric acid	Sigma-Aldrich	31146
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Sodium azide is a poison
Sodium tetraborate	Sigma-Aldrich	221732
Millex 0.22 μm syringe filters	Fisher	SLGVR04NL
pH strips (pH range 0-6)	Fisher	M95863
50 ml polypropylene Falcon tubes	VWR	21008-951
13 mm x 100 mm glass tubes	Kimble Chase	60CM13
12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial	Waters	186000327C
Sodium Dodecyl Sulfate	Ambion	AM9820	SDS powder is hazardous
Instrumentation
Waters Acquity UPLC H-Class system, including:
Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN
Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager
Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column
Acquity UPLC PDA Detector
Waters Fraction Collector III
Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler