Aislamiento Y Preparación De Paredes Celulares Bacterianas Para El Análisis Compositiva Por Cromatografía Líquida De Ultra Rendimiento

Resumen

La pared celular bacteriana está compuesta de peptidoglicano, una red macromolecular de hebras de azúcar reticuladas por péptidos. La cromatografía líquida de ultra rendimiento proporciona alta resolución y rendimiento para nuevos descubrimientos de la composición de peptidoglicanos. Presentamos un procedimiento para el aislamiento de las paredes celulares (sacculi) y su posterior preparación para su análisis a través de UPLC.

Resumen

La pared celular bacteriana es crítica para la determinación de la forma celular durante el crecimiento y la división, y mantiene la integridad mecánica de las células frente a presiones de turgencia de varias atmósferas en magnitud. A través de las diversas formas y tamaños del reino bacteriano, la pared celular se compone de peptidoglicano, una red macromolecular de hebras de azúcar reticuladas por péptidos cortos. La importancia central del peptidoglicano para la fisiología bacteriana subyace a su uso como diana antibiótica y ha motivado estudios genéticos, estructurales y biológicos celulares de cómo se ensambla robustamente durante el crecimiento y la división. No obstante, las investigaciones extensas todavía se requieren caracterizar completamente las actividades enzimáticas dominantes en síntesis del peptidoglycan y la composición química de paredes celulares bacterianas. La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) es un poderoso método analítico para cuantificar las diferencias en la composición química de las paredes de las bacterias cultivadas bajo una variedad de condiciones ambientales y genéticas, pero su rendimiento a menudo es limitado. Aquí, presentamos un procedimiento sencillo para el aislamiento y la preparación de paredes celulares bacterianas para análisis biológicos de peptidoglicano a través de HPLC y Cromatografía Líquida de Ultra Rendimiento (UPLC), una extensión de HPLC que utiliza bombas para entregar presiones ultra altas de hasta 15,000 psi, en comparación con 6,000 psi para HPLC. En combinación con la preparación de las paredes celulares bacterianas presentadas aquí, los inyectores de muestras de bajo volumen, los detectores con altas tasas de muestreo, volúmenes de muestra más pequeños y tiempos de ejecución más cortos de UPLC permitirán una alta resolución y rendimiento para nuevos descubrimientos de la composición de peptidoglicano y la biología celular bacteriana fundamental en la mayoría de los laboratorios biológicos con acceso a una ultracentrífuga y UPLC.

Introducción

El objetivo del método descrito en este documento es aislar las paredes celulares bacterianas intactas (sacculi) y digerir el peptidoglicano (PG) de modo que la cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC) se pueda utilizar para proporcionar información como la identidad de los componentes muropeptide y sus concentraciones, la longitud promedio de las hebras de glicanos y la fracción de material involucrado en los reticulados entre las hebras. Para una discusión detallada de la bioquímica pg y las especies de muropeptide, hay varias revisiones excelentes que describen la estructura pg y su papel en la infección, resistencia, morfogénesis, y el crecimiento^1-6. La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para el análisis de PG fue desarrollada inicialmente por Glauner y Schwarz en la década de 1980, y más recientemente se ha mejorado y aplicado ampliamente en los laboratorios de Miguel de Pedro y Waldemar Vollmer. Los métodos anteriores utilizaron análisis de aminoácidos o cromatografía de papel, técnicas lentas y tediosas que no producen evaluaciones precisas o completas de los componentes de la pared celular.

El análisis uplc se puede implementar fácilmente en cualquier laboratorio de investigación básica que tenga acceso a una ultracentrífuga y UPLC. El método UPLC que presentamos a continuación aísla sacculi completo, proporcionando así información completa y cuantitativa sobre todas las especies químicas en él. Este método produce una cuantificación precisa de todos los muropeptides a través de una población de bacterias, todo dentro de una ejecución de UPLC de 20 minutos. La implementación de este método implica sólo habilidades básicas de laboratorio, sin una inversión financiera significativa en materiales. Para ejecutar los pasos de este método, los investigadores solo necesitan ser expertos en pipetear, preparar tampones y enzimas, y ajustar el pH, haciéndolo accesible a una amplia gama de disciplinas científicas. La elección de las enzimas utilizadas en este protocolo depende de la especie de bacteria que se está analizando; el protocolo descrito aquí es útil para Escherichia coli,y se ha encontrado generalmente para ser adecuado para aislar sacculi de otros organismos gramnegativos. La consulta con la literatura se recomienda al aplicar este método a las bacterias Gram-positivas; en estas especies, la purificación de sacculus ha sido tradicionalmente más difícil. En particular, este método puede tener que ser alterado en términos de elección de enzimas y la duración de los tiempos de digestión para acomodar las paredes más gruesas y los polímeros accesorios como los ácidos teicoicos de las bacterias Gram-positivas. La primera enzima en este protocolo escinde la lipoproteína externa de la membrana (tal como lipoproteína de Braun, o Lpp) accesorio al peptidoglycan, de tal modo liberando todo pero el C-terminal di- (o tri-) péptido del Lpp de la pared celular. Este paso es necesario al examinar enterobacterias, pero muchas otras bacterias Gram-negativas no tienen equivalentes de Lpp, y por lo tanto este paso se puede omitir. Una segunda enzima se escinde específicamente después del componente de ácido murámico del peptidoglicano, solubilizando la subunidad disacárido que forma la especie muropeptide. Para proporcionar una evaluación precisa de la arquitectura de la PG, se debe tener cuidado al digerir los sacculi para evitar la escisión de los puentes cruzados o cualquier otra parte del tallo del péptido.

Aunque las composiciones químicas de peptidoglicano de más de 100 cepas de ~ 40 especies bacterianas han sido analizadas por HPLC, no se han realizado análisis con la tecnología UPLC. Además, el trabajo anterior ha caracterizado peptidoglicano de sólo una pequeña fracción del dominio bacteriano, en parte limitado por el rendimiento de hplc. Por lo tanto, la difusión de este método a tantos investigadores como sea posible, y la implementación en las plataformas uplc, será fundamental para impulsar los estudios fisiológicos de la gran fracción de especies bacterianas cuyo peptidoglicano aún no ha sido categorizado.

Protocolo

1. Cultivar cultivos bacterianos en 2,5 ml de medios durante la noche

Volver a diluir los cultivos 1:100 en 250 ml de medios frescos y crecer a OD₆₀₀ de 0.7-0.8. Prepare una solución de dodecil sulfato de sodio al 6% (SDS) en agua.

PRECAUCIÓN: El polvo de SDS es peligroso - evite inhalar el polvo de SDS; use una máscara sobre la nariz y la boca.

2. Día 1 - El desestecimiento de cultivos bacterianos se realiza en el transcurso de un día y durante la noche

1. Mientras que los cultivos diludos están creciendo, establezca un baño de agua hirviendo en un plato caliente en un casto de 1 L. Una vez que el agua esté hirviendo, alícuota 6 ml de SDS al 6% en tubos de polipropileno de 50 ml, agregue una pequeña barra de agitación a cada tubo, asegure las tapas del tubo apretadas a los dedos, coloque los tubos en el baño de agua y encienda la agitación a 500 rpm en la placa caliente.
2. Cosechar los cultivos de 250 ml a 5.000 × g durante 10 min a temperatura ambiente y resuspend pellets en 3 ml de medio o 1x solución salina tamponada con fosfato. Pipetee lentamente las suspensiones de la célula en los tubos de 50 ml con el SDS que hierve del 6% para lyse las células (concentración final el SDS del 4%) mientras que los tubos se sumergen en el baño de agua que hierve, y vuelva a cerrar las tapas a los dedos-apretados. Las suspensiones celulares deben transferirse rápidamente a SDS hirviendo una vez resuspendidas. Se deben evitar los cambios ambientales abruptos, ya que esto podría causar una alteración errónea de la estructura de la paredcelular.
3. Cubra el baño de agua hirviendo y deje que las células hiervan durante 3 horas, comprobando el nivel del agua periódicamente y rellenando el baño de agua cuando sea necesario. Después de 3 horas, apague el elemento de calefacción de la placa caliente y continúe agitando durante la noche a 500 rpm.

3. Día 2 - Las digestiones enzimáticas se realizan en el transcurso de un día

1. Si sds se ha precipitado en los tubos de 50 ml durante la noche, establecer el baño de agua para hervir durante un adicional de 1-2 horas. Encienda un bloque de calor a 60 °C. Preparar un stock de 1 mg/ml de Pronasa E en Tris-HCl de 10 mM (pH 7,2) + 0,06% p/v NaCl y activar la Pronasa E a 60 °C durante al menos 30 min.
2. Utilice un conjunto de ultracentrífugas a 400.000 × g para hacer girar muestras durante 20 minutos a temperatura ambiente con el fin de peletizar los polímeros pg grandes y así purificarlos de otros componentes celulares. Retire el sobrenadante con cuidado, y luego resuspend cada pellet en agua ultrapura a temperatura ambiente. NOTA: El volumen de resuspensión depende del volumen de los tubos ultracentrífugdos utilizados; utilice un volumen que llene los tubos al menos a mitad de camino, pero no exceda el volumen máximo de los tubos. Repita la centrifugación/lavado hasta que el agua no forme burbujas durante la resuspensión, lo que indica que la SDS se ha eliminado por completo (normalmente tres lavados). Deje de lavar el pellet si se forma un precipitado blanco, ya que esto indica que los sacculi se están agrupando. La agrupación no es catastrófica, pero los grupos se unen muy fuertemente al plástico y la cristalería causando una gran pérdida de muestras. En este caso, proceda con el protocolo utilizando la muestra de sacculi agrupada.
3. En la última etapa de centrifugación/lavado, resuspend las muestras en 900 μl de 10 mM Tris-HCl (pH 7.2) + 0.06% p/v NaCl y transferir a 2 ml tubos previamente pinchados con agujeros en las tapas con una aguja pequeña. Añadir 100 μl de 1 mg/ml activado pronasa E (100 μg/ml de concentración final) a cada muestra e incubar a 60 °C durante 2 horas. Establezca un bloque de calor diferente a 100 °C.
4. Detenga la digestión de la Pronasa E agregando 200 μl de SDS al 6% a cada muestra y hierva las muestras en el bloque de calor de 100 °C durante 30 min. Establecer un bloque de calor diferente a 37 °C y hacer un stock de 1 mg/ml de muramidasa (mutanolisina) en tampón de fosfato de 50 mM (pH 4,9).
5. Al igual que en el paso 3.2, utilice un conjunto de ultracentrífugas a 400.000 × g para hacer girar muestras durante 20 minutos a temperatura ambiente y lavar con agua ultrapura a temperatura ambiente hasta que se elimine completamente sds (normalmente tres lavados). El volumen de resuspensión depende del volumen de los tubos ultracentrífunos utilizados; utilice un volumen que llene los tubos al menos a mitad de camino, pero no exceda el volumen máximo de los tubos.
6. En la última etapa de centrifugación/lavado, resuspend muestras en 200 μl de tampón de fosfato sódico de 50 mM (pH 4,9). Este volumen se puede ajustar de acuerdo con la cantidad de peptidoglicano en la muestra, y puede ser dependiente de la especie. Si existen informes previamente publicados de análisis de HPLC para las especies de interés, este volumen se puede estimar en base a estas cuantificaciones (una compilación de estudios de HPLC PG se puede encontrar en la Información suplementaria de referencia^7). Para otras especies, la preparación del sacculus se puede ejecutar hasta este paso y luego se pueden agregar diferentes cantidades de volúmenes de resuspensión para replicar muestras con el fin de determinar el volumen mínimo que permite que el PG permanezca en solución (ver Discusión para más estimaciones). Si la muestra contiene más peptidoglicano, aumente el volumen de resuspensión; si la muestra tiene poco peptidoglicano, reduzca el volumen de resuspensión a un mínimo de 50 μl.
7. Transferir muestras a tubos de 1,5 ml y añadir 1 mg/ml de muramidasa para dar una concentración final de 40 μg/ml. Incubar 6-8 horas o durante la noche a 37 °C.

4. Día 3 - La preparación de muestras para UPLC se realiza en el último día

1. Encienda un bloque de calor a 100 °C. Hervir las muestras sin SDS durante 5 min para detener la digestión muramidasa. Centrífuga muestras durante 10 min a 16.000 × g a temperatura ambiente, luego transfiera el sobrenadante (los muropeptides ahora son solubles) a tubos de vidrio de 13 mm x 100 mm. Intenta recuperar la mayor cantidad de sobrenadante posible, acercándose mucho al pellet sin molestarlo.
2. Ajuste el pH añadiendo un tampón de borato de 500 mM (pH 9) a la muestra para una concentración final de tampón de borato de 100 mM. El tampón de borato es compatible con el agente reductor borohidruro de sodio. Agregue 1-2 granos de borohidruro de sodio para reducir cada muestra y deje que la reacción continúe durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente. PRECAUCIÓN: El borohidruro de sodio es altamente reactivo y peligroso de manejar: evite el contacto con la piel (use guantes) y evite el contacto con los ojos (use gafas de seguridad).
3. Ajuste las muestras a pH 3-4 (el punto isoeléctrico de muropeptide es ~3.5) con ácido ortofosfórico al 50% v/v usando incrementos de 20 μl hasta pH 6, según lo medido con papel indicador de pH, luego usando incrementos de 2 μl. PRECAUCIÓN: El ácido ortofosfórico es corrosivo y peligroso de manejar: evite el contacto con la piel (use guantes) y evite el contacto con los ojos (use gafas de seguridad). La muestra debe burbujear en respuesta a la adición de ácido ortofosfórico; cuando la muestra deja de burbujear, esto normalmente indica que se ha alcanzado un pH de 6. Si no se produce burbujeo en la muestra, esto puede indicar que la cantidad de borohidruro de sodio añadido era demasiado pequeña. En este caso, deje de bajar el pH, agregue cuidadosamente uno o dos granos de borohidruro de sodio, deje reaccionar durante 5-10 min, luego reanude el ajuste del pH.
4. Filtrar la muestra a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm directamente en un vial uplc. Si se ha formado un precipitado, caliente el tubo con varias pasadas a través de una llama antes de filtrar. Si la muestra no se inyectará en el instrumento UPLC dentro del día, congele a -20 °C durante la noche. Las muestras se pueden almacenar hasta por un año a -80 °C. La muestra se puede descongelar pasando a través de una llama varias veces.
5. Inyecte 10 μl de cada muestra en un instrumento UPLC equipado con una columna de fase invertida C18 de 1,7 μm y un detector de absorbancia configurado para monitorear 202-208 nm. Las muestras se inyectan secuencialmente, pero las capacidades del muestreador automático permiten procesar hasta 96 muestras por lotes. Use 50 mM de fosfato sódico (pH 4,35) + 0,4% v/v de azida de sodio para el disolvente A, y 75 mM de fosfato sódico (pH 4,95) + 15% v/v de metanol para el disolvente B. NOTA: Se añade azida de sodio para compensar la absorción de 205 nm de metanol para evitar la deriva basal. Ajuste el flujo a 0,25 ml/min y utilice un gradiente lineal de más de 25 min para lograr el 100% de disolvente B y la elución secuencial de muropeptides dentro de 30 min. Si la espectrometría de masas se utilizará para caracterizar muropeptides después de UPLC, recoja las fracciones del pico de interés en un colector de la fracción y seque las fracciones usando un evaporador centrífugo.

Resultados

Utilizando el procedimiento descrito en la Figura 1,la muestra final debe consistir en al menos 200 μl de solución transparente que se haya filtrado directamente en un vial de UPLC (paso 4.4). La separación uplc de los diversos muropeptides en una muestra bacteriana se basa en su solubilidad relativa entre la fase móvil líquida y la fase estacionaria de la columna. Las columnas C18 de fase invertida proporcionan una matriz fuertemente hidrofóbica para separar las especies de muropeptide basándose ...

Discusión

Un paso crítico en este procedimiento es el paso 3.1 del segundo día de preparación de la muestra. Si el SDS se ha precipitado durante la noche, o si las muestras se han almacenado en SDS al 4% durante varias semanas a temperatura ambiente, las muestras deben reboiled durante al menos 1 hora para volver a resolver el SDS. Una causa común de precipitación de SDS es el uso de medios con sales de potasio, por lo que el potasio debe evitarse en los medios si es posible. Como se mencionó en la sección resultados repres...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pronase E	Amresco	E629
Mutanolysin from Streptomyces	Sigma-Aldrich	M9901
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma-Aldrich	452882	Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle
Orthophosphoric acid	Sigma-Aldrich	79607	Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle
Boric acid	Sigma-Aldrich	31146
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Sodium azide is a poison
Sodium tetraborate	Sigma-Aldrich	221732
Millex 0.22 μm syringe filters	Fisher	SLGVR04NL
pH strips (pH range 0-6)	Fisher	M95863
50 ml polypropylene Falcon tubes	VWR	21008-951
13 mm x 100 mm glass tubes	Kimble Chase	60CM13
12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial	Waters	186000327C
Sodium Dodecyl Sulfate	Ambion	AM9820	SDS powder is hazardous
Instrumentation
Waters Acquity UPLC H-Class system, including:
Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN
Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager
Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column
Acquity UPLC PDA Detector
Waters Fraction Collector III
Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler