超高性能液体クロマトグラフィーによる組成解析のための細菌細胞壁の分離と調製

要約

細菌細胞壁はペプチドによって架橋された糖鎖の高分子ネットワークであるペプチドグリカンで構成される。超高性能液体クロマトグラフィーは、ペプチドグリカン組成物の新しい発見に高解像度とスループットを提供します。細胞壁(sacculi)の分離とUPLCによる分析のためのその後の準備のための手順を提示する。

要約

細菌細胞壁は、成長および分裂時の細胞形状の決定に重要であり、大きさの複数の雰囲気のターゴール圧力に直面して細胞の機械的完全性を維持する。細菌の王国の多様な形状と大きさにわたって、細胞壁は、短いペプチドによって架橋された糖鎖の高分子ネットワークであるペプチドグリカンで構成されています。細菌生理学におけるペプチドグリカンの中心的な重要性は、抗生物質標的としての使用の根底にあり、成長と分裂の間にどのように強固に組み立てられるかの遺伝的、構造的、細胞生物学的研究を動機づけている。それにもかかわらず、ペプチドグリカン合成における主要な酵素活性と細菌細胞壁の化学組成を完全に特徴付けるためには、依然として広範な調査が必要である。ハイパフォーマンス液体クロマトグラフィー(HPLC)は、様々な環境・遺伝的条件下で増殖する細菌の壁の化学組成の違いを定量化するための強力な分析方法ですが、そのスループットは、多くの場合、制限されています。ここでは、HPLC用6,000 psiと比較して、ポンプを利用して最大15,000 psiの超高圧を供給するHPLCの拡張であるHPLCおよび超高性能液体クロマトグラフィー(UPLC)を介したペプチドグリカンの生物学的分析のための細菌細胞壁の単離および調製のための簡単な手順を提示します。ここで紹介する細菌細胞壁の調製と組み合わせて、少量のサンプルインジェクター、高いサンプリングレート、より小さいサンプル量、およびUPLCの短い実行時間を備えた検出器は、超遠心分離機およびUPLCへのアクセスを持つほとんどの生物学的実験室でのペプチドグリカン組成物および基本的な細菌細胞生物学の新しい発見のための高解像度およびスループットを可能にする。

概要

本明細書に記載されている方法の目的は、無傷の細菌細胞壁(sacculi)を分離し、超高性能液体クロマトグラフィー(UPLC)がムロペプチド成分の同一性とその濃度、グリカン鎖の平均長さ、および鎖間の架橋に関与する材料の割合などの情報を提供するために使用できるようにペプチドグリカン(PG)を消化することです。PG生化学およびムロペプチド種の詳細な議論のために、PG構造および感染、抵抗性、形態形成、および成長におけるその役割を^1〜6に記述するいくつかの優れたレビューがある。PG分析のための高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)は、1980年代にグラナーとシュワルツによって最初に開発され、最近ではミゲル・デ・ペドロとワルデマール・ヴォルマーの研究室で広く強化され、適用されています。これまでの方法では、アミノ酸分析またはペーパークロマトグラフィー、細胞壁成分の正確または完全な評価を得ない時間と退屈な技術を使用しました。

UPLC分析は、超遠心分離機やUPLCにアクセスできる基礎研究所で簡単に実装できます。以下に提示するUPLC法は、完全なサキュリを分離し、その中のすべての化学種に関する包括的かつ定量的な情報を提供する。この方法は、20分UPLCラン内のすべての細菌集団にわたってすべてのムロペプチドの正確な定量化をもたらす。この方法の実装は、材料に多額の財政的投資をすることなく、基本的な実験室のスキルのみを含みます。この方法のステップを実行するためには、研究者はピペット処理、バッファーおよび酵素の調製、およびpHの調整に熟練するだけで、幅広い科学的分野にアクセス可能になります。このプロトコルで使用される酵素の選択は、分析される細菌の種に依存します。ここで説明するプロトコルは 、大腸菌に有用であり、一般的に他のグラム陰性生物からサキュリを単離するのに適していることが分かってきた。グラム陽性菌にこの方法を適用する場合は、文献との相談をお勧めします。これらの種では、伝統的に糖分精製がより困難であった。特に、この方法は、グラム陽性菌のテイコ酸などの厚い壁および補助ポリマーに対応するために、酵素の選択および消化時間の長さの点で変更されなければならない。このプロトコルの最初の酵素は、外膜リポタンパク質(ブラウンのリポタンパク質、またはLppなど)をペプチドグリカンに切断し、それによって細胞壁からLppのC末端ジ(またはトリ)ペプチドを除くすべてを放出する。このステップは腸内細菌を調べるときに必要ですが、他の多くのグラム陰性菌にはLpp相当物がないため、このステップはスキップできます。第2酵素は、ペプチドグリカンのムラミン酸成分の後に特異的に切断し、ムロペプチド種を形成する二糖サブユニットを可溶化する。PGのアーキテクチャの正確な評価を提供するために、クロスブリッジまたはペプチドステムの他の部分の切断を防ぐために、サキュリを消化する際に注意する必要があります。

100種以上の菌種からペプチドグリカンの化学組成をHPLCで分析したが、UPLC技術では分析は行われていない。さらに、以前の研究では、細菌ドメインのごく一部からペプチドグリカンを特徴付けており、一部はHPLCのスループットによって制限されています。したがって、この方法をできるだけ多くの研究者に広め、UPLCプラットフォーム上での実施は、ペプチドグリカンがまだ分類されていない細菌種の大部分の生理学的研究を促進するために重要である。

プロトコル

1. 一晩で2.5 mlの培地で細菌培養を成長させる

バック希釈培養 1:100 から 250 ml の新鮮な培地に、0.7-0.8 の OD₆₀₀ に成長します。6%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の溶液を水中に調製する。

注意:SDS粉末は危険です - SDS粉末を吸入しないでください。鼻と口の上にマスクを着用してください。

2. 1日目 - 細菌培養を一日と一晩にわたって行う

1. 希釈された培養物が成長している間、1 Lビーカーのホットプレートに熱湯浴を設置します。水が沸騰したら、6%SDSのアリコート6mlを50mlポリプロピレンチューブに加え、各チューブに小さな炒め棒を1つ加え、チューブの蓋を指密に固定し、チューブを水浴に入れ、ホットプレートで500rpmに攪拌します。
2. 室温で10分間5,000×gで250ml培養物を収穫し、3mlの培地または1xリン酸緩衝生理食塩水でペレットを再懸濁します。ピペットセルは、6%の沸騰SDSで50mlチューブにゆっくりとピペットセル懸濁液を使用して細胞をライスし(最終濃度4%SDS)、チューブは沸騰水浴中に沈み、蓋を指密に再密閉します。細胞懸濁液は、再懸濁後に沸騰SDSに素早く移す必要があります。突然の環境変化は、細胞壁構造の誤った変化を引き起こす可能性がありますので、避けるべきです。
3. 沸騰水浴を覆い、細胞が3時間沸騰させ、定期的に水位をチェックし、必要に応じて水浴を補充します。3時間後、ホットプレートの発熱体をオフにし、500rpmで一晩撹拌し続ける。

3. 2日目 - 酵素消化は1日の間に行われます

1. SDSが一晩50mlチューブに沈殿した場合は、水浴を1〜2時間沸騰させます。ヒートブロックを60°Cに切り上げる。 10 mM Tris-HCl (pH 7.2) + 0.06% w/v NaClでプロナーゼEの1mg/mlストックを準備し、少なくとも30分間60°CでプロナーゼEを活性化します。
2. 400,000×gに設定された超遠心分離機を使用して、大きなPGポリマーをペレット化し、他の細胞成分から精製するために、室温で20分間サンプルを回転させます。上清を慎重に取り出し、室温超純水中の各ペレットを再懸濁します。注:再懸濁液の量は、使用される超遠心チューブの体積に依存します。チューブを少なくとも半分の方法で満たすが、チューブの最大体積を超えないボリュームを使用してください。再懸濁中に水が気泡を形成しなくなるまで遠心分離/洗浄を繰り返し、SDSが完全に除去されたことを示します(通常は3回の洗浄)。白色の沈殿物が形成された場合はペレットの洗浄を中止し、これは、サキュリが一緒に凝集していることを示している。凝集は壊滅的ではありませんが、塊はプラスチックやガラス製品に非常に強く結合し、大きなサンプル損失を引き起こします。この場合、束状のサキュリサンプルを用いてプロトコルを進める。
3. 最後の遠心分離/洗浄ステップで、サンプルを10 mM Tris-HCl(pH 7.2)+0.06%w/v NaClの900 μlで再中断し、以前に小さな針で上部に穴を開けて突いた2mlチューブに移します。各サンプルに1mg/ml活性化プロナーゼE(100μg/ml最終濃度)の100 μlを加え、60°Cで2時間インキュベートします。別のヒートブロックを100°Cに設定します。
4. プロナーゼEの消化を各サンプルに200 μlの6%SDSを加えて、100°Cのヒートブロックで30分間沸騰させます。異なるヒートブロックを37°Cに設定し、50 mMリン酸緩衝液(pH 4.9)に1mg/mlのムラミドーゼ(ムタノリシン)ストックを作ります。
5. ステップ3.2のように、400,000×gに設定された超遠心分離機を使用して、室温で20分間サンプルを回転させ、SDSが完全に除去されるまで室温の超純水で洗浄します(通常は3回の洗浄)。リサスペンションの体積は、使用される超遠心管の体積に依存します。チューブを少なくとも半分の方法で満たすが、チューブの最大体積を超えないボリュームを使用してください。
6. 最後の遠心分離/洗浄ステップで、サンプルを50 mMリン酸ナトリウムバッファー(pH 4.9)の200 μlで再中断します。この体積は、試料中のペプチドグリカンの量に応じて調整することができ、種依存であってもよい。対象となる種のHPLC分析に関する報告が以前に公表されている場合、この量は、これらの定量に基づいて推定することができます(HPLC PG研究のコンパイルは、参照⁷の補足情報で見つけることができます)。他の種の場合、このステップまでサキュラスの準備を実行することができ、PGが溶液にとどまることを可能にする最小量を決定するために、サンプルを複製するために異なる量の再懸濁液量を追加することができます(さらなる推定値については、議論を参照)。サンプルにペプチドグリカンが多く含まれている場合は、再懸濁液の体積を増やします。サンプルにペプチドグリカンがほとんどない場合は、再懸濁液の体積を最低50 μlに減らします。
7. サンプルを1.5mlチューブに移し、1mg/mlのムラミデを加え、最終濃度40μg/mlを与えます。6-8時間または37°Cで一晩インキュベートする。

4. 3日目 - UPLCのサンプルの準備は最終日に行われます

1. ヒートブロックを100°Cに切り上げる。 SDSを使用せずにサンプルを5分間煮て、ムラミドーゼの消化を止めます。遠心分離機サンプルを室温で16,000×gで10分間、上清(ムロペプチドは現在溶けやすい)を13mm x 100mmのガラス管に移します。できるだけ多くの上清を回復してみてください, それを乱すことなく、ペレットに非常に近づく.
2. 500 mM ホウ酸塩バッファー (pH 9) をサンプルに加えて、最終濃度の 100 mM のホウ酸塩バッファーを調整します。ホウ酸塩緩衝液は、還元剤のホウ水素化ナトリウムと相性がある。1~2粒のホウ水素化ナトリウムを加えて各試料を減らし、室温で少なくとも30分間反応を進めます。注意:水素化水素ナトリウムは非常に反応性が高く、取り扱いに危険です - 皮膚との接触を避け(手袋を着用)、目との接触を避けてください(安全眼鏡を着用)。
3. pHインジケーター用紙で測定したpH 6まで20μlの増分を使用して50%v/vオルトリン酸を用いてpH 3-4(ムロペプチド等電点は〜3.5)にサンプルを調整し、2 μlインクリメントを使用します。注意:オルソリン酸は腐食性であり、扱いに危険です - 皮膚との接触を避け(手袋を着用)、目との接触を避けてください(安全眼鏡を着用)。サンプルは、オルトリン酸の添加に応答して気泡する必要があります。サンプルがバブリングを停止すると、通常は pH 6 に達したことを示します。試料中にバブリングが起こらない場合、これは、添加されたホウ化水素ナトリウムの量が少なすぎることを示している可能性がある。この場合、pHの低下を止め、1粒または2粒のホウ化水素ナトリウムを慎重に加え、5〜10分間反応させてから、pH調整を再開する。
4. 0.22 μmのシリンジフィルターを通して、サンプルをUPLCバイアルに直接フィルターします。沈殿物が形成された場合は、濾過する前に炎を通していくつかのパスでチューブを加熱します。サンプルが一日以内にUPLC装置に注入されない場合は、一晩で-20°Cで凍結してください。サンプルは-80 °Cで1年間まで保存することができます。 試料は、炎を数回通過させることによって解凍することができます。
5. 各サンプルの10 μlを、C18 1.7 μm反転相カラムと202-208 nmを監視するように設定された吸光度検出器を備えたUPLC機器に注入します。サンプルは順次注入されますが、オートサンプラー機能を使用すると、最大 96 個のサンプルをバッチで処理できます。50 mM リン酸ナトリウム (pH 4.35) + 0.4% v/v 溶媒のアジドナトリウム、75 mM リン酸ナトリウム (pH 4.95) + 15% v/v メタノールを溶媒 B.流れを0.25 ml/minに設定し、25分以上の線形勾配を使用して、100%の溶媒Bと30分以内のムロペプチドの順次溶出を達成します。UPLC後のムロペプチドを特徴付けるために質量分析を使用する場合は、分画集電体で目的のピークの分画を収集し、遠心エバポレーターを使用して分画を乾燥させます。

結果

図1に示す手順を使用して、最終的なサンプルは、UPLCバイアルに直接フィルタリングされた少なくとも200 μlのクリアソリューションで構成されている必要があります(ステップ4.4)。細菌サンプル中の様々なムロペプチドのUPLC分離は、液体移動相とカラムの静止相との間の相対的な溶解性に依存する。逆相C18カラムは、疎水性およびサイズ⁸に基づいてムロペプチド種を分?...

ディスカッション

この手順の重要なステップは、サンプル調製の2日目のステップ3.1です。SDSが一晩沈殿した場合、またはサンプルが室温で数週間4%のSDSに保存されている場合、サンプルを再溶解させるために少なくとも1時間再沸騰させる必要があります。SDS沈殿の一般的な原因はカリウム塩を含む培地の使用であるため、可能であればカリウムは培地で避けるべきです。代表結果セクションで述べたように、...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pronase E	Amresco	E629
Mutanolysin from Streptomyces	Sigma-Aldrich	M9901
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma-Aldrich	452882	Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle
Orthophosphoric acid	Sigma-Aldrich	79607	Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle
Boric acid	Sigma-Aldrich	31146
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Sodium azide is a poison
Sodium tetraborate	Sigma-Aldrich	221732
Millex 0.22 μm syringe filters	Fisher	SLGVR04NL
pH strips (pH range 0-6)	Fisher	M95863
50 ml polypropylene Falcon tubes	VWR	21008-951
13 mm x 100 mm glass tubes	Kimble Chase	60CM13
12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial	Waters	186000327C
Sodium Dodecyl Sulfate	Ambion	AM9820	SDS powder is hazardous
Instrumentation
Waters Acquity UPLC H-Class system, including:
Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN
Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager
Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column
Acquity UPLC PDA Detector
Waters Fraction Collector III
Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler