Isolement et préparation de parois cellulaires bactériennes pour l’analyse de composition par chromatographie liquide ultra-performante

Résumé

La paroi cellulaire bactérienne est composée de peptidoglycane, un réseau macromoléculaire de brins de sucre réticulés par des peptides. La chromatographie liquide ultra-performante offre une résolution et un débit élevés pour de nouvelles découvertes de composition de peptidoglycane. Nous présentons un procédé pour l’isolement des murs de cellules (sacculi) et leur préparation suivante pour l’analyse par l’intermédiaire d’UPLC.

Résumé

La paroi cellulaire bactérienne est essentielle pour la détermination de la forme cellulaire pendant la croissance et la division, et maintient l’intégrité mécanique des cellules face aux pressions de la turgescence de plusieurs atmosphères en magnitude. À travers les différentes formes et tailles du règne bactérien, la paroi cellulaire est composée de peptidoglycane, un réseau macromoléculaire de brins de sucre réticulés par de courts peptides. L’importance centrale du peptidoglycane pour la physiologie bactérienne sous-tend son utilisation en tant que cible antibiotique et a motivé des études génétiques, structurelles et biologiques cellulaires sur la façon dont il est solidement assemblé pendant la croissance et la division. Néanmoins, des investigations approfondies sont encore nécessaires pour caractériser pleinement les activités enzymatiques clés dans la synthèse du peptidoglycane et la composition chimique des parois cellulaires bactériennes. La chromatographie liquide à haute performance (CLHP) est une méthode d’analyse puissante pour quantifier les différences dans la composition chimique des parois des bactéries cultivées dans diverses conditions environnementales et génétiques, mais son débit est souvent limité. Ici, nous présentons une procédure simple pour l’isolement et la préparation des parois cellulaires bactériennes pour les analyses biologiques du peptidoglycane via HPLC et ultra performance chromatographie liquide (UPLC), une extension de HPLC qui utilise des pompes pour fournir des pressions ultra-élevées allant jusqu’à 15 000 psi, par rapport à 6 000 psi pour HPLC. En combinaison avec la préparation des parois cellulaires bactériennes présentée ici, les injecteurs d’échantillons à faible volume, les détecteurs avec des taux d’échantillonnage élevés, des volumes d’échantillons plus petits et des temps d’exécution plus courts de l’UPLC permettront une résolution et un débit élevés pour de nouvelles découvertes de composition de peptidoglycane et de biologie cellulaire bactérienne fondamentale dans la plupart des laboratoires biologiques ayant accès à une ultracentrifuge et à un UPLC.

Introduction

Le but de la méthode décrite ici est d’isoler les parois cellulaires bactériennes intactes (sacculi) et de digérer le peptidoglycane (PG) de telle sorte que la chromatographie liquide ultra-performante (UPLC) peut être utilisée pour fournir des informations telles que l’identité des composants muropeptides et leurs concentrations, la longueur moyenne des brins de glycane, et la fraction de matériau impliquée dans les réticulations entre les brins. Pour une discussion détaillée de la biochimie PG et des espèces de muropeptides, il existe plusieurs excellentes revues qui décrivent la structure de PG et son rôle dans l’infection, la résistance, la morphogenèse et la croissance^1-6. La chromatographie liquide haute performance (HPLC) pour l’analyse PG a été initialement développée par Glauner et Schwarz dans les années 1980, et plus récemment a été améliorée et largement appliquée dans les laboratoires de Miguel de Pedro et Waldemar Vollmer. Les méthodes précédentes utilisaient l’analyse d’acides aminés ou la chromatographie sur papier, des techniques fastidieuses et fastidieuses qui ne donnent pas d’évaluations précises ou complètes des composants de la paroi cellulaire.

L’analyse UPLC peut être facilement mise en œuvre dans n’importe quel laboratoire de recherche fondamentale ayant accès à un ultracentrifuge et à un UPLC. La méthode UPLC que nous présentons ci-dessous isole des sacculi complets, fournissant ainsi des informations quantitatives complètes sur toutes les espèces chimiques qui s’y trouvent. Cette méthode donne une quantification précise de tous les muropeptides à travers une population de bactéries, le tout dans un run UPLC de 20 minutes. La mise en œuvre de cette méthode n’implique que des compétences de laboratoire de base, sans investissement financier important dans les matériaux. Pour exécuter les étapes de cette méthode, les chercheurs n’ont qu’à être qualifiés pour pipetter, préparer des tampons et des enzymes et ajuster le pH, le rendant accessible à un large éventail de disciplines scientifiques. Le choix des enzymes utilisées dans ce protocole dépend de l’espèce de bactérie analysée; le protocole décrit ici est utile pour Escherichia coli,et s’est généralement avéré adéquat pour isoler des sacculi d’autres organizations Gram négatif. Il est recommandé de consulter la littérature lors de l’application de cette méthode aux bactéries à Gram positif; chez ces espèces, la purification du sacculus a traditionnellement été plus difficile. En particulier, cette méthode peut devoir être modifiée en termes de choix d’enzymes et de durée de digestion pour s’adapter aux parois plus épaisses et aux polymères accessoires tels que les acides téichoïques des bactéries à Gram positif. La première enzyme de ce protocole fend la lipoprotéine membranaire externe (telle que la lipoprotéine de Braun, ou Lpp) attachement au peptidoglycane, libérant ainsi tout sauf le peptide di- (ou tri-) C-terminal du Lpp de la paroi cellulaire. Cette étape est nécessaire lors de l’examen des entérobactéries, mais de nombreuses autres bactéries à Gram négatif n’ont pas d’équivalents Lpp, et donc cette étape peut être ignorée. Une deuxième enzyme se fend spécifiquement après le composant acide muramique du peptidoglycane, solubilisant la sous-unité disaccharide qui forme l’espèce muropeptide. Pour fournir une évaluation précise de l’architecture du PG, des précautions doivent être prises en digérant les sacculi pour empêcher le clivage des ponts croisés ou de toute autre partie de la tige peptidique.

Bien que les compositions chimiques du peptidoglycane provenant de plus de 100 souches d’environ 40 espèces bactériennes aient été analysées par HPLC, aucune analyse n’a été effectuée avec la technologie UPLC. En outre, des travaux antérieurs ont caractérisé le peptidoglycane à partir d’une petite fraction du domaine bactérien, en partie limitée par le débit de HPLC. Par conséquent, la diffusion de cette méthode au plus grand nombre de chercheurs possible, et sa mise en œuvre sur les plateformes UPLC, seront essentielles pour conduire des études physiologiques de la grande fraction d’espèces bactériennes dont le peptidoglycane n’a pas encore été catégorisé.

Protocole

1. Cultiver des cultures bactériennes dans 2,5 ml de milieux pendant la nuit

Cultures diluer 1:100 dans 250 ml de milieux frais et atteindre₆₀₀ DO de 0,7-0,8. Préparer une solution de dodécyl sulfate de sodium (FDS) à 6% dans l’eau.

ATTENTION: La poudre de FDS est dangereuse - évitez d’inhaler de la poudre de FDS; porter un masque sur le nez et la bouche.

2. Jour 1 - Les cultures bactériennes lysantes sont effectuées au cours d’une journée et pendant la nuit

1. Pendant que les cultures diluées se développent, placez un bain d’eau bouillante sur une plaque chauffante dans un bécher de 1 L. Une fois l’eau bouillante, aliquote 6 ml de FDS à 6% dans des tubes en polypropylène de 50 ml, ajouter une petite barre d’agitation à chaque tube, fixer les couvercles du tube à bout de doigts, placer les tubes au bain-marie et activer l’agitation à 500 tr / min sur la plaque chauffante.
2. Récolter les cultures de 250 ml à 5 000 × g pendant 10 min à température ambiante et ressusciter les granulés dans 3 ml de milieu ou 1x saline tamponnée au phosphate. Pipeter lentement les suspensions cellulaires dans des tubes de 50 ml avec une FDS bouillante à 6% pour lyser les cellules (concentration finale 4% SDS) pendant que les tubes sont immergés dans le bain d’eau bouillante, et refermer les couvercles à doigts serrés. Les suspensions cellulaires doivent être rapidement transférées dans une FDS bouillante une fois remises en suspension. Les changements environnementaux brusques doivent être évités, car cela pourrait entraîner une altération erronée de la structure de la paroicellulaire.
3. Couvrez le bain d’eau bouillante et laissez les cellules bouillir pendant 3 heures, en vérifiant périodiquement le niveau d’eau et en remplissant le bain-marie si nécessaire. Après 3 heures, éteignez l’élément chauffant de la plaque chauffante et continuez à remuer pendant la nuit à 500 tr / min.

3. Jour 2 - Les digestions enzymatiques sont effectuées au cours d’une journée

1. Si la FDS a précipité dans les tubes de 50 ml pendant la nuit, régler le bain d’eau pour qu’il bout pendant 1 à 2 heures supplémentaires. Allumez un bloc chauffant à 60 °C. Préparer un stock de 1 mg/ml de Pronase E dans 10 mM de Tris-HCl (pH 7,2) + 0,06 % p/v de NaCl et activer la Pronase E à 60 °C pendant au moins 30 min.
2. Utilisez un ultracentrifuge réglé à 400 000 × g pour faire tourner des échantillons pendant 20 min à température ambiante afin de granuler les grands polymères PG et ainsi les purifier d’autres composants cellulaires. Retirez soigneusement le surnageant, puis ressuscitez chaque pastille dans de l’eau ultrapure à température ambiante. NOTA : Le volume de remise en suspension dépend du volume des tubes ultracentrifugés utilisés; utiliser un volume qui remplit les tubes au moins à mi-chemin, mais ne dépasse pas le volume maximal des tubes. Répéter la centrifugation/lavage jusqu’à ce que l’eau ne forme pas de bulles pendant la remise en suspension, ce qui indique que la FDS a été complètement enlevée (généralement trois lavages). Arrêtez de laver le culot si un précipité blanc se forme, car cela indique que les sacculi s’agglutinent. L’agglutination n’est pas catastrophique, mais les touffes se lient très fortement au plastique et à la verrerie, ce qui entraîne une perte importante d’échantillons. Dans ce cas, procédez au protocole à l’aide de l’échantillon de sacculi agglutiné.
3. Lors de la dernière étape de centrifugation/lavage, ressusciter les échantillons dans 900 μl de Tris-HCl 10 mM (pH 7,2) + 0,06 % p/v naCl et les transférer dans des tubes de 2 ml préalablement percés de trous dans les sommets avec une petite aiguille. Ajouter 100 μl de 1 mg/ml de Pronase E activée (concentration finale de 100 μg/ml) à chaque échantillon et incuber à 60 °C pendant 2 h. Réglez un bloc thermique différent à 100 °C.
4. Arrêtez la digestion de la Pronase E en ajoutant 200 μl de FDS à 6% à chaque échantillon et faites bouillir les échantillons dans le bloc thermique à 100 °C pendant 30 min. Régler un bloc thermique différent à 37 °C et faire un stock de muramidase (mutanolysine) de 1 mg/ml dans un tampon phosphate de 50 mM (pH 4,9).
5. Comme à l’étape 3.2, utiliser une ultracentrifugation fixée à 400 000 × g pour faire tourner les échantillons pendant 20 min à température ambiante et laver à l’eau ultrapure à température ambiante jusqu’à ce que la FDS soit complètement retirée (généralement trois lavages). Le volume de remise en suspension dépend du volume des tubes ultracentrifugés utilisés; utiliser un volume qui remplit les tubes au moins à mi-chemin, mais ne dépasse pas le volume maximal des tubes.
6. Lors de la dernière étape de centrifugation/lavage, remise en suspension des échantillons dans 200 μl de tampon phosphate de sodium de 50 mM (pH 4,9). Ce volume peut être ajusté en fonction de la quantité de peptidoglycane dans l’échantillon et peut dépendre de l’espèce. S’il existe des rapports d’analyse HPLC déjà publiés pour les espèces d’intérêt, ce volume peut être estimé en fonction de ces quantifications (une compilation des études HPLC PG peut être trouvée dans les informations supplémentaires de la référence⁷). Pour d’autres espèces, la préparation du sacculus peut être exécutée jusqu’à cette étape, puis différentes quantités de volumes de remise en suspension peuvent être ajoutées pour reproduire les échantillons afin de déterminer le volume minimal qui permet au PG de rester en solution (voir Discussion pour d’autres estimations). Si l’échantillon contient plus de peptidoglycane, augmentez le volume de remise en suspension; si l’échantillon contient peu de peptidoglycane, réduire le volume de remise en suspension à un minimum de 50 μl.
7. Transférer les échantillons dans des tubes de 1,5 ml et ajouter 1 mg/ml de muramidase pour obtenir une concentration finale de 40 μg/ml. Incuber 6-8 heures ou pendant la nuit à 37 °C.

4. Jour 3 - La préparation des échantillons pour UPLC est effectuée le dernier jour

1. Allumez un bloc chauffant à 100 °C. Faire bouillir les échantillons sans FDS pendant 5 min pour arrêter la digestion de la muramidase. Échantillons de centrifugeuses pendant 10 min à 16 000 × g à température ambiante, puis transférer le surnageant (les muropeptides sont maintenant solubles) dans des tubes de verre de 13 mm x 100 mm. Essayez de récupérer autant de surnageant que possible, en vous rapprochant très près de la pastille sans la déranger.
2. Ajuster le pH en ajoutant un tampon de borate de 500 mM (pH 9) à l’échantillon pour une concentration finale de tampon de borate de 100 mM. Le tampon borate est compatible avec l’agent réducteur borohydrure de sodium. Ajouter 1-2 grains de borohydrure de sodium pour réduire chaque échantillon et laisser la réaction se poursuivre pendant au moins 30 min à température ambiante. ATTENTION: Le borohydrure de sodium est très réactif et dangereux à manipuler - évitez tout contact avec la peau (portez des gants) et évitez tout contact avec les yeux (portez des lunettes de sécurité).
3. Ajuster les échantillons à un pH de 3-4 (le point isoélectrique du muropeptide est d’environ 3,5) avec de l’acide orthophosphorique à 50 % v/v en utilisant des incréments de 20 μl jusqu’à pH 6, mesurés avec du papier indicateur de pH, puis en utilisant des incréments de 2 μl. ATTENTION: L’acide orthophosphorique est corrosif et dangereux à manipuler - évitez tout contact avec la peau (portez des gants) et évitez tout contact avec les yeux (portez des lunettes de sécurité). L’échantillon doit bouillonner en réponse à l’ajout d’acide orthophosphorique; lorsque l’échantillon cesse de bouillonner, cela indique généralement qu’un pH de 6 a été atteint. Si aucun bouillonnement ne se produit dans l’échantillon, cela peut indiquer que la quantité de borohydrure de sodium ajoutée était trop faible. Dans ce cas, arrêtez d’abaisser le pH, ajoutez soigneusement un ou deux grains de borohydrure de sodium, laissez réagir pendant 5-10 min, puis reprenez l’ajustement du pH.
4. Filtrer l’échantillon à travers un filtre à seringue de 0,22 μm directement dans un flacon UPLC. Si un précipité s’est formé, chauffer le tube avec plusieurs passages à travers une flamme avant de filtrer. Si l’échantillon ne doit pas être injecté dans l’instrument UPLC dans la journée, congeler à -20 °C pendant la nuit. Les échantillons peuvent être conservés jusqu’à un an à -80 °C. L’échantillon peut être décongelé en passant plusieurs fois à travers une flamme.
5. Injecter 10 μl de chaque échantillon sur un instrument UPLC équipé d’une colonne en phase inversée C18 de 1,7 μm et d’un détecteur d’absorbance réglé pour surveiller 202-208 nm. Les échantillons sont injectés séquentiellement, mais les capacités d’échantillonnage automatique permettent de traiter jusqu’à 96 échantillons par lots. Utiliser du phosphate de sodium à 50 mM (pH 4,35) + 0,4 % v/v d’azoture de sodium pour le solvant A, et du phosphate de sodium à 75 mM (pH 4,95) + 15 % v/v de méthanol pour le solvant B. REMARQUE : De l’azoture de sodium est ajouté pour compenser l’absorption de 205 nm du méthanol afin d’éviter la dérive de base. Réglez le débit à 0,25 ml/min et utilisez un gradient linéaire sur 25 min pour obtenir 100% de solvant B et une élution séquentielle des muropeptides dans les 30 min. Si la spectrométrie de masse est utilisée pour caractériser les muropeptides après UPLC, recueillir des fractions du pic d’intérêt dans un collecteur de fractions et sécher les fractions à l’aide d’un évaporateur centrifuge.

Résultats

Selon la procédure décrite à la figure 1,l’échantillon final devrait être constitué d’au moins 200 μl de solution claire qui a été filtrée directement dans un flacon UPLC (étape 4.4). La séparation UPLC des différents muropeptides dans un échantillon bactérien repose sur leur solubilité relative entre la phase mobile liquide et la phase stationnaire de la colonne. Les colonnes C18 en phase inversée fournissent une matrice fortement hydrophobe pour séparer les espèces de muropeptide...

Discussion

Une étape critique de cette procédure est l’étape 3.1 du deuxième jour de préparation de l’échantillon. Si la FDS a précipité pendant la nuit, ou si les échantillons ont été stockés dans une FDS à 4 % pendant plusieurs semaines à température ambiante, les échantillons doivent être rediffusés pendant au moins 1 heure pour dissoudre la FDS. Une cause fréquente de précipitation de la FDS est l’utilisation de milieux avec des sels de potassium, de sorte que le potassium doit être évité dans les m...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pronase E	Amresco	E629
Mutanolysin from Streptomyces	Sigma-Aldrich	M9901
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma-Aldrich	452882	Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle
Orthophosphoric acid	Sigma-Aldrich	79607	Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle
Boric acid	Sigma-Aldrich	31146
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Sodium azide is a poison
Sodium tetraborate	Sigma-Aldrich	221732
Millex 0.22 μm syringe filters	Fisher	SLGVR04NL
pH strips (pH range 0-6)	Fisher	M95863
50 ml polypropylene Falcon tubes	VWR	21008-951
13 mm x 100 mm glass tubes	Kimble Chase	60CM13
12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial	Waters	186000327C
Sodium Dodecyl Sulfate	Ambion	AM9820	SDS powder is hazardous
Instrumentation
Waters Acquity UPLC H-Class system, including:
Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN
Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager
Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column
Acquity UPLC PDA Detector
Waters Fraction Collector III
Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler